实验1 愈伤组织的诱导

实验1 愈伤组织的诱导

1、实验目的

（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；

（2）了解接种的无菌操作技术；

（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。

2、实验原理

植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。

3、实验仪器和试剂

仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。

无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。

植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。

试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。

培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8

4、实验步骤

（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。

（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。

（3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。

（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。

（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。

（6）接种：在酒精灯焰附近处，用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每皿放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。将培养皿口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。

（7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。

5、结果记录与分析

（1）接种1周-10天后，调查、计算污染率：

污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100%

（2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率：

诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100%

6、思考题

（1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。

（2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？

实验二真菌菌丝DNA提取

1实验目的

学习利用CTAB法少量提取真菌菌丝体DNA，同时掌握在DNA提取中各

种试剂的作用和操作的目的。

2 实验步骤

1）真菌的培养

把真菌接种在在PDA上平板上，25℃条件下培养7-10天。

2）DNA的提取

（1）研磨。用牙签挑取菌丝放入灭菌的1.5mL离心管中（1/4体积），加500μL 2 CTAB提取液(100mmo1/L Tris-HCl pH 8.0，1.4mo1/L NaCl，20mmo1/L EDTA，2% CTAB, 0.1%-2%β-巯基乙醇)，用研磨棒研磨。

（2）水浴。将混合液放入65℃水浴lhr。

（3）抽提。加入等体积的氯仿/Tris-饱和酚(1:1)混合液，12,000r/min离心l0min，取上清液放入另一个灭菌的1.5 mL离心管中。

（4）再提。在上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)混合液，12,000r/min 离心l 0min，取上清液放入另一个灭菌的1.5 mL离心管中。

（5）沉淀。于上清液中加3mo1/L醋酸钠40μL，再1mL无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱中沉淀30min或过夜，12,000r/min离心l 0min，弃上清液，收集沉淀。

（6）洗涤。再加入300μL的70%乙醇清洗沉淀，12,000r/min离心5min，弃上清液(防止倒流)，收集沉淀，置37℃的恒温箱中干燥10min。

（7）溶解。在干燥后的离心管中加入10μL TE，电泳检测。

（8）保存。将通过电泳检测的总DNA放入-20 ℃冰箱中保存备用。

3 结果分析

实验四 PCR产物的克隆

1 实验目的

1）初步掌握感受态细胞的制备；

2）初步掌握PCR产物与T-载体的连接；

3）初步掌握连接产物的转化过程。

2 实验材料

.

1）试剂：麦康凯培养基，LB液体培养基，amp,100mM CaCl

2

2) 材料：灭菌1.5ML 离心管，TIP头，涂布器，灭菌培养皿

3）载体和菌种：pMD19-T，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α。

3实验方法

1）PCR产物的连接

纯化的PCR产物用T4 DNA连接酶连接到pMD19-T上，其反应体系如下：

PCR回收纯化产物 4.5μl(10ng.μl-1)

pMD19-T载体 0.5μl(50ng.μl-1)

Solution I 5μl

Total 10μl

16℃反应1小时。

2）感受态细胞的制备（小量制备方法）

(1)将-70℃冻存的大肠杆菌菌株DH5α于LB固体平板上画线， 37℃过夜培养。

(2)挑取单菌落放入10ml LB液体培养基中，220rpm，37℃培养16hr左右。

(3)按1:100的比例，将上述培养的菌液转入20ml LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至

0.3-0.6。

OD

600

(4)将培养的菌液转入1.5ML离心管中，冰中冰浴30min。

(5)5000rpm，4℃离心5min，移除上清液，将沉淀放于冰上。

。

(6)沉淀重悬于1ml 预冷的0.1M CaCl

２

(7)置于冰上10min。

(8)5000rpm，4℃离心5min，弃上清。

，冰上放置10-30min。

(9)沉淀重悬于100μl冰浴的0.1M CaCl

2

(10)通过转化已知质粒检查制备感受态的质量（本实验不做）。

3) 重组质粒的转化

(1)取10μl连接产物加入到制备的感受态细胞，轻轻混合均匀，冰浴30min。

(2)42℃热击2min，立即放置于冰上冷却1min，室温放置几分钟。

(3)每管加入800μl LB液体培养基，37℃ 220rpm震荡45min。

(4)5000rpm离心5min，吸弃800μl上清，剩余100μl上清悬浮沉淀。

(5)取悬浮液，涂布于含Amp(60μg.ml-1)麦康凯培养基平板上，37℃倒置培养14-16hr,观察转化结果。

4 结果与分析：

观察并分析实验结果。

PCR链式反应

在0.2ml Eppendorf管内配制25μl反应体系

ddH2O 15 μl

10x PCR buffer 2.5 μ l

dNTPs（2.5mM） 2 μ l

引物p1 (5μM) 2 μ l

引物p2 (5μM) 2 μ l

模板DNA 1 μ l

Taq 酶：0.5 μ l

Total 25 μ l