复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响

复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响

发表时间：2012-11-06T10:56:14.590Z 来源：《中外健康文摘》2012年第24期供稿作者：姜家康陈睿

[导读] 复原抗癌汤通过抑制MMP-9的生成，抑制基质降解，最终抑制肝癌细胞的血性转移。

姜家康陈睿(通讯作者)迟文成（黑龙江中医药大学附属第一医院 150040）

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）24-0067-03

【摘要】目的复原抗癌汤对H22原发性肝癌小鼠的抑制作用及其可能机制。方法建立H22原发性肝癌小鼠模型，随机分为空白对照组、荷瘤对照组、化疗组、中药低、中、高剂量（4.48、8.96、17.92g/kg·d）组进行治疗，检测各组肿瘤的生长情况；HE染色观察肿瘤组织和肝组织的病理变化；免疫组化法检测肿瘤组织MMP-9的表达。结果与荷瘤对照组比较，复原抗癌汤各剂量以及顺铂对原发性肝癌均有抑制作用，抑瘤率分别为53.12%、32.87%、37.51%、39.82%（P均＜0.05）；HE染色见化疗组、中药治疗组癌组织较荷瘤组生长局限，核仁固缩，核浆比较对照组小，形态较规则，核仁边移现象少见；免疫组化见中药治疗组与化疗组比较其MMP-9蛋白表达强阳性率高于后者（P ＜0.05）。结论复原抗癌汤通过抑制MMP-9的生成，抑制基质降解，最终抑制肝癌细胞的血性转移。

【关键词】复原抗癌汤原发性肝癌 mmP-9

原发性肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，素有“癌中之王”之称，早期症状隐匿，发现时已属中晚期，病死率高，这与其具有高度侵袭与转移关系密切。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1免疫组化试剂：即用型SABC免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB显色试剂盒、小鼠用MMP-9蛋白免疫组化检测试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2实验仪器：主要包括：日本OLYMPUS公司超薄切片机、日本日立公司透射电子显微镜H－600、中国光学仪器厂倒置式生物显微镜XSJ-D。

1.1.3实验药品（1）复原抗癌汤： 1.75g/装，江苏江阴天江药业特制提供。其主要成分如下：(西洋参、红豆杉、黄芪、白术、半枝莲、竹茹、薏苡仁、厚朴、柴胡、白花蛇舌草)复原抗癌汤由以上药味经特定的制备工艺和流程提纯制成。(2）顺铂（DDP）：20mg/支，山东齐鲁制药有限公司生产，批号：7050172DC。(3）生理盐水：500ml，哈尔滨制药六厂生产。

1.2方法

1.2.1动物分组选用BALB/C小鼠120只(雌雄各半)，体重18～20g，由哈尔滨医科大学肿瘤附属医院实验动物中心提供（合格证号：SCXK（黑）2006/008）。随机分组：A组（空白对照组）、B组（荷瘤对照组）、C组（化疗组）、D组（中药低剂量对照组）、E组（中药中剂量对照组）、F组（中药高剂量对照组）,每组10只。

1.2.2造模瘤株：H22原发性肝癌荷瘤小鼠购自长春生物试剂动物实验中心。将H22原发性肝癌荷瘤小鼠[1]后脱颈处死，在超净工作台上分离瘤体，将实体瘤部分放入75％酒精浸泡消毒10min后，取生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水洗净后剪碎加生理盐水研磨，过300目尼龙网制成单细胞悬液，台盼蓝（tryan-blue）染色试验计算后细胞数>95%，用吸管轻吹打待测细胞悬液，取少许在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，按白细胞计数法，于低倍镜下计数4角的4个大方格内活细胞总数，按下式计算：

用生理盐水调整细胞浓度至1×107/ml，取1ml注射器吸取0.2mL瘤细胞悬液，按照下述方法接种于B组、C组、D组、E组、F组BALB/C 小鼠肝左叶内，制成原位原发性肝癌模型[2]。

1.2.3给药 A组：予0.2ml/d生理盐水灌胃，每日一次；B组：予0.2ml/d生理盐水灌胃，每日一次；C组：予顺铂3mg/kg·d，每只0.3ml 腹腔注射，隔日一次，共7次；D组：予复原抗癌汤按4.48g/kg·d药量灌胃，每次0.2ml，每日一次；E组：予复原抗癌汤按8.96g/kg·d药量灌胃，每次0.2ml，每日一次；F组：予复原抗癌汤按17.92g/kg·d药量灌胃，每次0.2ml，每日一次。各组于接种日起第3天开始给药，按上述方式给药达到治疗次数后停药，并于次日进行实验动物取材。

1.2.4取材停药次日，颈椎脱位法处死小鼠，打开腹腔，暴露肝组织及肿瘤组织，无菌摘取瘤体，电子天平称取瘤重，依次做标记，随后以中性福尔马林固定12小时，备用。

1.3观察指标

1.3.1通过计算抑瘤率来观测复原抗癌汤对肿瘤生长的抑制作用

停药次日，颈椎脱位法处死小鼠，打开胸腔，暴露肝组织及肿瘤组织，无菌摘取瘤体，电子天平称取瘤重，依次做标记，按公式[3]: 抑瘤率=*100%

计算抑瘤率。

1.3.2观察小鼠肿瘤组织及肝组织形态学改变

将已固定的肿瘤组织及肝组织取出；逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，6μm厚切片；HE染色，中性树脂胶封片，观察并比较各组小鼠肝组织和肿瘤组织的形态学有无变化。

1.3.3免疫组化法检测肿瘤组织的MMP-9蛋白表达

免疫组化法检测原发性肝癌组织中MMP-9蛋白的表达，参考试剂盒说明书。

判断标准：经免疫组化法各步骤处理后MMP-9阳性细胞的胞浆和/或胞核呈淡黄色或棕黄色，采用二级计分法进行阳性细胞计数[4]，高倍镜下(×400)对每张切片随机选择5 个视野，每个视野计数100 个细胞，计算每张切片阳性细胞百分率，阳性细胞数＜ 5%，0 分;5%～25%，1 分; 25%～50%，2分; 50%～75%，3 分; ＞75%，4 分。染色强度: 淡黄色1 分; 棕黄色2 分; 棕褐色3分; 两者相加: 0～1 分为阴性