植物DNA提取方法
1.2实验方法
1.2.1 茶花基因组DNA的提取
采用CTAB法[8]提取DNA，所有试剂（有机溶剂除外）和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下：
（1）取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min.
(2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。
（3）重复步骤（2）一次。
（4）取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA
4℃，12000rpm离心10min.
(5)弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。
（6）倒置或者37度培养箱烘干.
(7)加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。
1.2.2 DNA含量和质量的测定
（1）紫外分光光度法：取4ml提取的DNA，将之稀释200倍，测定提取的DNA在260nm 和280nm处的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高，需纯化。
（2）琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，电压5V/cm电泳约60min，溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。
1.2.3 PCR扩增
(1)PCR反应在Biometro PCR仪上进行，反应体系为25ul:ddH2O 14ul,10×Buffer
2.5ul,MgCl(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约
40-60ng),Taq酶（5U/ul） 0.3ul.
ddH2O 13.7uL
10×buffer 2.5 uL
dNTPs 2.0 uL
MgCl2 2.5 uL
Primer 2.0 uL
DNA 2.7 uL (40-60ng)
Taq酶 0.3 uL
共25 uL
(2)反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性30s,36℃退火1min,72℃延伸1min30s,40次循环；72℃最终延伸10min;4℃保存。
预变性94℃ 3 min
变性94℃30 s
退火36℃1min 40个循环
延伸72℃1min30s
继续延伸72℃10 min
保存4℃
1.2.4 PCR扩增产物检测
取扩增产物与6×loading buffer混匀，在1.3%的琼脂糖凝胶上电泳，缓冲液为0.5×TBE,电压5V/cm,电泳1.5-2h.经溴化乙锭染色20min后,取出凝胶在成像系统中拍照并保存结果。
1.3数据处理及RAPD分析
得出清晰，亮度较好的条带后，用laberworkers软件分析所得条带，在同一位点重复出现条带的记为“1”（包括弱带），不出现条带的记为“0”[9]，并分析扩增条带的长度。将生成的数据输入电子表格，用NTSYSpc21软件分析得出据类图和遗传相似系数和遗传距离。其中相似系数[10]为: s= [ 2M xy/(M x + M y ) ] ×100% (s表示相似系数,M xy 表示品种x、y 共有片段总和,M x 表示x 品种片段数,M y 表示y 品种片段数) ,遗传距离Ｄ＝１-Ｆ。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA提取
提取的DNA经分光光度计测定，其OD260/280,DNA含量如下：
表2 基因组DNAOD260/280,DNA含量。
Table2 Results of DNA extraction from leaves of 15 Camellia samples
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茶花品种 OD260/280 DNA含量ug/ml
Camellia species DNA content
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杜鹃茶（Dujuancha） 1.85 0.708
凹脉（Ao′mai） 1.45 2.618
金丝玉蝶（Jinsiyudie） 1.43 1.282
连蕊茶（Lianruicha） 1.45 5.837
六角白(Liujiaobai) 1.81 1.094
玉美人（Yumeiren） 1.34 1.124
醉杨妃（Zuiyangfei） 1.43 1.807
凤仙(Fengxian) 1.35 1.537 酒中花（Jiuzhonghua） 1.33 1.165 孩儿面(Haiermian) 1.59 5.401 墨光镜（Moguangjing） 1.38 1.395 红露珍（Hongluzhen） 1.45 0.965
秋牡丹（Qiumudan） 1.41 2.792
公正评奖团 1.39 3.546
星上星(Xingshangxing) 1.32 0.857
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基因组DNA OD260/280在1.32-1.85之间，符合RAPD扩增的要求。
附录2：所用试剂及配方
4% CTAB(十二烷基三甲基溴化胺) 称取10gCTAB，加水定容至250ml.
1mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠）称取EDTA 37.224g，用NaOH(固体)调PH
至8.0,最后定容至100ml.
1mol/L Tris-HCl 称取12.114g Tris-HCl ，用80ml蒸馏水溶解，
加浓HCl ，最后定容至100ml.
4.2mol/L NaCl 称取NaCl 61.362g,定容至250ml
3mol/L NaAC 称取NaAC 4.824g，定容至100ml
Tris-HCl：54g
5×TBE 硼酸：27.5g 定容带1L
EDTA：10mol/L
4% CTAB：125ml
2% CTAB缓冲液1mol/L Tris-HCl: 25ml
4.2mol/L NaCl: 83.25ml
1mol/L EDTA: 5ml
TE缓冲液1mol/L Tris-HCl: 2.5ml
1mol/L EDTA: 0.25ml 定容至250ml 定容至250ml