细胞培养工作记录

陈涛、泌尿外科、肾脏肿瘤、男、有组织-80℃冻存记录

器材：

离心管架、离心管，一次性用吸量管，电动移液枪，移液枪，大枪头，酒精喷壶，75%酒精，灭菌后的剪刀、镊子，一次性用吸管，1640液，TIL培养液，培养皿，24孔培养板，冻存管2个。

流程：

1.先把所有需要用到的物品耗材准备好，放置好，装枪头用大烧杯套入一层黄色塑料袋，工作人员戴好无菌手套跟口罩。安全柜里应放好2个培养皿（打开的），里面分别放入75%酒精（润洗剪刀镊子）、1640液（润洗剪刀镊子）。

2.先剪下2块组织放入冻存管内，然后将剩余组织放入1640液中清洗，上下颠倒数次，弃去上清液，重复此操作2次。

3.将清洗后的肿瘤组织倒入一块培养皿中，用剪刀先去掉血管、血块、脂肪组织等，之后将需要的组织剪碎。

4.往24孔板中的其中6个孔每孔加1ml培养基。并将剪碎的组织用一次性吸管吸入并均匀加入到含培养基的每个孔中，之后在培养板上写上病人姓名、性别、年龄、组织部位、处理时间等信息，并在冻存管上写上相同信息。

5.培养板放在倒置显微镜下观察，看组织块是否分布均匀，之后等待数日后进行补液换液等。冻存管先放到-20℃冰箱中保存，处理完剩余步骤马上放-80℃冰箱中的冻存盒中保存。

6.操作完成后，处理剩余物品，操作顺序为：①先把培养板放入培养箱（培养箱内有装有灭菌水的盘子，保证生长所需湿度，37℃，5%CO2），再把冻存管放到-℃冰箱暂存。②把培养基放到4℃冰箱中，然后把1640液也放入4℃冰箱，再拿出75%的酒精，放好，之后倒掉废液，扔掉用完的移液管、一次性吸管，并将移液枪放好。③最后处理废弃组织，把装有酒精、1640液的培养皿合好丢进套有塑料袋的烧杯中，之后再套上一层袋子，绑好扔掉，处理完所有物品后，操作台里喷上酒精，往擦手纸上喷上酒精对工作台面进行仔细擦拭，之后，开上紫外照30min，一般情况下，如果刚好需要进行换液跟处理标本，应当先换液再处理样本。

TILs 原代培养

2015.12.01 4:30 pm。为处理组织的过程，未消化。

TILs 第一次补液

2015.12.04 4:30 pm。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。补液，往培养板加入1ml培养基即可。

TILs 第二次换液

2015.12.17 17:20pm 换液。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸去培养板内的培养基，大概每个孔吸去1ml，之后直接补充1ml培养基。TIL细胞开始长出来，形态典型（豆芽状、哑铃状、蝌蚪状）

TILs 第三次换液

2015.12.19 18:00pm 换液、分孔。此时，其中几孔培养基开始变黄，细胞长得比较多，可以分孔了，本次分孔为1分2.准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸取一半上清液，吹打混匀，细胞少的换液，长得好的分孔。

TILs 第四次换液

2015.12.22 18:00换液、分孔。此时，分孔后的细胞依然长得比较满，继续分孔。本次分孔为1分2.准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸取一半上

清液，吹打混匀，细胞少的换液，长得好的分孔。

TILs 第五次换液

2015.12.24 16:10pm 换液、分孔。分孔后一共有12孔，分完孔继续观察细胞生长状况。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸取一半上清液，吹打混匀，细胞少的换液，长得好的分孔。

TILs 第六次换液

2015.12.26 14:50am 换液、过滤，转6孔板。每4孔细胞转1个大的孔，之后继续培养。准备好准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头、6孔板。先吸去上清，每孔吹打混匀后，每4小孔合并成1个大孔，之后每个打孔补3ml培养基，继续培养并观察，写好病人信息。

第七次换液

2015.12.29 9:10am 6孔板细胞扩瓶（一共3瓶），每个大孔吸到1个50ml培养瓶内，继续培养。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头、5ml培养瓶等。3个孔先吸去上清液，吹打混匀后将细胞液吸到培养瓶内，每瓶补充15ml培养基，之后写上病人信息，放培养箱中培养，继续传代，继续换液1-3次即可冻存，视细胞生长状况。

第八次换液

2015.12.31 15:00pm 换液。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头。用移液枪吸去一半上清液，上下左右吹打混匀细胞后，补充7ml培养基，放培养箱继续培养。

第九次换液

2016.01.02 9:40am冻存细胞（一共6管（分别为24.46M，22.34M，21.08M))（标记12.17，未写名字）。冻存过程：将培养瓶内的培养基，先吹打混匀，将所有贴壁细胞尽量吹打下来，再将培养基吸入离心管，然后，把培养板中同一序号的培养基吸去上清并吹打混匀，之后分别吸入到3个15ml离心管中，吸取30ul 左右细胞液到EP管内，做好标记，用来细胞计数用。配平后，1500rpm离心3—5min，然后，弃去上清，弹拨混匀沉淀后每个离心管内加入1ml冻存液，吹打混匀后将冻存液吸入到冻存管内，写上病人相关信息。冻存管（一共6个）放入程序降温盒中再放入4℃冰箱中，先进行细胞计数。细胞计数过程参考欧阳水平标本处理过程。本次细胞计数结果为24.46M，22.34M，21.08M。

细胞培养工作流程

细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程 1、准备 1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。 1.2设施检查：确认空调、传递窗工作状态完好。 1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。 1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。 1.5复苏用水准备：（1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。（2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。 1.6操作人员进入层流罩：穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。 1.7溶液使用前处理：辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。 2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。

辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。 3、种子支领依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。 4、种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。 5、移种操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。 6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。 7、清场将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间，层流罩内用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。 8、复苏后观察第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。 9、换液换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2）。拧紧瓶口，平放到恒温室培养。最后按规定清场

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个，常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。实验步骤一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。、培养液的更换

细胞培养全过程

我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范一、细胞培养室的环境 1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件： 1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入； 2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上； 3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒； 4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。 5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除； 6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份； 7) 注意监测CO2的气压，及时补充。 8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。 2. 实验器具的清洗、消毒灭菌： 1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗

——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。 *洗液：浓硫酸+重铬酸钾 2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干 3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。 4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。二、细胞培养用水、用液： 1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿； 2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。 3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例： 1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解； 2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时； 3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时； 4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0 5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；

细胞培养的一般过程

细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。培养细胞的细胞生物学一、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞

细胞培养的流程

细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法）（一）仪器的清洗总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液）可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！您的这个帖子属于改范畴！感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！再次感谢！再多说点啊！呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗：对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、

细胞培养工作流程

细胞培养工作流程-标准化文件发布号：（9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。 3、种子支领依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。 4、种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。 5、移种操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。 6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。 7、清场

牙科门诊日常管理工作检查表

牙科管理工作检查项目一、看（一）看牙科内部； 1、员工的整体精神面貌，仪容、仪表、仪态对管理人员和员工进行活跃度评分（1-10分） 2、工作秩序与效率：卫生制度，卫生工作日志记录情况，服务流程执行情况，值班工作日志 3、内部环境卫生，地面，墙面，屋顶，器械台面与底部，墙角；物品摆放，器械与办公用品，有没有标准，执行情况如何二、查（一）查前台： 1、前台卫生整洁度 2、门诊日志记录情况 3、分诊日志记录，各科室各大夫月初诊人数，复诊人数，接诊率，人均消费等，医生个人和门诊收入情况统计 4、日报表，月报表接诊成功率，有效率，这些数据有没有，具体情况如何 5、轻松牙医等客户管理软件的使用情况，病人来源登记等基础性资料的登记情况，图片资料上传情况，电话追随访情况记录，录音记录文件，客户投诉处理流程表，病人满意率，投诉率，信息反馈处理情况 6、电话追随访记录情况

（二）查财务 1、财务日报表个人与门诊收入情况检查，每日的日报表是否有，记录情况如何；月报表，单月结算情况，是否有未及时结算的项目 2、收入利润数和利润率 3、各项成本比率 4、材料的管理：出入库登记、盘库、材料帐（三）查医疗区： 1、卫生情况 2、物品摆放 3、班前准备：精神状态准备，器械设备，患者预约情况熟识 4、接诊沟通：程序，有效率 5、操作规范：技术与服务方面 6、术后遗嘱：相关医嘱单等资料准备，执行情况 7、医疗文书书写：检查记录情况（四）消毒间 1、卫生情况 2、消毒流程标准及记录 3、出入登记 4、消毒标示（五）查办公室 1、办公室管理制度 2、工作计划、学习计划、进步计划

细胞培养标准流程

细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO 放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞 2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。

2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。 (转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min）无血清无双抗DMEM量＝全培体积的10％。如6孔板加4mL培养液培养，即转染体系为400ul无血清无双抗DMEM。缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。转染后6h后细胞换液，排除试剂的毒性影响。 24～48 h 后收集细胞用于后续实验。 Note：如果用这种方法转染效率一直不佳，可以在接种细胞前，把转染试剂配好，把转染试剂加到培养盘上，再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞，这种方法会导致细胞死亡，不贴壁。 HiPerFect转染试剂转染（用于siRNA的转染，说明书附后） For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA 以6 孔板为例，转染之前，以2mL全培接种1.5-6×105细胞于6孔板每孔。将细胞放置在培养箱中培养，直至转染。（前50%---染90%）取1.5 ml 离心管，加入100 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入 siRNA(20uM浓度，相当于0.25ug/μL)5uL,转染试剂12μL，轻轻混匀，室温静置5-10 min。 siRNA：转染试剂：无血清无双抗DMEM 5uL：12ul：100ul。（比例待定）

实验总结细胞培养方法

一、培养细胞常用配置培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏步骤： 1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。 3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。 4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。 5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。 6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。 7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 8. 将培养瓶放入培养箱内培养注意事项： 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。 3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基

细胞培养的操作步骤

细胞培养的操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。 1.剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。 2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。 4.注意事项（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。（4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。

细胞培养基的生产和过程控制

细胞培养基的生产和过程控制细胞培养基作为生物制品生产的重要原材料之一，其质量对生物制品有重要的影响。细胞培养基的生产工艺和细胞培养基的原材料选用、生产过程及检验过程中的质量控制对于细胞培养基的产品质量具有直接影响。其中原材料的成份及其质量直接决定了细胞培养基产品的质量及安全性，选择合适的物料是实现细胞培养基功能过程中需要解决的基础问题。生产工艺的选择（如原料的研碎、混合技术等）及生产过程中的质量控制等直接影响产品的溶解性、批生产量及批次间差异，进而影响产品的质量。 cGMP稽查员在对国内细胞培养基生产企业进行cGMP审计时指出，细胞培养基的生产工艺及设备应经过验证，原材料必须做鉴别试验，记录应真实反映生产过程的实际情况，生产过程偏差处理应包括对出现偏差之前涉及到的批次均应进行调查等等。这些要求是基于FDA对生物制药用原料的质量要求方面提出，远远高于国内对药用原料的要求。随着对人用和动物保健用生物制品安全性要求的提高，严格执行GMP规范进行细胞培养基生产是国内细胞培养基行业发展的必然趋势。 1.1细胞培养基的原料选择及质量控制 1.1.2原材料的原料选择由于动物细胞培养基产品属于药用原料，《哺乳类动物细胞培养基行业标准》对细胞培养基产品的微生物限度、内毒素含量进行了限定，所以细胞培养基所用原料宜采用注射级、药用级原料。对于部份没有注射级和药用级的原料，细胞培养基制造者针对自身产品质量要求，制定一些重要指标（微生物限度、内毒素、重金属等）进行原材料的质量控制。 1.1.2原材料的质量控制细胞培养基生产企业建立完善的原材料质量标准，对于原材料的来源、检验、使用、及销毁等有明确的可追溯记录。在质量控制过程中，药用级原材料的质量标准应参考中国药典

细胞培养标准操作程序(SOP)

细胞培养标准操作程序（SOP） 1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。 2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。 3．操作规程：培养液、PBS、胰蛋白酶的配制 1000ml培养液的配制 1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。 2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。 3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。 4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后PH值会升高～，故配时调PH 至左右）。 5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。 6、配青霉素80万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解取青霉素和链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。 7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。 PBS（平衡盐溶液）的配制 NaCl 8g KCl ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ml Na2HPO4*H2O KH2PO4 （1）无需调PH值，其成分溶解后PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌

细胞培养准备工作步骤

细胞培养准备工作常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、三角瓶、烧杯、量筒、平皿、滤器、滤膜、磁力搅拌器、电子天平、酒精灯、镊子、剪刀、瓶架、吸管架、超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、烘箱、移液管、枪头、离心管、酸缸、细胞冻存管、液氮罐、封口膜、喷壶、以及洗刷用品等。清洁液的配制及酸缸的使用：清洁液的配置： 1. 分别称取适量的重铬酸钾和蒸馏水，把重铬酸钾转移到塑料容器中（或不锈钢容器中），然后用蒸馏水溶解重铬酸钾。 2. 待重铬酸钾溶解充分之后，缓缓加入称量好的浓硫酸，一边加一边搅拌。注意：切不可把重铬酸钾溶液加入到浓硫酸中。 3. 待酸液自然冷却后，移入酸缸中。弱液：重铬酸钾——100g，浓硫酸——100mL，蒸馏水——1L 次强液：重铬酸钾——120g，浓硫酸——200mL，蒸馏水——1L 强液：重铬酸钾——63g，浓硫酸——1L，蒸馏水——200mL 酸缸的使用： 1. 将内缸取出置于外缸的支架上，静置使酸液沥干。 2. 将干燥后的培养用具放入内缸，然后缓缓将内缸放入酸液中。注意：如瓶中仍有气泡需要将气泡赶净，确保瓶中不留气泡。清洗： 1. 玻璃器皿的清洗（1）新买的玻璃器皿：用自来水初步刷洗——5%的稀盐酸浸泡过夜——自来水冲洗5～6次——洗涤剂刷洗——自来水冲洗5～6次，甩干——泡酸过夜——自来水冲洗20遍——蒸馏水冲洗3～5遍——双蒸水冲洗3遍——烘干（50～60℃）——包装（2）使用过的玻璃器皿的清洗：自来水浸泡——洗涤剂刷洗——自来水冲洗5～6次，甩干——泡酸过夜——自来水冲洗20遍——蒸馏水冲洗3～5遍——双蒸水冲洗3遍——烘干（50～60℃）——包装 2. 塑料器皿的清洗细胞培养皿、培养板及培养瓶新的可直接使用。使用过的器皿：清水冲洗干净——晾干——2%NaOH浸泡过夜——自来水冲洗——5%盐酸浸泡30min——流水彻底冲洗——蒸馏水漂洗——晾干 3. 瓶盖的清洗塑料盖和胶塞的清洗方法相同，但需要分开清洗

车间主任日常工作检查表

车间主任日常工作检查记录编号：JL-QES/GLH2.15-02 车间名称：车间主任：检查时间：年月日时分序号检查项目检查内容存在问题整改措施考核意见 1 生产准备原材料、包装物领取种类是否准确齐全，数量是否合理。车间储存少量物料要设立明确标识。周转桶料在车间存放要有标识在指定地点存放。无标识或不确定物料禁止使用。使用的生产原料日清日结。 2 生产设施设备运行员工安全状态是否良好。车间生产安全设施、设备、特种设备是否运行正常，是否进行日常维护保养，外观是否洁净。设备是否存在跑、冒、滴、漏，空车运行现象。 3 劳动纪律车间员工是否提前就餐、睡觉、酒后上岗。是否在厂区内吸烟，在危险区域打电话。员工之间发生冲突、打架斗殴。工作时间是否有玩游戏或娱乐活动。 4 作业指导书、操作规程执行情况员工是否违规操作。是否按规定佩戴劳动保护用品及用具。在易燃易爆场所是否穿戴静电防护用品。危险性作业是否实行许可管理。 5 产品质量生产的产品外观、颜色、气味、重量、数量、计量、包装物等是否符合质量要求。计量是否在规定的允许范围内，成品装箱是否有漏装、错装（说明书，胶板，胶嘴、固化剂等随箱用品）等现象。不合格品是否流入下道工序。 6 记录表单填写维修人员的“设备日常完好运行、保养记录”、“设备维修记录”填写是否真实、全面。.生产、工艺操作记录是否齐全。岗位质量首检、中间质量检验记录是否齐全。数据报表是否及时可靠。 7 现场环境车间原材料、半成品、成品、工位器具是否按位摆放。人行通道、安全通道是否被占用。玻璃、地面是否整洁。暖气片、窗台是否摆放杂物。废品、废渣、废液是否按规定位置摆放、清理及时。卫生分担区内杂物、积水、积雪清理是否及时。工作结束后是否关闭门窗，风、水、电、气设备。消防器材是否定置摆放。 8 备注车间主任每日要对所属车间的生产作业管理，三体系执行情况，作业现场环境卫生等，进行不定期的检查，及时发现问题及时处理。对问题简单描述，没有问题写无。制造部每周考核一次，并对问题追踪落实，检查人签字。

管理人员日常检查表表格.docx

管理人员日常检查表检查人：检查时间：要求按照《危险化学品从业单位安全标准化规范》的要求认真检查，不放过任何可疑点。对查暂时无法处理得应督促有关单位采取有效的预防措施，并立即向安全环保处或公司领导报告。计划每日检查序号检查项目检查标准检查方法（或依据） 1 工艺检查工艺管线有无震动、松动、跑、冒、滴、漏、腐蚀、堵塞等情况；检查工艺阀门开关是否灵活，是否有开关不到位、过紧、过松响动、内漏外流、腐蚀、堵塞等情况。依据安全操作法检查现场和记录 2 设备检查运转设备的基础牢固情况、运转及润滑情况，各运转部件是否有异常响声，裸露的运转部件防护罩是否齐全可靠，辅机及管线是否有震动，检查静止设备的运转状态是否良好。依据安全操作规程检查现场 3 电气检查电气设备的工作状态、电机声音是否增大、震动是否增强，保护接地是否牢靠，电机及轴承温度是否升高、电机及电器元件是否有火化及异常声音、气味，变、配电室门窗、玻璃、及安全防护措施是否齐全。依据安全操作规程检查现场 4 现场管理检查工作现场是否清洁、有序、员工劳保用品的穿戴是否符合要求各种通道是否畅通无阻，应急灯具是否完好，消防设施是否安全可靠，气防用具是否定期维护保养，时刻处于备用状态等。安全设施是否处于正常状态。可能发生急性职业损伤的有毒有害作业场所按规定设置警示标志、报警设施、冲洗设施防护急救器具转柜是否完好，柜内设施是否齐全。查现场 5 安全教育查各车间对外来参观、学习，外来施工单位进行作业现场前的安全培训教育工作。查现场查记录 6 关键装置重点部位检查公司关键装置及重点部位的运行状况是否良好，安全监控设施运行情况是否符合要求。查现场查记录 7 作业证检查公司员工在进行动火作业、进入受限空间作业、破土作业、临时用电作业、高处作业、检修作业等危险作业，作业证的申办工作。查作业许可证 8 警示标志对公司易燃易爆、有毒有害场所的警示标志和告知牌的完好情况，检维修施工、吊装等作业现场设置警戒区域和警示标志的情况进行检查。查现场 9 其他检查公司范围内外来施工队伍，施工是否按照国家和企业的有关要求规定进行施工。查现场查记录

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

. 细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。（二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。 '.

细胞冻存流程

细胞冻存流程秦伟 2013-12-28 目的及应用：应用于细胞冻存。试剂及设备：培养液，胰蛋白酶（0.25%），DMSO（分析纯），安全柜，离心机，恒温水浴锅，冰箱（4℃、-20℃），显微镜，培养箱，液氮罐，吸管，培养瓶，枪头，移液管，50ml离心管，冻存管（1～2ml）微量加样枪，记号笔，移液枪，冻存盒（异丙醇冻存盒。异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温，直接从室温放进-80℃可以达到近似于1℃/min），实验原理：细胞冻存的基本原则是缓慢冷冻，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。实验步骤： 1. 配制含10%DMSO、20%小牛血清的冻存培养液4mL。 2. 取出生长良好的细胞。 3. 吸除旧的培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。 4. 消化：

拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。取下用后的移液管。 5. 中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL培养液终止消化。 6. 离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。将新培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。 7. 分装冻存：将细胞分装入冻存管中，每管1mL。 8. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 9. 冻存：细胞冻存盒，里面有异丙醇，直接放入-80过夜，冻存盒自动缓慢降温。然后-196℃液氮保存。注意事项： 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存要用新配制的培养液。