植物微卫星引物开发方法_郭大龙
植物微卫星引物开发方法
郭大龙 (河南科技大学林学院,河南洛阳471003)
摘要 综述了开发植物微卫星引物的几种方法:搜寻核酸数据库和寻找已存在的微卫星引物;不同物种间共用;建立基因组文库;利用分子标记技术发展S SR引物。此外,还比较了几种方法的优缺点。
关键词 微卫星;引物;开发;植物
中图分类号 S127 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)18-05361-03
Developm ent of the Micro satellite Prim er in Pla nt
GU O Da-long (College of Forestry,Henan University of Science and Techn ology,Luoyan g,Henan471003)
A bstract In this paper s everal methods of developing microsatellite primers in plants were su m marized:①to search the Database and find th e primers which were delivered;②to transfer them among the differen t s pecies;③to establis h gen omic library;④to d evelop SSR pri mer based on moleculars mark-ers.Furthermore,the ad vantages an d disadvantages of t he d ifferent methods were comp ared.
Key w ords Microsatellite;Prim er;Develop ment;Plan t
微卫星(Micr osa tellite,又叫Simple Seque nc e R epeat,SSR)以1～6bp的短核苷酸为基本单位,呈串联重复状广布于生物体整个基因组,具有分布广泛、多态性丰富、易于检测、进化所受选择压小、信息量大、以孟德尔方式分离、共显性遗传等特点。在遗传多样性检测、种质鉴定及系谱分析、遗传连锁图谱构建、基因定位与标记辅助育种等领域中得到广泛应用。微卫星标记检测的位点多态性水平明显高于R FL P标记,而且重复性优于R APD,与AFLP相比,不同的材料结果略有不同[1]。随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势[2]。但微卫星分析中引物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费[3]。因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。何平[4]、唐荣华等[5]、Za ne等[6]对微卫星引物的开发方法作了一些综述。笔者就微卫星引物开发及其最新进展进行了系统总结,并对这些方法的优劣加以比较。
1 搜寻核酸数据库和寻找已存在的微卫星引物
从公用的D NA序列数据库(Ge nBa nk EMBL和DD BJ等)或从已发表的文章中查找所研究物种的微卫星DN A两翼序列和引物,在时间和费用上无疑都是最经济的[7]。从数据库查询的方法已成功地用于许多物种,例如大豆[8]、玉米[9]、水稻[10]的微卫星标记。Ka ntety等[11]分析了大麦、玉米、水稻、高粱和小麦核酸数据库中的序列,对发展微卫星引物的可能性进行了分析。Ga o等[12]从小麦EST中分离出101个新的微卫星引物。但是对大部分物种而言,已知序列信息远不能满足微卫星引物设计的需要。随着大规模测序和EST计划的进行,cD NA和其他的序列信息会不断地注册到数据库中,可以获得的微卫星位点的数目会越来越多。
从发表的文献中搜索已经开发出的微卫星引物,也是个便捷方法。在《Molec ular Ec olog y Notes》和《Conserva tion ge net-ic s》上还刊登有不同的物种中新发现的微卫星引物。
2 不同物种间共用
微卫星侧翼序列在相近物种中具有一定的保守性,因而
基金项目 河南科技大学人才科学研究基金。
作者简介 郭大龙(1978-),男,湖北十堰人,博士,副教授,从事种质资源和生物技术研究。
收稿日期 2007-03-03某一物种的微卫星引物可以在其相近的物种中使用,这样就大大地减少了检测微卫星位点的工作量。微卫星在近缘种之间的通用性已有研究,但在属间应用还不多。目前已知大豆[8]、水稻[13]、葡萄[14]等类群发展的专一的微卫星引物可在近缘种之间使用,同样在柑橘属[15]、芸薹属[16]以及猕猴桃属[17]的不同种之间可以共享某些引物。Cipria ni等[18]从桃中开发的引物,能在桃属的栽培桃、罐藏桃中扩增出多态性片段,在近缘种如日本李、欧洲李、杏、甜樱桃和酸樱桃上也可得到扩增片段。油橄榄中开发的微卫星引物在木樨科中的不同属中得到成功地扩增[19]。苹果中分离的微卫星引物在梨的遗传多样性分析中得到成功地应用[20]。Gao等[21]统计了水稻、小麦、大豆和玉米序列中的微卫星的类型和频率,从小麦中开发的引物有近一半在水稻、玉米和大豆中得到了成功扩增。周涵滔等[22]利用从甘蓝型油菜中获得的2个微卫星引物对来自禾本科、十字花科、芸香科、锦葵科等12种经济作物的DN A进行PCR扩增,结果12份材料中所扩增出的主带大小一致。总之,引物跨物种共用的有效程度可能与其亲缘关系的远近有关,但要确定微卫星引物在不同类群广泛应用的标准是困难的,目前对此尚无定论。
3 建立基因组文库
建立基因组文库是开发微卫星引物中采用最多的方法,技术路线成熟。基本步骤如下:①提取基因组D N A;②用限制性内切酶将基因组D NA切割成均匀的小片段,或者用超声波对基因组D NA进行断裂;③凝胶电泳,回收大小300～500bp的片段;④将回收片段克隆,使用标记探针进行杂交;
⑤筛选出含有重复序列的克隆;⑥测序证实重复序列片段的存在;⑦在重复序列片段两端区域设计引物对,进行PCR扩增,检验引物的有效性;⑧对小量样本进行预试验,挑选出重复性好,具多态性的微卫星位点。大多数的微卫星位点是用寡聚核苷酸探针从基因组文库中分离出来的。
从基因组文库中分离微卫星位点的传统方法在微卫星富集程度上效率很低,已经设计了很多方法用来提高效率,具体见Zane等[6]和Sdquirr ell等[26]的综述。
4 与分子标记技术结合
4.1 利用RAPD筛选微卫星 Ender等[24]和Ue do等[25]通过R APD筛选微卫星。他们首先在基因组D NA中进行R APD扩
安徽农业科学,Journal of Anh ui Agri.Sci.2007,35(18):5361-5363 责任编辑 孙红忠 责任校对 李洪DOI:10.13989/https://www.360docs.net/doc/3f1876278.html, ki.0517-6611.2007.18.012
增,然后在琼脂糖凝胶上电泳分离,片段通过Southern 杂交转移到尼龙膜上,与标记的微卫星探针进行杂交,阳性带纯化克隆后测序。结果表明30个克隆中,21个包含微卫星。该技术程序不需要建立和筛选基因组文库。Ya ma moto 等[23]
用此方法在梨中开发了8条微卫星引物。Lunt 等[27]也采用R AP D 筛选微卫星,方法是先进行R APD 扩增,然后将扩增产物纯化后连接到质粒载体,转化大肠杆菌,用2套引物进行菌落PCR (M13正向和反向引物,M13正反向引物和重复序列引物),对2套PCR 体系产物有差别的克隆进行测序后设计引物。Fr ydenberg 等[28]也采用相似的方法,不过他们是先进行总基因组D NA 酶切,然后电泳分离,片段纯化后克隆到载体中,再对克隆进行P CR 筛选。用重复序列引物与SP6引物或者T7引物扩增,阳性克隆再用SP6和T7引物同时扩增,扩增产物纯化后测序。
4.2 利用AFLP 筛选微卫星 用链亲和素磁珠(Str epta vidin Ma gne Spher e Par amag enetic Pa rricles )来富集AFL P 片段中含微卫星的片段,是基于磁珠表面的链酶亲和素与标记于微卫星探针上的生物素之间的强且稳定的共价结合。Ha kki 等[3]用AFL P 从小麦中分离微卫星位点。方法是先进行Vos 等[29]的AFL P 预扩增。预扩增产物与用生物素标记的微卫星探针进行杂交和吸附,洗涤非微卫星片段后,用相应AFL P 引物扩增收集到的D N A ,片段克隆测序后设计引物进行微卫星扩增。Gao 等[30]从花生中选取了14个克隆测序,全部包含微卫星,其中5个为简并序列,7个用来设计引物,在花生中表现都较好。He 等[31]也从花生中分离出了微卫星引物。此外,Za ne 等[6]提出了一种称为FI ASCO (Fast Isolation by AFLP of Se -quences Containing Repe ats )的方法,实质上与Hakki 等[3]的方法相似。Ya ma moto 等[32]用类似的方法从梨中开发出14对引物。
4.3 利用IS SR 筛选微卫星 I SSR (I nter -Simple Sequence Re -peat ),是Ziethle wic a 等[33]发展起来的一种基于微卫星的分子标记,与微卫星标记不同,该法是直接利用微卫星序列为引物,用P CR 扩增两个位于反向排列的微卫星之间的序列。一套ISSR 引物可用于不同的物种。
Fisher 等[34]采用(CT )n 为核心序列,并在5′端锚定几个单核苷酸为引物,进行扩增得到P CR 产物,将这些产物回收纯化并克隆,对其中15个阳性克隆测序,发现13个含有(CT )n 重复,它们不仅存在于P CR 产物两端,亦存在于P CR 产物中间。Davila 等[35]利用5′端锚定ISSR 引物扩增,对所得到的4个多态片段克隆测序,发现1个微卫星DN A 重复序列。利用I SSR 片段克隆微卫星,测序后因重复片段核心序列所在区域大都在末端,一般情况下只能得到微卫星一端的引物,为了获得另一端的引物,应进行第2次克隆测序,须采用染色体步行的方法,设计出另一端引物,以获得一对完整的微卫星引物。实际应用时主要有Vector ette PCR [36]和抑制PCR
[37]
两种。
Lench 等[38]采用Vectorette PCR ,用锚定的重复序列引物
分离微卫星,从人的AMlDX 基因克隆中获得6个微卫星DN A 。Ujino 等[39]用Vectorette PCR 从柯氏娑罗双中分离到8
对微卫星引物,并在娑罗双属和龙脑香科中成功扩增。
Lian 等[40]和Burgess 等[41]分别独立提出了一种结合IS -SR 和抑制P CR 技术来分离微卫星位点的方法,已在柳树[42]、松树[43]、刺槐[44]、白桦木[45]、豆马勃[46]获得成功。有关抑制PCR 技术的原理,参见文献[40,50]。具体方法是先对总基因组DN A 用合适的平端酶酶切,连接上特殊的接头后进行IS -SR 扩增,P CR 产物回收,克隆到T 载体中,测序,设计引物,分2种情况:①测序结果中包含的微卫星两端的序列足够长,此时可直接设计合适的SSR 引物;②序列内部未包含微卫星序列,而只分布在两端(此为大多数情况下)。所以只可获得一侧的微卫星引物。为了得到另一侧的微卫星引物,须进行抑制PCR ,然后利用由ISSR 测序结果设计的特异引物,以及抑制P CR 接头引物进行巢式P CR ,以获得另一侧微卫星引物。该方法的具体操作流程见图1。
图1 利用ISS R 分离微卫星的流程
从ISSR 中获得微卫星引物是一种简单和有效的途径,尤其对于那些公共的数据库里序列信息没有或很少的物种;Van 等[48]在桉树中成功地用此方法得到了微卫星引物,并且还进行了微卫星扩增后产物的测序,结果表明用此方法获得的微卫星引物扩增后的产物就是重复序列区域。
4.4 S TMP (S equ en ce T agge d Mcr osate llit e Profiling ) Ha yden 等[49-50]提出了2种新技术,一种是ST MP ,是5′锚定PCR 和基因表达的序列分析(SAGE )技术相结合的产物;另一种是SA M (Selectiv ely Amplified Micr osa tellite ),是5′锚定PCR 与另一种微卫星多态性技术SAMP L (Selectively Amplified Microsa tellite Poly mor phic L oci )相结合的产物。通过构建序列标签文库鉴定微卫星位点。其具体过程较繁琐,主要涉及接头设计和用链酶生物素包被的磁珠分离微卫星位点。具体原理和步骤参见唐荣华等[5]和Ha yde n 等[49-50]。5 结语
通过公共数据库或者已公开发表的文献获得微卫星标记是最简便易行的,但对大部分物种而言,其数量有限,且引物多态性表现不高[51]。不同物种间共用,有时盲目性较大,针对性较差,可指导操作的理论依据不足[7]
。通过基因组文库获得微卫星D N A 标记,成本高,工作量大。而且筛选文库本质上并不是一个有效的途径,因为假的阳性克隆还需要进
5362 安徽农业科学 2007年
行第2次杂交,以进一步确定微卫星克隆。有大约65%在不同基因型间缺乏多态性[23]。
利用R APD和AFL P的方法开发微卫星引物,需要杂交来富集微卫星序列,效率较低。ST MP和S AM操作繁琐,技术要求高,实用较困难。利用ISSR标记筛选微卫星,已获得了成功。通过I SSR来筛选微卫星,因其只瞄准微卫星区域,针对性强,免去了杂交筛选的步骤,简便易行,并且效率较高,有望在微卫星引物开发中得到广泛应用。
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35卷18期 郭大龙 植物微卫星引物开发方法
【优质文档】高级植物生理学专题复习题
2014 高级植物生理学专题复习题 一、将下列英文名词翻译成中文并用中文简要解释 phytochrome polyamines calmodulin Rubisico elicitor phytoalexin lectins systemin oligosaccharinaquaporin Phosphotidylinositol Osmotin 二、问答题 1. 举例说明突变体在植物生理学研究中的应用。2. 简述由茉莉酸介导的植物伤信号转导过程。3. 植物体内产生NO 形成途径主要有哪些？NO 在植物体内的生理作用怎样？4. 简述由水杨酸介导的植物抗病信号转导过程。5. 试论述在逆境中，植物体内积累脯氨酸的作用。6. 简述激光扫描共聚焦显微术在生物学领域的应用7. 什么是活性氧？简述植物体内活性氧的产生和消除机制。8. 植物抗旱的生理基础有哪些？植物如何感受干旱信号？9.盐胁迫的生理学基础有哪些？如何提高植物的抗盐性？ 10.说明干旱引起气孔关闭的信号转导机制。 11.为什么在植物生理分子研究中选拟南芥、蚕豆、番茄作为模式植物？ 12.试述植物对逆境的反应和适应机理(阐述1－2 种逆境即可) 13.简述高等植物乙烯生物合成途径与调节 (文字详述与详细图解均可14.以乙烯为例说明激素的信号转导过程。 15.什么是光呼吸与光抑制？简要阐明光合作用的限制因素(包括外界环境因素与植物本身 calcium messenger systym late embryogenesis abundent protein hypersensitive response pathogenesis-related protein induced systemic resistance heat shock protein calcium-dependent protein kinases mitogen-activated protein kinase laser scanning confocal microscopy Partial rootzone irrigation Original fluorescence yield Maximal fluoreseence yield photoihibition photooxidation photoinactivation photodamage photobleaching solarization
高级植物生理复习资料
高级植物生理学 一名词解释（仅供参考） 1植物生理学：高级植物生理学是一门研究植物生命规律及其调控的综合学科 2核孔(nuclear pore)：核膜是细胞核与细胞质之间的界膜,但核膜不连接,上有许多小孔,这就称为核孔。它实现核质之间频繁的物质交换和信息交流 3水势(water potential);就是每偏摩尔体积水的化学势差,即体系中水的化学势与纯水化学势之差除以水的偏摩尔体积所得的商. 4渗透势(溶质势):由于溶质的存在而使水势降低的值,其值为负. 5压力势(pressure potential)由于细胞壁压力的存在而引起的细胞水势增加的值,其为正值. 6水孔蛋白(aquaporin):研究发现植物细胞质膜和液泡膜上有一类膜内蛋白,其多肽链穿越膜并形成孔道,特异的允许水分子通过,具有高效转运水分子的功能,这类蛋白被称为水孔蛋白. 7胞间连丝：在初生纹孔场上集中分布着许多小孔，细胞的原生质细丝通过这些小孔，与相邻细胞的原生质体相连。这种穿过细胞壁，沟通相邻细胞的原生质细丝称为胞间连丝。是细胞间物质运输与信息传递的重要通道，通道中有一连接两细胞内质网的连丝微管 8微体：含有酶的单层膜囊泡状小体，与溶酶体功能相似，但所含酶不同于溶酶体 9渗透作用（Osmosis）指两种不同浓度的溶液隔以半透膜，水分子或其它溶剂分子从低浓度的溶液通过半透膜进入高浓度溶液中的现象。或水分子从水势高的一方通过半透膜向水势低的一方移动的现象。 10高渗溶液（hypertonic solution）：将细胞（或生物体）浸入某种溶液中时，水从细胞向外部渗出，这种溶液显示高渗性，称为高渗溶液 11低渗溶液：如果水向细胞内渗入，则表示溶液为低渗性，则称为低渗溶液 12等渗溶液：细胞内外浓度相等的溶液 13质壁分离：指的是成熟的植物细胞在外界溶液浓度较高的环境下，细胞内的水分会向细胞外渗透，进而失水导致原生质层和细胞壁收缩，而细胞壁的伸缩性要小于原生质层，所以产生了这种原生质层和细胞壁分离的现象 14矿质元素(mineral element):灰分中的物质为各种矿质的氧化物、硫酸盐、磷酸盐等,构成灰分的元素称为灰分元素又称为矿质元素. 15必需元素(essential element):是植物生长发育必不可少的元素. 16离子的主动吸收与被动吸收(active absorption and passive absorption) 被动吸收:溶质顺电化学势梯度进入质外体的吸收过程,不需要代谢提供能量. 主动吸收:溶质跨膜进入细胞质和液泡的过程,要利用呼吸释放的能量逆电化学势梯度吸收. 17协助扩散(facilitated diffusion):协助扩散是小分子物质经膜转运蛋白协助,顺浓度梯度或电化学梯度跨膜的转运,不需要细胞提供能量. 18离子通道(ion channel):是细胞膜中一类内在蛋白构成的孔道.可为化学方式或电学方式激活,控制离子通过细胞膜的顺势流动. 19离子的选择吸收(selective absorption):是指植物对同一溶液中不同离子或同一盐的阳离子和阴离子,吸收的比例不同的现象. 20光合作用(photosynthesis):通常是指绿色植物吸收光能,把二氧化碳和水合成有机物,同时释放氧气的过程.从广义上讲,光合作用是光养生物利用光能把二氧化碳合成有机物的过程. 21原初反应(primany reaction):是光合作用起始的光物理化学过程,包括光能的吸收、传递与电荷的分离,即天线色素吸收光能并传递给中心色素分子,使之激发,被激发的中心色素分子将高能电子传给原初电子受体．同时又从原初电子供体获得电子.原初反应的速度极快. 22作用中心色素(reaction center pigment):又称为反应中心色素,是指少数特殊状态的叶绿素a分子,具有光化学活性,将获得的光能进行电荷分离,直接参与光化学反应的色素. 23聚光色素(light harvesting pigment):聚光色素没有光化学活性,不直接参与光化学反应,类似无线电天线将吸收的光能以诱导共振方式传递给作用中心色素.包括:大部分叶绿素a分子、全部叶绿素b、类胡萝卜素分子. 24希尔反应(Hill reaction):离体叶绿体在有适当氢受体存在时照光发生放氧的反应称为希尔反应. 25红降现象(red drop):光合作用的量子产额在波长大于680nm时急剧下降的现象.
引物设计原则(含Realtime引物)
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析） 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
Oligo引物设计软件使用方法
作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。 在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法： 1，直接用键盘输入： a，点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence 命令，进入序列展示窗口； b，此时即可键入DNA序列； c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。 2，利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。 3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。 点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。 进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，
高级植物生理学复习资料
1、共振传递：一个色素分子吸收光能被激发后，其中高能电子的振动会引起附近另一个分子中某个电子的振动（共振）。 2、激子传递：激子通常是指非金属晶体中由电子激发的量子，它能转移能量，但不能转移电荷。在由相同分子组成的聚光色素系统中，其中一个色素分子受光激发后，高能电子在返回原来轨道时也能释放出激子，此激子同样能使相邻色素分子激发，即把激发能传递给相邻色素分子。激发的电子可以相同的方式再放出激子，依次传递激发能。 3、受体：狭义概念：是细胞表面或亚细胞组分中的一种天然分子，可以识别并特异地与有生物活性的化学信号—配基结合，从而激活或启动一系列生物化学反应。广义概念：是指能够接受任何刺激（包括生物和非生物环境刺激等），并能产生一定细胞反应的生物大分子物质均称为受体。 4、它感作用：植物群生在一起，相互之间存在对环境生长因素，如光照、水肥的竞争和通过向周围环境释放有机化学物质，影响周围植物称为它感作用，也成为相生相克或异株克生作用。 5、它感化合物：也称克生物质，它感作用中把生物体产生的、能影响其它植物生长、健康、行为或群系关系的所有非营养物质统称为它感化合物。 6、量子产额：吸收一个光量子后所所释放的O 2的分子数或固定CO 2 的分子数，或光化学产物数。 7、花熟状态：当植物营养生长达到一定程度，即体内一些特殊物质积累达到一定量时，即产生对开花诱导条件能够发生反应状态，即为花熟状态。 8、光周期诱导：一定适宜的日照条件（光周期）诱导花熟状态的植物启动开花反应的现象。 9、光周期反应：植物能够接受一定适宜的日照条件（光周期）后体内进行花反应的生理现象。 10、开花：成花反应完成（叶原基转向花原茎），植物开花的现象。 11、临界夜长：昼夜周期中短日植物能开花的最小暗期长度或长日照植物能够开花的最大暗期长度。 12、临界日长：指昼夜周期中能诱导植物开花所需的最低或最高的极限日照长度。 13、根系提水作用：是指土壤表层干旱的条件下，当植物蒸腾作用降低时，处于深层湿润土壤中的根系吸收水分，并通过输导组织运至浅层根系进而释放到周围干燥土壤中的现象。 14、被动吸水：常称为“蒸腾拉力吸水”，是指叶片因蒸腾失水而造成与维管束系统一个连续的水势差而产生的使导管中水分上升的一种吸水形式，是植物水分吸收的主要形式。 15、协助扩散：是小分子物质经膜转运蛋白，顺浓度梯度或电化势梯度跨膜的转运，不需要细胞提供代谢能量。 16、空化现象：虽然水分子之间存在内聚力，但木质部中的水柱也有可能被其间的气泡所阻塞，导致水流中断的现象。 17、源：指制造营养并向其它器官提供营养的部位或器官，主要是指成熟的叶片。 18、库：指消耗养料和贮藏养料的器官，如生殖器官、干物质贮藏器官等。 19、活性氧：是指氧在还原过程中产生的、氧化性极强的一类中间产物的统称。 20、呼吸链电子漏：当电子由呼吸链的辅酶Q裂解出来，在细胞色素系统进行传递过程中，部分电子也会发生“泄露”现象，泄露的电子并使氧的单价还原的形式生成超氧阴离子自由基，这种现象称为呼吸链电子漏。 21、伤呼吸：植物在受伤后，伤处细胞呼吸均明显的增强，把这种呼吸习惯称为伤呼吸。 22、信号转导：植物细胞通过膜上的受体细胞感受和接受外界的各种刺激，并将这种刺激通过胞内各种转导
微卫星位点筛选方法综述
论文综述 微卫星分子标记筛选方法综述 摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。它作为一种重要的分子遗传标记，能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化，被广泛应用于实验动物的研究。本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。最简便、最省时的方法是从从公共数据库（如Genbank、EMBL、EST数据库等）或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布的物种；第二种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点，其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。 关键词：微卫星；分子标记；实验动物 微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（Simple Sequence Repeat , SSR），短串联重复（Short Tandem Repeat STR），是以少数几个核苷酸（一般1～6个）为重复单位的串联重复DNA序列。微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1]，在植物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点，而在哺乳动物中每6 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点[2]。并且SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍体（或多倍体）的纯合体或杂合体，这是AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。 随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。但微卫星分析中引 物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星 位点的难度和花费。微卫星标记分离最大的困难是引物的获得。同RAPD、AFLP 等遗传标记不同，微卫星研究首先需要获知位点的序列信息，以便从重复序列两端侧翼的保守序列中设计引物。因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。目前已知微卫星位点的物种很有限，这是因为微卫星位点的获得需经过克隆、杂交筛选、测序等步骤，因此需花费一定的人力、金钱，这限制了微卫星标记的大量
引物设计软件oligo应用简介
引物设计软件oligo 应用简介 作者： 来源： 时间： 2007-03-07 字体： [大 中 小] 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。 Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。 “Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 oligo 的下载和安装我就不多说了，打开oligo 相信也无需多讲。打开oligo 的页面如下： 单击file 菜单再点open 或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口
在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开” 选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”
出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile” 出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，
为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。 该频率高则可增加错误引发的可能性。 因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。 如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。 ?G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段
高级植物生理学03温度胁迫
低温胁迫 低温程度和植物受害情况，可分为冷害（chilling），指作物在它生长所需的适温以下至冰点以上温度范围内所发生的生长停滞或发育障碍现象；冻害(freezing)，指冰点以下低温对植物生长发育的影响。 一、低温的伤害： 膜伤害：目前普遍认为细胞膜（特别是质膜和类囊体膜）系统是植物受低温伤害的初始部位，低温处理后膜相对透性以及膜上各组分的变化, 是衡量植物抗冷性的一个指标。若温度缓慢降至零下，能引起细胞外冰晶积累，造成机械性胁迫和细胞内次生干旱等复杂变化。 膜脂相变：细胞膜系统是低温冷害作用的首要部位, 温度逆境不可逆伤害的原初反应发生在生物膜系统类脂分子的相变上。膜脂从液晶相变成凝胶相,膜脂上的脂肪酸链由无序排列变为有序排列,膜的外形和厚度发生变化,膜上产生皲裂,因而膜的透性增大，离子大量外泻，因而电导率有不同程度的增大。脂脂肪酸的不饱和度或膜流动性与植物抗寒性密切相关。膜脂肪酸成份（饱和和非饱和脂肪）酸和膜透性 膜脂过氧化：植物在低温胁迫下细胞膜系统的损伤可能与自由基和活性氧引起的膜脂过氧化和蛋白质破坏有关。MDA含量可以作为低温伤害程度以及植物抗冷性的一个生理指标。 乙烷。植物在正常条件下几乎不产生乙烷，在逆境条件下细胞遭到破坏时乙烷大量产生。一般认为乙烷是由不饱和脂肪酸(亚麻酸)及其过氧化物通过自由基反应生成的,所以乙烷的产生与膜脂过氧化密切相关，其产量与膜透性呈正相关,可作为膜破坏的指标。 乙烯？？？当植物处于逆境条件时,乙烯生成增加,被称为逆境乙烯或应激乙烯,其量比正常条件下的乙烯量高2～50倍。乙烯主要由受刺激而未死亡的细胞产生,其生物合成也是遵循:蛋氨酸→腺苷蛋氨酸(SAM)→ACC→乙烯途径。也有人报道逆境乙烯也可由亚麻酸过氧化作用产生。但在植物体内很难将各种途径产生的乙烯区分开来,因此乙烯的释放不能作为一种表示膜脂过氧化的指标。 细胞骨架是（植物中主要是指微管和微丝）。与细胞运动、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达及细胞分化等生命活动都密切相关。低温直接毁坏了细胞骨架，使细胞质基质结构紊乱，进而破坏细胞的代谢系统及其中物质的运输。不同耐寒性植物的微管对低温的反应有着显著差异。不耐寒植物的微管对低温敏感，而抗寒植物其微管具有抗寒性，其冷稳定性与植物种类抗寒性成正相关，抗寒锻炼后，抗寒植物的微管其冷稳定性提高。 光合作用：温胁迫对植物光合色素含量、叶绿体亚显微结构、光合能量代谢及PS活性等一系列重要的生理生化过程都有明显影响。对于亚热带起源的低温敏感植物,当温度稍低于其最适生长温度时,即表现出净光合速率的下降。当温度降至引起冷害的临界温度时,光合作用显示出强烈的抑制。光合机构的光破坏在很多情况下是由过剩光能产生的活性氧引发的(引发光氧化损害的两类活性氧是米勒反应产生的超氧阴离子O和单线态氧’O2。
植物微卫星引物开发方法_郭大龙
植物微卫星引物开发方法 郭大龙 (河南科技大学林学院,河南洛阳471003) 摘要 综述了开发植物微卫星引物的几种方法:搜寻核酸数据库和寻找已存在的微卫星引物;不同物种间共用;建立基因组文库;利用分子标记技术发展S SR引物。此外,还比较了几种方法的优缺点。 关键词 微卫星;引物;开发;植物 中图分类号 S127 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)18-05361-03 Developm ent of the Micro satellite Prim er in Pla nt GU O Da-long (College of Forestry,Henan University of Science and Techn ology,Luoyan g,Henan471003) A bstract In this paper s everal methods of developing microsatellite primers in plants were su m marized:①to search the Database and find th e primers which were delivered;②to transfer them among the differen t s pecies;③to establis h gen omic library;④to d evelop SSR pri mer based on moleculars mark-ers.Furthermore,the ad vantages an d disadvantages of t he d ifferent methods were comp ared. Key w ords Microsatellite;Prim er;Develop ment;Plan t 微卫星(Micr osa tellite,又叫Simple Seque nc e R epeat,SSR)以1～6bp的短核苷酸为基本单位,呈串联重复状广布于生物体整个基因组,具有分布广泛、多态性丰富、易于检测、进化所受选择压小、信息量大、以孟德尔方式分离、共显性遗传等特点。在遗传多样性检测、种质鉴定及系谱分析、遗传连锁图谱构建、基因定位与标记辅助育种等领域中得到广泛应用。微卫星标记检测的位点多态性水平明显高于R FL P标记,而且重复性优于R APD,与AFLP相比,不同的材料结果略有不同[1]。随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势[2]。但微卫星分析中引物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费[3]。因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。何平[4]、唐荣华等[5]、Za ne等[6]对微卫星引物的开发方法作了一些综述。笔者就微卫星引物开发及其最新进展进行了系统总结,并对这些方法的优劣加以比较。 1 搜寻核酸数据库和寻找已存在的微卫星引物 从公用的D NA序列数据库(Ge nBa nk EMBL和DD BJ等)或从已发表的文章中查找所研究物种的微卫星DN A两翼序列和引物,在时间和费用上无疑都是最经济的[7]。从数据库查询的方法已成功地用于许多物种,例如大豆[8]、玉米[9]、水稻[10]的微卫星标记。Ka ntety等[11]分析了大麦、玉米、水稻、高粱和小麦核酸数据库中的序列,对发展微卫星引物的可能性进行了分析。Ga o等[12]从小麦EST中分离出101个新的微卫星引物。但是对大部分物种而言,已知序列信息远不能满足微卫星引物设计的需要。随着大规模测序和EST计划的进行,cD NA和其他的序列信息会不断地注册到数据库中,可以获得的微卫星位点的数目会越来越多。 从发表的文献中搜索已经开发出的微卫星引物,也是个便捷方法。在《Molec ular Ec olog y Notes》和《Conserva tion ge net-ic s》上还刊登有不同的物种中新发现的微卫星引物。 2 不同物种间共用 微卫星侧翼序列在相近物种中具有一定的保守性,因而 基金项目 河南科技大学人才科学研究基金。 作者简介 郭大龙(1978-),男,湖北十堰人,博士,副教授,从事种质资源和生物技术研究。 收稿日期 2007-03-03某一物种的微卫星引物可以在其相近的物种中使用,这样就大大地减少了检测微卫星位点的工作量。微卫星在近缘种之间的通用性已有研究,但在属间应用还不多。目前已知大豆[8]、水稻[13]、葡萄[14]等类群发展的专一的微卫星引物可在近缘种之间使用,同样在柑橘属[15]、芸薹属[16]以及猕猴桃属[17]的不同种之间可以共享某些引物。Cipria ni等[18]从桃中开发的引物,能在桃属的栽培桃、罐藏桃中扩增出多态性片段,在近缘种如日本李、欧洲李、杏、甜樱桃和酸樱桃上也可得到扩增片段。油橄榄中开发的微卫星引物在木樨科中的不同属中得到成功地扩增[19]。苹果中分离的微卫星引物在梨的遗传多样性分析中得到成功地应用[20]。Gao等[21]统计了水稻、小麦、大豆和玉米序列中的微卫星的类型和频率,从小麦中开发的引物有近一半在水稻、玉米和大豆中得到了成功扩增。周涵滔等[22]利用从甘蓝型油菜中获得的2个微卫星引物对来自禾本科、十字花科、芸香科、锦葵科等12种经济作物的DN A进行PCR扩增,结果12份材料中所扩增出的主带大小一致。总之,引物跨物种共用的有效程度可能与其亲缘关系的远近有关,但要确定微卫星引物在不同类群广泛应用的标准是困难的,目前对此尚无定论。 3 建立基因组文库 建立基因组文库是开发微卫星引物中采用最多的方法,技术路线成熟。基本步骤如下:①提取基因组D N A;②用限制性内切酶将基因组D NA切割成均匀的小片段,或者用超声波对基因组D NA进行断裂;③凝胶电泳,回收大小300～500bp的片段;④将回收片段克隆,使用标记探针进行杂交; ⑤筛选出含有重复序列的克隆;⑥测序证实重复序列片段的存在;⑦在重复序列片段两端区域设计引物对,进行PCR扩增,检验引物的有效性;⑧对小量样本进行预试验,挑选出重复性好,具多态性的微卫星位点。大多数的微卫星位点是用寡聚核苷酸探针从基因组文库中分离出来的。 从基因组文库中分离微卫星位点的传统方法在微卫星富集程度上效率很低,已经设计了很多方法用来提高效率,具体见Zane等[6]和Sdquirr ell等[26]的综述。 4 与分子标记技术结合 4.1 利用RAPD筛选微卫星 Ender等[24]和Ue do等[25]通过R APD筛选微卫星。他们首先在基因组D NA中进行R APD扩 安徽农业科学,Journal of Anh ui Agri.Sci.2007,35(18):5361-5363 责任编辑 孙红忠 责任校对 李洪DOI:10.13989/https://www.360docs.net/doc/3f1876278.html, ki.0517-6611.2007.18.012
(完整版)考博高级植物生理学
1水分生理。水分的吸收机理(细胞的吸收，根的吸收)，提高抗逆性 水分代谢：植物对水分的吸收、运输、利用和散失的过程。 一、细胞吸水的机理： 1.渗透吸水指由于溶质势的下降而引起的细胞吸水，为含有液泡的细胞吸水。 2.吸胀吸水对于无液泡的分生组织和干燥种子来说，主要是依赖于细胞内的亲水性物质，有较低低的衬质势。 二、植物根系吸水。 植物根系吸水的方式按动力不同，分为主动吸水和被动吸水两种方式。主动吸水是由植物根系本身的生理活动而引起的吸水方式，动力来自根压，根压指由于根系生理活动引起水势下降，导致土壤周围细胞的水分向根部流动，这种是液体从根部上升的压力；被动吸水是由于枝叶的蒸腾作用而引起根部吸水的方式，动力来自蒸腾拉力，蒸腾拉力指由于整体作用产生的一些列水势梯度使导管中水分上升的力量。 根系吸水的途径 有三条，质外体途径，跨膜途径和共质体途径。质外体途径是指水分通过细胞壁、细胞间隙等无细胞质部分的移动，速度快；共质体途径是指水分从一个细胞的细胞质经过胞间连丝移动到另一个细胞的细胞质，速度较慢；跨膜运输指水分从一个细胞移到另一个细胞，要通过两次质膜和液泡膜； 提高作物抗旱性途径是什么？ （1）根据作物抗旱特征可以选择不同抗旱性的作物品种。 （2）提高作物抗旱性的生理措施，如：抗旱锻炼等 （3）施用生长延缓剂如矮壮素等 2根干旱后怎么告诉叶片（机理），如何做到合理灌溉等人为的因素。 什么叫信号转导？细胞信号转导包括哪些过程？ 答：通过信号传导。信号转导是指细胞偶联各种刺激信号与其引起的特定生理效应之间的一系列分子反应机制。 包括四个步骤：第一，信号分子与细胞表面受体的相结合；第二，跨膜信号转换；第三，在细胞内通过信号转导网络进行信号传递、放大和整合；第四，导致生理生化变化如何才能做到合理灌溉？ 合理灌溉是依据作物需水规律和水源情况进行灌溉，调节植物体内的水分状况，满足作物生长发育的需要，用适量的水取得最大的效果。要做到合理灌溉，就要掌握作物的需水规律。通过观察作物的灌溉形态指标和生理指标、土壤含水量，并使用喷灌、滴灌、调亏灌溉、控制性分根交替灌溉等节水灌溉方法，还要注意水温和水质。 3矿质营养，吸收的机制和机理，（通过蛋白吸收等形式），如何指导合理施肥。 矿质营养: 植物对矿物质的吸收、转运和同化，通称为植物的矿质营养。 植物细胞吸收矿质元素的方式有哪些？ （1）被动吸收：包括简单扩散，消耗代谢能。 （2）主动吸收：有载体和质子泵参与，需消耗代谢能。 （3）胞饮作用：是一种非选择性吸收方式。 合理施肥的依据：
微卫星DNA标记
1微卫星DNA标记的发现 1974年，Skinner等在研究寄居蟹的基因组时发现了微 卫星DNA的重复序列。此后，在人、动物和酵母的基因组中都发现了类似大量的简单重复序列。直到1986年，Ail等首次用合成的微卫星寡核苷酸作为探针用于人的指纹分析，这时才得到重视。1988年，Jeffreys等人做了进一步的研究并使之发展成为新的遗传分子标记系统。1989年，Litt等[1]扩增到了人类基因组微卫星序列，从而创造了“微卫星（microsatellite）”这个名称。 2微卫星DNA的结构 微卫星DNA又称简单重复序列(simplesequencere-peats，SSR)或短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)，是指以少数几个核苷酸（一般是1~6个）为单位串联重复的DNA序列。这些重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化，并且随机分布于真核生物基因组中。普遍认为，在染色体上，除着丝粒及端粒区域外，其他区域也广泛散在分布有微卫星位点。Weber根据微卫星核心序列排列方式的不同，将其分为完全（无间隔）、不完全（有非重复单位的碱基间隔）和复合型（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）微卫星3种类型。 3微卫星DNA标记的优缺点 3.1优点 ①分布广泛。微卫星DNA广泛且均匀地分布于真核生物基因组中。②多态性丰富。由于微卫星在不同个体中的重复单位数目变异大，因而造成其长度具有高度的多态性，使其可以包含大量丰富的信息。③简易高效安全性。微卫星检测方法简便且效率高，单个位点检测时间很短，一般不超过24h，并可以多个位点同时进行检测。微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。④保守与通用性。微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性，某一物种的微卫星引物可以应用于相近物种。⑤共显性遗传。微卫星标记的等位基因遵循孟德尔共显性遗传，因而易区分纯合型和杂合型。 3.2缺点 ①建立和筛选基因文库，进行克隆和测序，都是非常繁琐、耗时的工作。②由于不同物种的微卫星侧翼序列不尽相同，因此针对不同物种设计相应的特异性引物也非常耗时。③微卫星进化具有复杂性，可能出现同源异型或异源同型。④PCR 扩增受许多因素的影响，使一些等位基因无法被扩增出来，即“无效基因”。影响亲子鉴定的正确性。⑤目前还没有发现哪个DNA探针能很好地匹配他们各自的多态性 4微卫星DNA的筛选方法 获得微卫星DNA的常规方法主要有两种:①通过构建基因组文库,核心重复序列探针标记,杂交筛选,测序及特异引物设计等一系列步骤;②可利用近缘物种间某些染色体片段的同源关系,以已知的微卫星DNA引物作跨物种使用,从中筛选出适宜于另一物种的微卫星DNA标记. 5微卫星DNA的筛选步骤: ①基因组文库的构建,提取基因组DNA,酶切后与载体连接,将连接产物转入大肠杆菌,涂板后在37℃下培养,用α-互补法筛选阳性的重组质粒;②质粒DNA的提取;
高级植物生理
第一章：细胞生理 膜蛋白：按膜与脂分子的结合方式分为以下三类蛋白： 外周蛋白（周边蛋白）：靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子的亲水部 分结合的蛋白。 整合蛋白为跨膜蛋白：是两性分子。跨膜结构可以是1至多个疏水的α螺旋。 锚定蛋白：通过脂类分子和质膜表面共价相连。 膜糖：生物膜中的糖类主要分布于质膜的外单分子层。这些糖是不超过15个单糖残基所连接成的具分支的低聚糖链(寡糖链)，它们大多数与膜蛋白共价结合，少部分与膜脂结合，分别形成糖蛋白和糖脂。 寒冷驯化反应：磷脂含量的增多和葡糖脑苷脂含量减少，有两个不饱和脂肪酸尾部的磷脂分子摩尔百分比增加。（寒冷驯化反应中最显著、最关键的变化:质膜中脂类 组成的改变） 过氧化物酶体：在植物中存在于光合细胞中。功能是去除有机物中的氢。 乙醛酸循环体：存在于富含油脂的种子中。含有乙醛酸循环酶系统，这些酶有助于将储存的脂肪酸转化为糖，生成的糖被转运到幼嫩该组织为植物体生长提供能量。细胞骨架：是指真核细胞中的蛋白质纤维网架体系，包括微管、微丝和中间纤维等。 微管：存在于细胞质中的由微管蛋白组装成的中空管状结构。 微丝：由肌动蛋白构成，它类似于肌肉中的肌动蛋白，呈丝状，同时还与肌球蛋白、原肌球蛋白等构成复合物质。 中间纤维：是一类柔韧性很强的蛋白质丝，其成分比微丝和微管复杂，由丝状亚基组成。胞间连丝：穿越细胞壁、连接相邻细胞原生质(体)的管状通道。 共质体：胞间连丝把原生质体连成一体的体系。 质外体；细胞壁、质膜与细胞壁间的间隙以及细胞间隙等的空间。 植物凝集素：是一类存在于细胞壁中能与多糖结合或使细胞凝集的蛋白，参与细胞壁的识别反应。可能在植物的防御反应中起重要作用。 初生壁：由生长细胞形成的可扩展的细胞壁层，通常没有特异性，在所有的细胞中其分子构造接近相同。形态表现出广泛的多样性。 次生壁：在细胞停止生长（扩大）后形成的。在细胞的不同分化阶段次生壁的结构和成分高度特化。 细胞应力：在膨胀的细胞中，细胞内容物挤压着细胞壁，引起细胞有弹性（如可逆的）延伸并产生反作用力。细胞壁应力松弛作用促进水分吸收和细胞伸长 膜蛋白的功能 运输蛋白：膜蛋白中有些是运输蛋白,转运特殊的分子和离子进出细胞; 酶：有些是酶，催化相关的代谢反应; 连接蛋白：有些是连接蛋白,起连接作用； 受体：起信号接收和传递作用。 膜蛋白在膜平面侧向扩散的作用： （1）底物在膜上的酶之间的转运 （2）叶绿体和线粒体中电子在电子传递链组成成分之间的转运和相互碰撞 （3）利于多聚蛋白复合体的组装 （4）信号传递依靠一系列特定的整合蛋白，外周蛋白或脂锚定蛋白之间的瞬时相互作用
引物设计软件使用
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200b p的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的U
引物选择的过程和上群体的过程
1.2 采用酚-氯仿提取法提取模板DNA 1) 取固定的闭壳肌肉0.1g,在装有ddH 2O 的烧杯中漂洗。置于装有670μl抽提/消化液【每管加 600μl STE+60-65μl 10% SDS+10μl 蛋白酶K （+2μl ? 巯基乙醇）】的1.5ml eppendorf 管中,用小剪刀剪成细末,颠倒混匀, 用2B 铅笔在管盖编号标记,封口膜封盖口,置水浴架上,于55℃恒温消化至看不到固体组分方为止。然后取管，拆膜。 2) 往每管中加入终浓度约20μg/ml的RNA 酶,置于水浴锅中(55℃),关掉电源,放置30min,以 去掉RNA 。 3) 每管中加入饱和NaCl 溶液150μl,1100rpm,15min后,取上清液。 4) 每管加入700μl等体积酚(将酚和事先配好的氯仿异戊醇等体积混合,终比为 酚:氯仿: 异戊醇=25:24:1)。 5) 颠倒混匀10min,冷冻离心(4℃,12000rpm,10min)取上清。 6) 每管加入700μl氯仿异戊醇(氯仿:异戊醇=24:1),颠倒混匀5min,冷冻离心(4℃, 12000rpm, 10min )。 7) 取上清液于新的管中,每管快速悬空加入2倍体积冰 冻无水 乙醇(一般900-950μl),常温沉淀30min 后,冷冻离心(4℃,12000rpm,10min),弃上清。 8) 每管加入500μl 70% 乙醇溶液,用手摇动洗涤沉淀, 冷冻离 心(4℃, 12000rpm,10min),弃上清。 9) 将带有DNA 沉淀的 eppendorf 管倒置于新滤纸上, 室温干燥20min 。每管加入150-200μl ddH 2O ,置4℃过夜,以溶解 DNA 沉淀。 DNA 模板的检测:取6μl ddH 2O +1μl 溴酚蓝+1μl 待测DNA 模板,于1．0%琼脂糖凝胶下电泳(电压120V,30min),用扫胶仪观察提取的DNA 的分子量并根据样品亮度和Marker 亮度的对比,估计的浓度进行稀释的样品。最后调整到的DNA 浓度为20ng/μl。 1．3．2 引物处理 将上海生工合成的粉末状引物，离心后，按合成单的表注量分别加入0.1倍的TE 溶解，配成5uM 的工作液。置于-20℃冰箱保存。引物资料如表1。 1.4 引物的筛选 1.4.1 Mix-DNA 琼脂糖初筛选 图1 DNA 原始浓度图