输血科相关技术规范与操作规程(SOP)
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输血科相关技术规范与操作规程(SOP)
曲靖市第一人民医院科室管理操作规范文件文件编号：QJYY－SXK
第一版
第1次修改责任部门：输血科生效日期：xx年1 月1日ABO血型鉴定文件页数：共5页 ABO血型鉴定
【标本】
抗凝或不抗凝静脉血。
【原理】
根据红细胞膜表面有无A抗原和（或）B抗原，将血型分为A 型.B型.AB型.O型4种。可利用红细胞凝集试验，通过正反定型准确鉴定ABO血型。所谓正定型，是指用标准抗A和抗B分型血
清来测定红细胞上有无相应的A抗原或（和）B抗原;所谓反定型，是指用标准A型红细胞和B型红细胞来测定血清中有无相应
的抗A和（或）抗B。
【器材】
载玻片.塑料吸管.小试管.台式离心机.微柱凝胶离心机.蜡笔.记号笔.显微镜等。
【试剂】
1.单克隆抗-A，抗-B血清试剂。
2. 0.8%.4％A
1.B及O型试剂红细胞盐水悬液。
3. ABO.RhD血型定型检测卡（单克隆抗体）。
【操作步骤】
（一）试管法
1.样本处理标本用离心机离心分离血清，备用，将被检RBC 以N.S洗涤1~2次，配制成2-5%红细胞悬液。
2.加样
2.1.正定型：2支小管，标“-A”，“-B”，分别加抗A.抗B 试剂1滴，2-5%红细胞悬液1滴；
2.2.反定型：4支小管，标“Ac”，“Bc”，“Oc”，“自c”，分别加2滴P.s，然后各加1滴相应细胞；（注意：先加血清再加血球）
3.离心：离心机3400r/min离心15秒，观察结果。
4.结果判定：血型抗A抗B AcBcOc 自身c A4＋－－＞2＋－－ B－4＋＞2＋－－－ O－－＞2＋＞2＋－－ AB4＋4＋－－－－如有不符合上表情况需进一步试验。
5.试管法凝集强度判断表试管中红细胞的凝集情况结果判读一个结实的凝块4+ 数个结实凝块，背景清晰3+ 不结实的凝块，背景清晰，振揺后背景混浊2+ 背景混浊，散在的不结实的小凝块，振揺后凝块仍可见1+ 背景混浊，散在的不结实的小凝块，振揺后凝块不可见± 凝集和不凝集的红细胞同时存在混合视野
（mf）红细胞扣完全或部分消失，细胞上请液为透明红色溶血（H）红细胞从细胞扣细沙样均匀划落，直至细胞扣完全消失 0
(二)玻片法（正定型，仅用于交叉配血时复查患者血型）
1.取清洁玻片1张，用蜡笔画成方格，标明抗-A，抗-B和抗-D，分别用滴管滴加抗-A，抗-B和抗-D分型血清1滴于标明的方格内，再各加受检者2-5%红细胞悬液1滴，混合。
2.将玻片不断轻轻转动，使血清与细胞充分混匀，连续约
15min,先以肉眼观察有无凝集或溶血反应；再在低倍镜下观察结果。
3.结果判定：凝集者为阳性结果，不凝集者为阴性结果。
(三)微柱凝胶法
【原理.方法.用途】
本品采用微柱凝胶免疫检测技术，用于人ABO血型正定型和反定型以及RhD血型的筛查。对于RhD阴性的样本，应按有关规定作进一步的实验。
本品系由聚丙烯塑料透明卡片，卡片上并排六支微柱型管中充填葡聚糖凝胶，从左向右顺序第一支至第三支微管凝胶中分别充填抗A. 抗B.抗D单克隆抗体IgM试剂，称之为特异性胶，检测人红细胞ABO.RhD抗原。第四支至第六支微管中只有凝胶，称之为中性胶，第四支微管作为阴性对照管；第五支和第六支微管作为ABO血型反定型管。
【操作】
1.样本处理标本离心，分离出血清，用 N.S配制0.5%-
0.8%RBC悬液。
2.在标有Ac.Bc的微管中各加入50ul（约1滴）受检血清。
3.在标有“-A”，“-B”，“-D” 对照的微管中各加入
50ul (约1滴)受检0.5%-0.8%RBC悬液。
4.将0.5%-0.8%试剂Ac.Bc分别加入标有Ac.Bc的微管中,每管50ul 。
5.即刻使用专用离心机离心5分钟，2分钟900rpm, ，3分钟1500rpm，观察结果。
6.结果判定：（1）阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。
（2）反应强度：特异性抗原抗体复合物位于胶表面，为强阳性反应；复合物在胶中为弱阳性反应；愈靠近胶底部颗粒愈小，反应愈弱。（3）阴性结果：被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶底部。
附：微柱凝胶法凝集强度判断表反应强度现象及说明4+ 红细胞复合物（凝集）位于凝胶表面3+ 大部分红细胞复合物位于凝胶表面，少部分位于凝胶中上部分2+ 大部分红细胞复合物位于凝胶中部，少部分位于凝胶下部1+ 红细胞复合物位于凝胶中下部± 与同一卡阴性管结果对照，如与阴性结果有差别，即为± －红细胞完全沉积在凝胶管尖底部完全溶血凝胶和液体无凝集或
未凝集的红细胞，液体出现透明清澈红色不完全溶血残留红细胞在胶表面.胶中或胶底部，液体出现透明清澈红色混合凝集红细胞复合物位于凝胶表面和凝胶底部主要参考文献
1.叶应妩.王毓三等《全国临床检验操作规程》中华人民共和国卫生部医政司编东南大学出版社出版发行xx年11月第3版
2.试剂盒说明书编写者：徐路琼审核者：马丽琼时间：xx 年1月1日曲靖市第一人民医院科室管理操作规范文件文件编号：QJYY－SXK
第一版
第1次修改责任部门：输血科生效日期：xx年1月1 日RH血型鉴定文件页数：共6页 RH血型鉴定 RH（D）抗原初筛【标本】
抗凝或（和）不抗凝静脉血，制备成2-5%红细胞生理盐水悬液。
【原理】
根据凝集反应原理，当被检测者红细胞上有D抗原存在时，可与IgM抗D产生特异性的抗原抗体反应，出现红细胞凝集现象。凡带有D抗原者称为RH阳性，不带D抗原者称为RH阴性。
【器材】
塑料吸管.载玻片.记号笔.小试管.离心机.显微镜等。
【试剂】
1.单克隆抗D（IgM）血清试剂。
2.ABO.RhD血型定型检测卡（单克隆抗体）。
【操作】
（一）试管法
1.1支小管，标“-D”，加入1滴IgM抗D。
2.1滴2-5%P.c，混匀。
3.3400r/min离心15秒。
4.轻轻振揺试管使红细胞重悬，肉眼或显微镜观察有无凝集现象。
5.记录结果，凝集者为阳性反应，反之为阴性反应。
玻片法.微柱凝胶法分别参考ABO血型鉴定的
（二）和
（三）。R H阴性确认
（一）经典抗人球蛋白法
【标本】
抗凝或（和）不抗凝静脉血，红细胞三洗，制备成2-5%红细胞生理盐水悬液。
【原理】
D变异型（弱D或部分D）红细胞与大部分盐水(IgM)抗D试剂通常不产生直接凝集反应，而与部分的IgG抗D血清用间接抗人球蛋白试验反应阳性。当我们初次得到RH阴性结果时，须进行RH阴性确认试验，用三种不同批号的IgG抗D定型，如果全部阴
性方可认为该被检者为RH阴性，否则，只要有一批为阳性，则可认为是D变异型。
【器材】
塑料吸管.试管架.记号笔.小试管.离心机等。
【试剂】
3批人源抗D.抗人球蛋白试剂（多抗或IgG）.阳性对照
【操作】
1.3支小管，标“-D1”，“-D2”，“-D3”，分别加入3批人源抗D各1滴。
2.加2-5%P.c1滴，37℃水浴30分钟。
3.立即N.S三洗（若不立即洗，则已结合的抗体容易脱离），最后一洗在吸水纸上扣干。
4.加入抗人球试剂2滴，3400r/min离心15秒，观察结果；
5.结果判定3支小管都阴性：RH(D)阴性；有任一小管凝集：D变异型。
（二）微柱凝胶法
【标本】
抗凝或（和）不抗凝静脉血，红细胞三洗，制备成0.8%红细胞生理盐水悬液。
【原理】
在微柱凝胶介质中，RH(D)
抗原与相应的不完全抗体在抗人球蛋白的作用下发生凝集反应，形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，该复合物不能通过凝胶间隙而浮于胶表面或悬于胶中；如无RH(D)抗原，则不能形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，分散的红细胞可以通过凝胶间隙沉于微柱腔底部。
【器材】
塑料吸管.小试管.微柱凝胶孵育器.微柱凝胶离心机等。
【试剂】
抗人球蛋白检测卡。
1.将1滴受检0.8%RBC悬液加入标记好的微柱中，立即加入1滴已知抗血清（分别加入3批人源抗D各1滴）；
2.37℃孵育15分钟；
3.使用专用离心机离心5分钟，2分钟900rpm, ，3分钟1500rpm，观察结果。
【结果判定】
阳性结果：红细胞RH(D)抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。
阴性结果：被检红细胞无RH(D)抗原，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶底部。
【临床意义】
1.在临床输血中，D变异型人输注D阳性红细胞后可产生抗D 抗体。所以受血者若为D变异型，应作RH阴性论，应输注RH阴
性血液；供血者为D变异型，应作RH阳性论，不应当输血给RH 阴性受血者。
2.D变异型妇女与RH阳性丈夫生育的婴儿可能发生新生儿溶血病。R H抗原分型
（一）试管法
【标本】
抗凝或（和）不抗凝静脉血，制备成2-5%红细胞生理盐水悬液。
【原理】
根据凝集反应原理，当含有-C”，“-c”，“-E”，“-e”抗原的被测红细胞分别与相应IgM抗-C”，“-c”，“-E”，“-e”血型定型试剂混合时，可导致特异性的抗原抗体反应，出现红细胞凝集现象。
【器材】
塑料吸管.试管架.记号笔.小试管.台式离心机等。
【试剂】
IgM抗-C”，“-c”，“-E”，“-e”。
【操作】
1.4支小管，标“-C”，“-c”，“-E”，“-e”，分别加入相应抗血清1滴。
2.再各加2-5%患者红细胞悬液1滴。
3.3400r/min离心15秒。
4.轻轻摇动试管，观察凝集情况。
（二）微柱凝胶法
【标本】
抗凝或（和）不抗凝静脉血，制备成0.8%红细胞生理盐水悬液。
【原理】
⑴人红细胞抗原与相应抗体发生特异性免疫反应，（其本质为血凝反应）；⑵检测系统是在微柱中（载体）将反应介质凝胶（50葡聚糖凝胶）装入微柱中；⑶凝胶的间隙具有分子筛作用。凝集的红细胞（结合的）被留在微柱上面成带状或凝集颗粒散布凝胶中间。未凝集的红细胞（即未结合.游离的）通过离心后沉入微柱的底部；⑷微柱凝胶中所含的特异性单克隆抗-C”，“-c”，“-E”，“-e”试剂检测红细胞上相应的RH血型抗原。
【器材】
塑料吸管.微柱凝胶离心机等
【试剂】
RH血型抗原检测卡（单克隆抗体）。
【操作】
1.在标有“-C”，“-c”，“ D”，“-E”，“-e”的微柱中各加1滴受检者0.8%RBC悬液。
2.即刻使用专用离心机离心5分钟，2分钟900rpm, ，3分钟1500rpm。
3.观察结果。
【注意事项】
1.如果临床上只要检查是否为RH阳性还是阴性，只需用抗-D 血清一种进行鉴别。如果为阴性，应进一步排除变异型D，再作RH表型分型。
2.如鉴定结果只与抗-D血清凝集，与抗-C”，“-c”，“-E”，“-e”都不凝集，则受检者为RH缺失型，以“–D–”表示。
主要参考文献
1.叶应妩.王毓三等《全国临床检验操作规程》中华人民共和国卫生部医政司编东南大学出版社出版发行xx年11月第3版
2.朱铁楠主编《血型鉴别标准与血制品应用技术及医院开展新技术新项目解析》北京:人民卫生出版社，xx年11月第1版
3.试剂盒说明书编写者：徐路琼审核者：马丽琼时间：xx 年1月1日曲靖市第一人民医院科室管理操作规范文件文件编号：QJYY－SXK
第一版
第1次修改责任部门：输血科生效日期：xx年1 月1日Coombs试验文件页数：共5页抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验(antiglobulin test, AGT)又称Coombs试验，是检查不完全抗体的一种很好的方法。直接Coombs试验是检测体内已被抗体和/或
补体致敏的红细胞。间接Coombs试验通过血清与细胞的孵育，证实抗体和/或补体与红细胞在体外结合。
直接抗人球蛋白试验（DAT）
【原理】
利用抗人球蛋白血清可与体内已被不完全抗体或补体致敏红细胞产生凝集反应，可检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏，如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏）.溶血性输血反应（输入的不相合红细胞被受血者不完全抗体致敏）.自身免疫性溶血性贫血（患者红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴类药物.青霉素等所致）。
(一)试管法
【标本】
EDTA抗凝静脉血,被检RBC以N.S洗涤3次，配制成2-5%悬液。
【器材】
试管架.塑料吸管.小试管.载玻片.记号笔.离心机.显微镜等。
【试剂】
多抗， IgG， C3。
【操作】
1.4支小管，标“多抗”，“IgG”，“C3”，“ABs”分别加入多特异性抗球蛋白.单抗IgG.单抗C
3.抗AB血清各2滴
2.分别在各管加入2-5%P.c1滴，3400r/min离心15秒，观察结果；
3.阴阳对照的选择
3.1.单抗IgG a）阳性对照用IgG致敏细胞与单抗IgG （IgG致敏细胞：抗D＋RH阳性细胞，37℃水浴30分钟三洗制成的3%悬液）；在试验中，于判为阴性的试管内加入1滴阳性对照细胞，再离心，然后重悬浮，判定结果。如果最初洗涤能充分除去所有未结合的球蛋白，结果为阴性，这是一个很重要的对照因为这是检测细胞是否洗涤充分的唯一方法。b ）阴性对照正常人3%D阳性红细胞悬液1滴+抗人球蛋白血清2滴
3.2.单抗C3 a）阳性对照1份ACD抗凝新鲜血+9份10%蔗糖，37℃水浴15分钟，三洗后37℃水浴30分钟，制成3%的悬液＋单抗C3; b）阴性对照正常人3%D阳性红细胞悬液1滴+单抗C32滴
（二）微柱凝胶法直接微柱凝胶抗人球试验（MGIA-DAT）
【标本】
EDTA抗凝静脉血,被检RBC以N.S洗涤3次，配制成0.8%悬液。
【器材】
滴管.小试管.微柱凝胶离心机等
【试剂】
抗人球蛋白检测卡。
【操作】
1.将0.8%P.c悬液，加1滴入凝胶管。
2.即刻使用专用离心机离心5分钟，2分钟900rpm, ，3分钟1500rpm，观察结果。
【注意事项】
1.标本采取后应立即进行试验，延迟或中途停止试验可使抗体从细胞上丢失。
2.受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。
3.最好对阴性结果进行核实，即在该试管中再加1滴IgG致敏红细胞，如结果为阳性，则表示试管内的抗人球蛋白血清确未被消耗。
4.红细胞上吸附抗体太少或Coombs阴性自身免疫性溶血性贫血，直接抗人球蛋白试验可呈假阴性反应。
间抗试验(IAT)
【原理】
本试验是一种检查血清中的游离不规则抗体或补体的方法。即用已知抗原的红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体；或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上的抗原。可用于抗体的检出和鉴定，血型抗原鉴定及交叉配血。
（一）经典抗人球蛋白试验
【标本】
不抗凝静脉血，将标本离心分离出血清。
【器材】
塑料吸管.试管架.记号笔.小试管.离心机。
【试剂】
4%筛检细胞（I.II.III）
【操作】
1.按下表加入试剂反应物被检管 P N 受检血清2滴 / /4%筛检细胞（I.II.III）1滴 / /2-5%D＋细胞 /1滴1滴 IgG抗D 血清 /2滴 / ABs / /2滴混匀，37℃水浴30分钟（快速法则每管加Lim液2d，37℃水浴10分钟）， N.S三洗，末次离心弃上清扣干抗球蛋白1滴1滴1滴
2.混匀，3400r/min离心15秒。
3.观察结果，P管凝集，N管不凝，受检管出现凝集为阳性，不凝集为阴性。
（二）间接微柱凝胶抗人球蛋白试验（MGIA-IAT）
【标本】
不抗凝静脉血，将标本离心分离出血清。
【器材】
塑料吸管.试管架.记号笔.小试管.37℃微柱凝胶孵育器.微柱凝胶离心机。
【试剂】
0.8%筛检细胞（I.II.III）。
【操作】
1.将1滴0.8%筛检细胞（I.II.III）分别加入标记好的微柱中，立即各加入1滴P.s ；
2.37℃孵育15分钟；
3.即刻使用专用离心机离心5分钟，2分钟900rpm, ，3分钟1500rpm，观察结果。
主要参考文献
1.叶应妩.王毓三等《全国临床检验操作规程》中华人民共和国卫生部医政司编东南大学出版社出版发行xx年11月第3版
2.朱铁楠主编《血型鉴别标准与血制品应用技术及医院开展新技术新项目解析》北京:人民卫生出版社，xx年11月第1版
3.试剂盒说明书编写者：徐路琼审核者：马丽琼
xx年1 月1日