细胞计数仪怎么操作
细胞计数仪怎么操作
你知道细胞计数仪怎么操作呢?很多研究人员都在使用血球计数器，使用起来不方便，而自动的细胞计数仪使用方便，时间短，那么你知道细胞计数仪怎么操作吗?一起来看看。
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细胞计数仪怎么操作
1、细胞计数仪怎么操作
1.1、将计数板及盖玻片擦拭干净,并将盖玻片盖在计数板上。
1.2、轻轻吹打细胞悬液,使细胞均匀分布;吸出少许细胞悬液滴在细胞入口,使细胞悬液充满盖玻片和计数板之间,静置1-2min,使细胞沉降;注意盖玻片下不要有气泡,也避免细胞悬液进入旁边的槽中。
1.3、在显微镜下对A/B/C/D四个大格内的细胞进行计数,压在大格四周边线上的细胞只计数压在2条边线上的细胞(如右侧和下方);若镜下有2个细胞组成的细胞团,则应按单个细胞计算;若细胞团数量较多,占细胞总量的10%左右,则说明细胞分散不好会导致计算不准确,需要重新制备细胞悬液。
1.4、按公式计数细胞数量:细胞数/mL=四个大格内细胞总数×104/4?(每一个大格的体积为长1mm×宽1mm×高
0.1mm=0.1mm3,1mL=1000mm3,因此计算时需×104)。
2、细胞计数仪的原理
2.1、电阻抗检测原理血细胞是相对不良导体,当血细胞悬浮电解质中,将小孔管插入细胞悬液,使其管内充满稀释液,当一个细胞通过小孔时,瞬间引起电压变化出现一个脉冲信号,细胞体积越大,引起脉冲越大,产生脉冲振幅越高。
2.2、流式细胞术加光学检测原理利用流式细胞术使单个细胞随着流体动力聚集的鞘流液在通过激光照射的检测区时,使光束发生折射、衍射和散射,散射光光检测器接受后产生脉冲,脉冲大小与被照细胞的大小成正比,脉冲的数量代表了被照细胞的数量。
3、白细胞分类原理
白细胞三分类原理:根据电阻抗法原理,不同体积的白细胞通过小孔时产生的脉冲大小有明显差异,仪器根据脉冲的大小将白细胞进行分群。标本中加入溶血剂,将红细胞溶解,仪器将从白细胞计数池中测量得到的大于35fl电子脉冲的数量作为白细胞计数。同时根据脉冲的大小将血内白细胞分为三群:小细胞群(35～90fl,主要为淋巴细胞)、中间细胞群(91～160fl,包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及幼稚细胞等)和大细胞群(161～450fl,以中性粒细胞为主)。
其特点是检测速度快,操作简便,可大大提高工作效率。此类仪器可用于常规检查标本白细胞分类的筛选,对仪器检测出的阳性标本应该进一步做显微镜检查。如有怀疑血液病的病人,即便仪器没提示异常,也应作血涂片,显微镜检查。
如何选购细胞计数仪
1、要考虑细胞计数仪的性价比:如果您的目的只是代替手工计数,节省操作者的时间,操作简便,完全没有必要花几十万买一台仅能进行细胞计数的仪器,花大钱办小事。
2、要考虑细胞计数仪的稳定性和重复性:如果您对细胞计数的准确性和重复性要求高,那仪器的高性能和稳定性是首要考虑因素,仪器的硬件以及配套软件的稳定都要考虑,不能一味的追求低价格。
3、要考虑根据细胞类型选择适合的型号:如果您的样本是原代细胞,背景复杂,红细胞和血小板污染严重,你又希望快速精确计数有核细胞且进行精确细胞活力分析,计数结果的准确性直接影响后续实验的成功和重现性。
4、要考虑实验室多功能检测需求:如果细胞计数和活力分析只是实验室的部分需求,而实验室还要进行凋亡、细胞周期、GFP等功能检测,且实验室也无配套的仪器,那为实验室装备一款多功能的细胞计数仪是您的最佳之选。
使用细胞计数仪的注意事项
1、务必使分散成单个细胞,取样计数前,充分混匀细胞悬液。
2、显微镜下计数时,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分。
3、如果计数时细胞密度较大,数起来较麻烦也不容易计准,所以如果感觉细胞数量较多时,可以从细胞悬液中吸取10至100u1,用少量PBS稀释后再作计数。
4、注意盖玻片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
5、盖玻片要尽量擦干净,特别是不能带有纤维,否则会造成体积不准。另外四个大格中平均每个大格的细胞数宜在50-150左右,这样总数会比较准确。
Countstar+细胞计数仪操作手册
Countstar细胞计数仪操作手册 计数仪的标准操作程序和细胞计数和活率检测标准操作程序 一、启动Cedex XS 系统 1. 打开计数仪:按下计数仪上的ON/OFF按钮,按钮亮起蓝色光表示仪器已打开; 2. 打开Cedex XS 控制软件: ①打开配套电脑,进入Windows操作系统; ②双击桌面上的Cedex XS 图标,进入Cedex XS 控制中心; 3. 调节白平衡:首次安装Cedex XS系统或移动系统后必须调节白平衡。 ①把样品板支架拉出; ②点击Cedex XS 控制中心中的HWM键,打开硬件管理对话框; ③点击WHITE BALANCE键进行调节,结果将自动保存; ④调节完毕后关闭对话框。 二、细胞计数与活性测定 1. 样品制备 ①用培养基或PBS将样品稀释至细胞数不高于5×106/ml;
②使用0.2%台盼蓝染色(一般为10μl、1:1):台盼蓝对血清蛋白亲和力更强,若大量血清蛋白导致图像背景过暗,可以将样品离心,用无蛋白培养基或生理盐水悬浮细胞进行计数; ③将细胞悬液充分混匀; ④用移液枪取细胞悬液加入样品板,每槽10μl;可以一次测定八槽,也可测定单槽。 2. 进样:样品板有八个槽,一次可测定四个样品槽。 ①拉出样品板支架; ②加有样品方向朝里,将样品板放上支架; ③将支架推入计数仪,有少许卡扣感表示已就位:样品槽位置指示灯表示样品测定进程。 三、软件设置: 1. 打开测定界面:在Cedex XS 控制中心点击MEASURE键,进入测定界面; 2. 设置样品参数: ①在样品参数栏输入样品名(Reactor ID),可在下拉栏选择或手动输入,最多可输入21个字符; ②输入样品编号(Sample ID),最多21个字符;若样品名已存在,软件将自动延续样品编号,也可手动重新输入编号; ③软件将自动记录日期和时间,表明样品测定的实际时间;
迈瑞-BC-5380血液细胞分析仪标准操作程序资料
迈瑞-BC-5380血液细胞分析仪标准操作程序 适用于血液白细胞计数及分类，红细胞计数，血红蛋白，血小板计数，红细胞压积，红细胞体积分布宽度，平均红细胞血红蛋白含量，平均红细胞血红蛋白浓度，平均红细胞体积，血小板体积分布宽度、平均血小板体积和血小板压积等检验。 2 仪器设备试剂 BC-5380血液细胞分析仪专用试剂：M-53D稀释液；M-53LEO(I) 溶血剂；M-53LEO(II) 溶血剂；M-53LH 溶血剂；M-53 清洁液；M-53P 探头清洁液。所有试剂应参照试剂的使用说明进行保存。变质、超过效期的所有试剂不能使用。 3 仪器设备标本 原始样品采集、制备、处理、检验和存放见检验科相关规范。 4 仪器设备性能参数 BC-5380血液细胞分析仪一般资料见附件1；BC-5380血液细胞分析仪性能指标见附件2。 5 仪器设备环境要求，使用安全措施 5.1 仪器设备环境要求 5.1.1 空间安装要求 仪器应安装在稳固工作台上。在仪器两侧各保留至少1米的空间，以方便维护和保养。后部至少要有0.50米的空间，以防止阻碍热气的排放并保证主机后的液路管道不受挤压。将BC-5380血液细胞分析仪安放在通风良好、灰尘少的地方。避免在过热或过冷以及日光直射的环境中使用BC-5380血液细胞分析仪。保证操作台面以及主机下方有足够的空间放置稀释液、废液桶。 5.1.2 运行条件 环境温度要求：10℃～40℃。 环境相对湿度要求：10%～90%。 电源电压要求：100～240VAC，50/60Hz。 仪器设备周围应尽可能无尘、无机械振动、无污染、无大噪音源和电源干扰；仪器附近无强电磁干扰源以及电刷型电机、闪烁荧光灯和经常开关的电接触性设备；不应放在通风条件差、阳光直射的环境中，或热源及风源前。 5.2 仪器安全 在仪器设备上面和周围不要使用可燃性危险品，避免引起火灾和爆炸。 在电源打开状态下，禁止打开仪器前上面、侧面及背面面板，以免损害线路板；禁止触摸BC-5380血液细胞分析仪外壳里面的电子元件，尤其避免湿手触摸，以免造成电击。 仪器设备使用前，必须认真检查设备之间连接及外接线(件)是否正确、正常，电源插头是否正确插接，设备是否处于正常状态。实验过程中如遇水、电故障或中断，应立即关闭影响仪器设备安全的有关开关，并实施安全保护措施。 仪器设备的运输必须按BC-5380血液细胞分析仪使用说明书规定进行搬运，禁止鲁莽装卸，应避免倾斜，振动和碰撞。 如果标本、试剂溢出在分析仪上，立即擦掉并依照检验科相关规范处理。 5.3 人员安全 仪器设备中所有与病人的样品接触或有潜在性接触可能的表面与零件都视污染物。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
流式细胞仪的应用
流式细胞仪的应用
流式细胞仪的应用 姓名：学号：2002015002 单位：研究生二队专业：病理学与病理生理学对于一个毕业以后就从来没有进过实验室使用过各种尖端仪器的研究生来说，仪器分析这个课程对我来说显而易见是重要而又陌 生的，就像一个小孩到了游乐园一样，每一种仪器都很吸引我，好奇 心也驱使我特别想尽快操作一下这些仪器，唯一的遗憾是本课程课时 太少，不能把中心实验室的所有仪器都了解一遍。12月4号学习了 流式细胞仪的原理与基本应用方法，虽然没有操作过，但是我想对我 在本次课上的所学的内容做一下总结并谈谈对流式细胞仪的粗浅认 识，由于没有实际基础，不对的地方请老师多多谅解并纠正。 流式细胞仪（Flow cytometry）是对细胞进行分选和快速测的仪器。它可以将分散在液体中的各个细胞的物理性质，生物化 学特征等参数进行快速测量并根据所得参数范围对目的细胞进行分 选并存贮。这些参数可以包括每一个细胞的体积、细胞凋亡及所包含 的可标记的蛋白质或者核酸的快速定量等。与传统的细胞测量方法 （免疫荧光和免疫印迹）相比，其优缺点可总结如下表： 流式细胞仪免疫荧光免疫印迹 优点1、明确阳性细胞比 例 2、同时检测多种蛋 白表达 3、蛋白定量容易 4、速度快，灵敏度 高 5、阳性细胞的 相对数量 6、明确组织和细 胞内定为 1、检测整体 表达情况 2、蛋白定量 较容易 缺点不能在组织和细胞 内定位1、蛋白定量困难 2、仅检测局部表 达情况 1、不能组织或细 胞内定位 2、不能确定阳性 细胞比例
由上表可以看出，与传统的细胞检测方法相比，流式细胞仪具有无可比拟的技术优势和应用前景，甚至可以说流失细胞术完全能够推动医学科研的发展，是一个伟大的发明。 流式细胞仪的原理：将待测的细胞样品制作成单个细胞的混悬液，根据实验目的对需要检测和分选的细胞进行特异性荧光染色并放入样品管，在清洁气体的压力下进入流动室。流动室内含有鞘液，鞘液可以约束样品使之处在喷嘴中心以提高测量精度，并防止样品靠近喷孔壁以导致堵塞。在这种作用下细胞排成单列一个一个地在鞘液包裹下被喷嘴喷出形成液体流柱。流柱流经高度聚焦的激光束时被特异染色的细胞被激发而产生特异性荧光，荧光被检测系统检测并转变成电信号进入计算机分析系统而得到细胞的物理、生物特性。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉。 通过原理我们也可以很容易的得到流式细胞仪的基本结构和功能： 1、液流系统。流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。 2、激光系统。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。激光器又以氩离子激光器为普遍。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
最新流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓
将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
FACAria流式细胞仪操作程序
、准备工作 1，清洗偏转板，防止盐离子影响电荷加载，电流偏转。 1）用超纯水沾湿医用棉签，擦拭偏转板所有金属物件。再用干棉签擦干。 2）5ml 注射器吸超纯水，清洗缝隙。用滤纸先吸水，再用干棉签擦干。 2，鞘液桶加液 3, 喷嘴超声，喷嘴放入超纯水中，超声2min。用滤纸吸干水分，晾干。 二、开机启动 1, 启动电脑，密码BDIS,点开软件，无密码 2，机箱侧面依次打开总机开关，蓝色、红色激光。 3, 液流启动：Cytometer --- FiuidSetup 1 ）气路（透明管）、液路（蓝色管） ,从乙醇桶上拔下,插到鞘 液桶 2）闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置,旋转至12 点方向 3）取下闭合喷嘴 4）将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。 4, 喷嘴压力切换：菜单栏中Sort---SortSetup --- 70um （选择当前使用的喷嘴大小） 5, 液流调整：
点开电脑界面中70um图标栏里的Stream，从打叉状态变为打勾。查看是否都处于正常状态：1）打开仪器机箱，查看液流是否流到废液槽。如果偏离，拧开两边的螺丝，左右推动使液流到达槽内，拧好螺丝。 2）查看电脑界面，液流图像是否稳定，如果有黑白灰图片变化，用棉签擦拭偏转板上方 3）查看电脑界面，液流是否在中央，如果不是，可以手动调整仪器摄像头，或者重新插好喷嘴。 4）机箱中查看激光束是否完好通过，用干棉签挡住通过位置，如果看到激光射出，则正常。然后关闭主机箱外盖。 调整液流：通过调整振幅来实现。 1）振幅Ampl,数值调大，使液流断滴在上1/3处，即2滴连续液流。 2）频率Freg ，一般不动。 3）Gap：当喷嘴为70um时，数值一般为7、8、9。100um时，为10, 、11 、12。 4）当Ampl和Gap都稳定时，把实际值（后面）手动输入到确定值的框内（前面）。 5）点击StreamSpot ，锁死数值，保持液流稳定。 Dropl :实际值和确定值，变化幅度保持在10以内。 Gap：实际值和确定值，变化幅度保持3以内。此视为稳定液流。 三、手动调补偿： 样品：Negative （双阴管），FITC（单阳），PE（单阳）
自动细胞计数仪选购指南
自动细胞计数仪选购指南 (一)自动细胞计数仪选购指南——通用篇 除非你像猴哥那般火眼金睛，否则，利用血球计数板来数细胞绝对是一件痛苦的事情。浪费时间不说，关键是不准确，重复性也不好。若是有多个样本，那真是让人发疯。这时，自动细胞计数仪应运而生，带来了更高效更准确的细胞计数。 市场上有多个品牌的细胞计数仪，乍一看，好像都是经典三步曲：上样-插入-分析。如何选择一台最理想的细胞计数仪，让你只选对的，不选贵的。首先，想一想平时主要对哪些细胞计数，它们的大小在什么范围；其次，你需要什么样的细胞信息以及通量水平；你们实验室打算将多大一块地方奉献给细胞计数仪；最后，你打算花多少钱。 市场上大部分细胞计数仪都是基于染料，以台盼蓝为主，也有碘化丙啶（PI）。正常的健康细胞能够排斥台盼蓝，而当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与DNA 结合，使其着色，从而区分出活细胞和死细胞。有些细胞计数仪是基于电阻抗法，更简便，不需要使用台盼蓝染料，但也无法分辨活细胞与死细胞。 首先为你介绍两款热门的细胞计数仪。之后，还将介绍一些便携式的细胞计数仪和高通量的仪器，囊括了市场上近期推出的大部分细
胞计数仪。我们将提供详细的参数对比和特性介绍，以便您在选购仪器时能够方便地参考。 TC10自动细胞计数仪（Bio-Rad） 这款细胞计数仪是由Bio-Rad公司去年推出的。它的计数流程很简单，就是“上样-插入-结果”。首先将样品上样到计数玻片上，然后将玻片插入TC10细胞计数仪，计数自动开始，30秒内总细胞数和活细胞数就显示在屏幕上。仪器对细胞浓度的要求为5 x 104 -1 x 107细胞/ml。计数只需要10 μl悬浮或重悬的细胞，让珍贵样品得以保留。玻片上有两个室，每次能对2个样品进行计数。 有些细胞计数仪通过单个焦点平面来评估细胞活力，这样得到的结论可能不太准确，而TC10细胞计数仪对多个平面的每个样品进行打分。独特的自动对焦技术和图像分析算法在30秒内提供了准确且重复性高的细胞数量。Bio-Rad的产品经理认为这对于评估细胞活性尤为重要，因为焦点的差异可能显著影响结果。 TC10系统所能接受的细胞大小是6-50 μm，适合哺乳动物细胞及一些更小的生物，如浮游生物和孢子等。若你正在使用Bio-Rad 的Bio-Plex系统，那么还可以利用TC10对Bio-Plex的磁珠进行计数。 TC10能够提供下列结果：活细胞和死细胞浓度，总细胞浓度，细胞存活率，细胞的平均大小，细胞图像。通过USB接口，研究人
细胞数的测定(血球计数板的使用方法)
、目的与要求了解血球计数板计数的原理，学会测定细胞总数方法。 二、原理 用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的厚载玻 片，其上由四条槽构 成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即25X 16），但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为 1 mm则每一个大方格的面积为 1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片 与载玻片之间的高度为0.1mm,所以计数室的容积为0.1 mm3 实磴圈-石血球计弦板杓构jfi 三、血球计数板的使用方法 （一）菌悬液的制备为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5?10个酵母为 宜，可采用10倍系列稀释法。 （二）加菌悬液样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。由盖玻 片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。 （三）显微镜计数在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。当芽抱菌体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。 （四）计数时若使用刻度为25X 16 （大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻 细胞数的测定 D申決甌裕牧我
流式细胞仪的应用
流式细胞仪的应用 姓名：学号：2002015002 单位：研究生二队专业：病理学与病理生理学对于一个毕业以后就从来没有进过实验室使用过各种尖端仪器 的研究生来说，仪器分析这个课程对我来说显而易见是重要而又陌 生的，就像一个小孩到了游乐园一样，每一种仪器都很吸引我，好 奇心也驱使我特别想尽快操作一下这些仪器，唯一的遗憾是本课程 课时太少，不能把中心实验室的所有仪器都了解一遍。12月4号学 习了流式细胞仪的原理与基本应用方法，虽然没有操作过，但是我 想对我在本次课上的所学的内容做一下总结并谈谈对流式细胞仪的 粗浅认识，由于没有实际基础，不对的地方请老师多多谅解并纠正。 流式细胞仪（Flow cytometry）是对细胞进行分选和快速测的仪器。它可以将分散在液体中的各个细胞的物理性质，生物化学特征等参 数进行快速测量并根据所得参数范围对目的细胞进行分选并存贮。 这些参数可以包括每一个细胞的体积、细胞凋亡及所包含的可标记 的蛋白质或者核酸的快速定量等。与传统的细胞测量方法（免疫荧 光和免疫印迹）相比，其优缺点可总结如下表：
由上表可以看出，与传统的细胞检测方法相比，流式细胞仪具 有无可比拟的技术优势和应用前景，甚至可以说流失细胞术完全能 够推动医学科研的发展，是一个伟大的发明。 流式细胞仪的原理：将待测的细胞样品制作成单个细胞的混悬液，根据实验目的对需要检测和分选的细胞进行特异性荧光染色并 放入样品管，在清洁气体的压力下进入流动室。流动室内含有鞘液，鞘液可以约束样品使之处在喷嘴中心以提高测量精度，并防止样品 靠近喷孔壁以导致堵塞。在这种作用下细胞排成单列一个一个地在 鞘液包裹下被喷嘴喷出形成液体流柱。流柱流经高度聚焦的激光束 时被特异染色的细胞被激发而产生特异性荧光，荧光被检测系统检 测并转变成电信号进入计算机分析系统而得到细胞的物理、生物特性。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的：由喷嘴射出 的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路 判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液 滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当 作废液抽吸掉。 通过原理我们也可以很容易的得到流式细胞仪的基本结构和功能： 1、液流系统。流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光 学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是 液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用 下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周 后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装 有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
细胞自动计数仪
Countess?automated cell counter ?Comparable results to a hemocytometer 与血细胞计数器对比 ?Works with mixed populations of cells (mixed sizes) 适用于混合种群的细胞(混合大小) ?Can count cells with low viability 可以计数细胞 ?Consumable slides 消耗计数片 ?Slides individually wrapped for cleanliness 独立包装的清洁计数片?Requires the use of standard trypan blue solution 需要使用标准台盼蓝的试剂?Large touchscreen display 大触摸屏显示 ?Count takes ~30 seconds 需要30秒 ?Interactive experimental results manipulation 互动实验结果操纵 ?Gate according to size ?Zoom & navigate through image 变焦和浏览图像 ?View cell calls (live vs dead) 视图细胞调用(生活和死亡)?Modify results according to specific samples 根据特定的样本修改结果 TC10? Automated Cell Counter ?Comparable results to a hemocytomete 与血细胞计数器对比 ?Works with single populations of cell (single sizes) 适用于单种群的细胞(单一的大小) ?Has variable results counting cells with low viability 具有可变的结果计算细胞与低活性 ?Consumable slides 消耗计数片 ?Slides packed in slide box for convienience 计数框简便 ?Trypan blue solution needed for viability. No reagent for simple count 没有简单的计数试剂?Small display.Push button navigated 小显示器、按钮导航 ?Count takes ~30 seconds 需要30秒 ?Minimal experimental results manipulation 最小的实验结果操纵 ?View histogram 视图直方图 ?Zoom to single point on slide 缩放到单点滑动 ?Can not view call on individual cells 不能查看调用单个细胞 ?Can not optimize results after count 不能进行结果的优化
流式细胞仪操作方法
一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)
细胞计数仪怎么操作
细胞计数仪怎么操作 你知道细胞计数仪怎么操作呢?很多研究人员都在使用血球计数器，使用起来不方便，而自动的细胞计数仪使用方便，时间短，那么你知道细胞计数仪怎么操作吗?一起来看看。 文章目录 细胞计数仪怎么操作 1、细胞计数仪怎么操作 1.1、将计数板及盖玻片擦拭干净,并将盖玻片盖在计数板上。 1.2、轻轻吹打细胞悬液,使细胞均匀分布;吸出少许细胞悬液滴在细胞入口,使细胞悬液充满盖玻片和计数板之间,静置1-2min,使细胞沉降;注意盖玻片下不要有气泡,也避免细胞悬液进入旁边的槽中。
1.3、在显微镜下对A/B/C/D四个大格内的细胞进行计数,压在大格四周边线上的细胞只计数压在2条边线上的细胞(如右侧和下方);若镜下有2个细胞组成的细胞团,则应按单个细胞计算;若细胞团数量较多,占细胞总量的10%左右,则说明细胞分散不好会导致计算不准确,需要重新制备细胞悬液。 1.4、按公式计数细胞数量:细胞数/mL=四个大格内细胞总数×104/4?(每一个大格的体积为长1mm×宽1mm×高 0.1mm=0.1mm3,1mL=1000mm3,因此计算时需×104)。
2、细胞计数仪的原理 2.1、电阻抗检测原理血细胞是相对不良导体,当血细胞悬浮电解质中,将小孔管插入细胞悬液,使其管内充满稀释液,当一个细胞通过小孔时,瞬间引起电压变化出现一个脉冲信号,细胞体积越大,引起脉冲越大,产生脉冲振幅越高。 2.2、流式细胞术加光学检测原理利用流式细胞术使单个细胞随着流体动力聚集的鞘流液在通过激光照射的检测区时,使光束发生折射、衍射和散射,散射光光检测器接受后产生脉冲,脉冲大小与被照细胞的大小成正比,脉冲的数量代表了被照细胞的数量。 3、白细胞分类原理 白细胞三分类原理:根据电阻抗法原理,不同体积的白细胞通过小孔时产生的脉冲大小有明显差异,仪器根据脉冲的大小将白细胞进行分群。标本中加入溶血剂,将红细胞溶解,仪器将从白细胞计数池中测量得到的大于35fl电子脉冲的数量作为白细胞计数。同时根据脉冲的大小将血内白细胞分为三群:小细胞群(35～90fl,主要为淋巴细胞)、中间细胞群(91～160fl,包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及幼稚细胞等)和大细胞群(161～450fl,以中性粒细胞为主)。
流式细胞仪的原理及应用
山西大学研究生学位课程论文（2013 ---- 2014 学年第一学期） 学院（中心、所）：生物技术研究所 专业名称：微生物学 课程名称： 论文题目：流式细胞仪的原理及其应用 授课教师（职称）：崔晓东 研究生姓名：常姣 年级：研一 学号：201323001003 成绩： 评阅日期： 山西大学研究生学院 年月日
流式细胞仪的原理及其应用 姓名常姣专业微生物学 摘要本文简要论述了流式细胞仪( flowcyt ometry, FCM) 的工作原理, 并对其某些科学领域研究中的应用进行阐述, 包括在生物学、免疫学、临床学中的研究应用。 关键词 FMC；生物学；免疫学；临床学 流式细胞仪( fl o w c y to me tr y, F CM) 研制、发展、革新和应用领域的扩展，都是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的。近代流式细胞仪，由于单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要，尤其在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞凋亡、信号传导、R N A / D N A 的分析、细胞表面受体及特异性抗原的分析等领域发挥着独特作用，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。 1流式细胞仪的构成及工作原理 流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞制成单细胞悬液, 经荧光染料染色后加入样品管, 在一定气体压力下待测样品被压入流动室。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列, 依次通过检测区, 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后, 产生散射光和荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT) 接收。散射光分为前向角散射(forwardscatter, FSC) 和侧向角散射(sidescatter, SSC) 。前者主要反映被测细胞的大小, 后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等, 以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后, 经光电倍增管接收后转为电信号, 再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号, 以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来[1,2]。 流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 便会在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器中, 从而实现细胞分选[2]。 2流式细胞仪的应用 流式细胞术的应用，简单用一句话概括就是，凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域，因为最初这个技术就是为此目的而设计的。 2.1流式细胞仪在生物学中的应用 流式细胞仪在生物学中的应用越来越广泛,如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、分子免役学、植物学等等许多生物学基础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子及细胞分型等研究中的应用[3]。 2.1.1 对凋亡细胞的分析 细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象, 在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持
流式细胞仪操作方法
—、样品制备 1、取样（大约lx cells）,离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1 ml 70%的冷乙醇固定细胞，-20°C冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100|j 啲Rnase （GenScript试剂A）, 37°C水浴30min,然后再加入400』的PI染液（GenScript试剂B）,在4°C避光条件下孵ff30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2xl04cells, 二、上流式测细胞 1」、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属扌当板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow）,拧紧鞘液桶盖，安上金属扌当板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖, 检查所有管路是否妥善安責。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBYo如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS）,等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀責于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowce呻的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流岀）。结束后自动STANDBY, 5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis, X参数和丫参数分别取FSC-H、SSC-H （选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-onalysis, X 参数选择FL2-H 1024（此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光，本实验使用PI作为荧光染料，故选择FL2-H） Y Parameter Plot Source： |< Select File... X Parameter Mie：| Acquisition
细胞计数板使用方法.
细胞计数板使用方法 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： 1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。 2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算： 细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104 说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3 而1ml=1000mm3 （注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液） 细胞计数板的使用 血球计数板-基本构造 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用细胞计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 细胞计数板-使用方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见下图：即本格中计数细胞为3个。