基于16SrRNA_DNA分析的土壤微生物生态学效应_黄进勇

随着人们对环境问题的日益关注，从２０世纪７０年代开始，微生物生态学得到了迅速的发展［１．２］。传统的微生物生态学技术包括显微形态观察，选择性培养基计数，纯种分离和生理生化鉴定［３］等。但随着研究的深入，人们发现自然环境中存在的大多数微生物不可培养，传统的方法不能够满足微生物生态研究的需要，使微生物生态研究一直较为落后。近年逐步建立起来的１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ实验技术则为微生物生态学的研究提供了新的研究方法，建立了对难以培养的微生物和不依赖于培养的微生物生态学的研究方法，使关于微生物多样性、微生物种群分析、重要基因的发现、以及遗传物质在微生物之间或微生物与植物之间的水平转移对生态系统的影响等方面都取得很大进展，开辟了微生物生态学研究新的领域。

１微生物多样性研究

微生物多样性的研究是微生物生态学研究的基本内容，由于微生物具有生存环境多样，生长繁殖快，适应性强，代谢途径多样以及生活方式多样的特点，使得微生物分布广泛，变异快，种类多，通过对微生物多样性的研究，可以探知蕴藏其中的大量基因资源。因此对微生物多样性的研究，无论对于生态系统功能的完整理解还是对微生物资源的利用，都具有极其重要的意义［４］。但是，传统的分析方法是通过分离、培养和鉴定，需要一个非常复杂的形态特征鉴定和生理生化试验，这种方法试验周期长，工作量大，更重要的尽管是最复杂的组合，也难于将样品中的微生物全部分离，而且不能对分离物进行准确的鉴定，不能反映分离物之间的系统发育关系［５］。用分子生态学的方法可以直接从核酸水平对样品进行研究，通过提取样品中不同微生物的总ＤＮＡ，然后进行分析，避免了样品中微生物的丢失，样品序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和丰度。从而可以保证实验能更真实地体现研究对象的结构组成，因此分子生态学技术和研究策略在揭示自然环境中微生物多样性的真实水平及其物种组成上显示出了极大的优越性。

通过以土壤细菌１６ＳｒＲＮＡ基因的一段２６碱基变异区为基因标签，连接成基因标签串测序，用标签类

基于１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ分析的土壤微生物生态学效应

黄进勇，周伟

（郑州大学生物工程系，河南郑州４５０００１）

摘要：基于１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ分析的实验技术为微生物生态学的研究提供了新的研究方法，从而在微生物多样性、微生物种群分析、重要基因的发现以及遗传物质在微生物之间或微生物与植物之间的水平转移对生态系统的影响等方面都取得了很好的研究进展。

关键词：分子生态；微生物生态；１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ

中图分类号：Ｑ９３８文献标识码：Ａ

ＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＥｆｆｅｃｔｏｎＳｏｉｌＭｉｃｒｏｂｅｓｏｎｔｈｅＢａｓｉｓｏｆ１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡＡｎａｌｙｓｅｓ

ＨｕａｎｇＪｉｎｙｏｎｇ，ＺｈｏｕＷｅｉ

（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００１）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡｔｅｃｈｎｉｑｕｅｈａｓｏｆｆｅｒｅｄｔｈｅｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｔｏｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ．Ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ，ｓｏｍｅｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅｐｒｏｇｒｅｓｓｈａｓｂｅｅｎｍａｄｅｉｎｓｏｍｅａｓｐｅｃｔｓｓｕｃｈａｓｍｉｃｒｏｂｅｓｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｍｉｃｒｏｂｅｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｅｓ，ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｓｏｍｅｉｍｐｏｒｔｍｅｎｔｇｅｎｅｓ，ａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｎｅｃｏｓｙｓｔｅｍｏｆｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｍｏｖｅｍｅｎｔｏｆｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｐｒｏｐｅｒｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍｉｃｒｏｂｅｓｏｒｂｅｔｗｅｅｎｍｉｃｒｏｂｅｓａｎｄｐｌａｎｔｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｃｏｌｏｇｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ，１６ＳｒｉｂｏｓｏｍｅＲＮＡ／ＤＮＡ

基金项目：河南省自然科学基金资助项目（０５１１５３０４００）。

第一作者简介：黄进勇，男，１９６９年出生，河南周口人，博士学历，副教授，主要从事生态学、生物多样性研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｎｙｈｕａｎｇ＠ｚｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。

收稿日期：２００５－１２－１４。

型、频率和多样性指数在分子水平描述土壤细菌遗传多样性，分析了土壤中细菌遗传多样性与植被类型之间相关性，发现土壤细菌遗传多样性与土壤有机质、全氮含量等理化性质高度相关，不同的植被土壤理化性质差异决定细菌遗传多样性分化［６，７］。

通过直接从土壤中抽提总ＤＮＡ，并对ＤＮＡ中Ｖ－３可变区进行ＰＣＲ扩增，然后进行变性梯度凝胶电泳等对农田土壤微生物种类分布进行研究，陈灏等发现不同的农田土壤间细菌差异相当显著，同时他们通过对分离带的测序，进行了部分土壤微生物的系统分类，为农田土壤生态和高效氮肥的研究提供了新的实验依据［８］。

有学者用ＤＧＧＥ法分析了镉胁迫下稻田土壤微生物的多样性，发现土壤镉有效性的变化强烈影响土壤微生物基因多样性的变化，随着土壤中镉浓度的增加，对土壤中微生物基因多样性的影响也逐渐增强［９］。Ｔｏｒｓｒｉｋ等研究了挪威等地的森林土壤样品，通过提取样品中的总ＤＮＡ，然后用高压下将其剪接成分子量平均为４２０ｋＤ的ＤＮＡ片段，测定热复性过程，得到Ｃｏｔ１／２的值。结果显示，该土壤样品基因多样性是一般分离培养情况下得到的多样性的２００多倍，显示出分子生态学技术在微生物多样性研究中的优越性［１０］。Ｓａｌｌｅｓ等用设计的伯克氏菌属（Ｂｕｒｋｏｌｄｅｒｉｋ）特异性引物进行ＤＧＧＥ检测来分析两块草地中该属群落的多样性，揭示了主体与根际土壤样品中生物多样性的不同［１１］。

２微生物的分类和鉴定

微生物的分类和鉴定与动植物相比，存在着较大的弊端，一方面它形态较小，需要借助显微镜观察，另一方面自然界中还存在着大量的不能培养的微生物，这就给微生物的分类与鉴定带来极大的麻烦，而分子生态学的应用则正好为微生物分类提供了一个解决的途径。通过对提取样品中特定的核酸片段，然后进行序列分析或比对，从而对未知微生物进行鉴定，并进一步确定其分类地位。

采用细菌１６ＳｒＤＮＡ通用引物和ＰＣＲ扩增等方法，许飞等构建了南海南沙海区沉积物１６ＳｒＤＮＡ文库，并通过ＲＦＬＰ酶切分型对所获得的７０个克隆进行测序，通过构建序列同源性矩阵和系统发育树图，发现该海域沉积物中变形细菌是明显的优势类群，α－Ｐｒｏ－ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ是深海沉积物中所特有的类群，是深海沉积微生物中的标志类群。同时，作者从南沙海区获得的大多数１６ＳｒＤＮＡ序列，通过序列比对发现，所得的序列与发表在数据库中的１６ＳｒＤＮＡ序列表现出较大的差异，说明这些细菌在属种水平上完全不同，在这些未知种群中，蕴藏着目前还无法估量的资源，从而为开发利用这一特殊生态环境的微生物资源奠定基础［１２］。

Ｎｉｅｌｓｅｎ用ＤＧＧＥ法研究变质的生物磷去除反应器中微生物的多样性，通过序列分析切下的电泳带，发现了一类与已知种类无密切关系的γ－变形菌［１３］。中国学者徐平等用包含１６ＳｒＲＮＡ基因ｖ－２高变区在内的１２０ｂｐ长核苷酸序列，对３００多株已知该区段序列的链霉菌进行分析，得到较为完整的系统进化树，确定了他们的分类地位［１４］。

此外，通过对化学生物絮凝池活性污泥中优势菌种１６ＳｒＤＮＡ序列的分析，研究者发现这些优势菌种大多属于好氧菌群，而且基本上可以分为Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属和Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ属２大支［１５］。有人用ＤＧＧＥ法和纯培养法，对青海柯柯盐湖、茶卡盐湖底泥及周边土壤样品的细菌多样性进行了研究。结果显示，两个盐湖存在大量的未知细菌，分离到的纯培养仅占实有细菌的小部分。对１２个菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因克隆测序结果显示，其中一个属于Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属，其余菌株均属于Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科，分属于Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓａｌ－ｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ等６个属，从而确定青海盐湖确实存在大量的未知微生物［１６］。

３微生物在环境检测与修复中的作用

关于污染物对环境影响的生态效应，需要一个可被广泛采用并较准确的评价标准。由于微生物对环境的适应性强，在各种环境中普遍存在，能对环境的微小变化做出迅速反应，所以可用分子生态学的方法在分子水平对微生物区系变化进行分析，从而更准确更科学地对环境污染状况进行评估。此外，微生物在对环境的适应方面具有独特的优越性性，它能够迅速适应环境的变化并对不利的环境条件进行修复，使生态维持平衡。因此，用分子方法研究不同污染条件下的微生物，可以发现对特定污染物具有修复作用的微生物或基因资源，进而通过对特殊菌株的选育，或对这些基因资源进行开发利用，使其在污染物的修复中发挥独特优势，为环境修复工程提供良好的工具。

通过提取南极阿德雷岛沉积物柱状样各层次的总ＤＮＡ，利用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法，对沉积物中的细菌多样性及分布进行微生物生态系统已经受到了人类活了研究，发现大量与降解有机化合物相关的细菌，表明阿德雷岛受到人类活动的影响，但通过实验仅发现少量与重金属有关的菌株存在，说明该地区的重金属污染较轻，还没有严重影响微生物群落组成［１７］。

有学者通过１６ＳｒＤＮＡＶ３－ＰＣＲ／ＴＧＧＥ指纹图谱技术对一个焦化工业废水处理系统两个功能不同的曝气池活性污泥的细菌种群结构进行了动态分析。结合条带回收、克隆、序列测定等方法对ＴＧＧＥ条带的序列多态性和主要功能曝气池细菌种群多样性进行了探讨，以全面了解活性污泥处理系统细菌群落结构和功能动态变化关系，为实现对活性污泥优化操作奠定方法和理论基础［１８］。ＣｏｓｋｕｎｅｒＧ和ＣｕｒｔｉｓＴＰ于２００２年用ＦＩＳＨ技术原位鉴定了活性污泥中硝化细菌群落的组成和分布，为理解污水处理中氮素循环提供了重要的信息［１９］。

Ｄｕａｒｔｅ通过ＰＣＲ－ＤＧＧＥ研究取自含硫油浓度梯度污染的土壤和用含二苯噻吩石油处理的土壤小生态系的样品，结果显示，随着土壤中油含量的增加，分子群落轮廓中所检测带的数目减少，且含ＤＢＴ石油处理后的分子群落随时间逐步改变，而未处理的多半是稳定的，这为检测石油对土壤的污染状况提供了新的思路［２０］。

中国学者姚健等通过ＲＦＬＰ法对农用化学品污染的土壤微生物群落进行了分析，发现农用化学品的使用会改变土壤微生物群落ＤＮＡ序列组成，并对微生物ＤＮＡ序列多样性影响各不相同：在化肥污染条件下与无污染的土壤相比，土壤微生物生物量大大增加，而且化肥使微生物富集而一些物种丧失，而农药使微生物多样性增加［２１］。杨元根等通过对某一重金属污染土壤的微生物ＤＮＡ进行ＤＧＧＥ电泳，其电泳谱带显示，与ＤＮＡ标志物相比，土壤样品微生物的ＤＮＡ片段谱图明显不同，反映了它们之间ＤＮＡ基因型的显著差异；而不同土壤样品间ＤＮＡ反映出来的ＤＧＧＥ谱带却非常一致，说明其微生物在ＤＮＡ上没有显著的改变，反映了该地区土壤中重金属的积累并没有导致土壤微生物在基因上的损伤［２２］。

４微生物与植物相互关系的研究

微生物与植物在长期的共同进化过程中形成了紧密的联系，对维持植物生态系统的健康发展具有重要的意义。土壤中的微生物通过对土壤中的矿物质进行矿化，可以促进植物对矿物营养的吸收，有利于植物的生长。用分子生态学方法对土壤中优势微生物进行研究，可以通过利用微生物来提高植物的养分利用率，从而提高种植作物的产量，并避免施用化肥给土壤造成的伤害。微生物还与一些植物存在共生，尤其是一些固氮微生物，研究它们之间的相互作用可以推动微生物固氮的研究。微生物尤其是一些真菌与植物的疾病有密切关系，造成植物病害，影响农业生产。分子生态学方法的引入，使人们可以在分子水平上研究它们之间的相互关系，探究其作用机理，从而从本质上解决困扰作物种植的诸多问题。因此，微生物与植物相互关系的重要性使其成为当前微生物生态学与资源研究的重要课题。

用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ法分析体缺乏状态下和铁充足条件下，大麦根不同部位的细菌群落，结果显示根际的不同部位的细菌群落的不同部位有很大不同，并且根际群落可因植物营养状况的变化引起根渗出物组成的变化而改变［２３］。

刘晓云和陈文新通过对三叶草、猪屎豆和含羞草的根瘤菌１６ＳｒＲＮＡ－ＲＦＬＰ分析和数值分类研究发现来自同一宿主植物的根瘤菌有的可归在同一类群，有的可归在不同的类群，而来自不同宿主植物的根瘤菌有的也可归在同一类群，说明三叶草、猪屎豆和含羞草根瘤菌具有遗传多样性，同时说明根瘤菌种的划分与宿主没有专一关系［２４］。

５结语

基于１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ分析的土壤微生物生态学研究方法，在国内还处于起步阶段，但借助于标记基因的ＰＣＲ扩增技术以及ｒＲＮＡ和ｍＲＮＡ为靶序列，ＤＧＧＥ技术能够再现微生物群落多样性，获得微生物在时间和空间上的动态信息。由于该方法重现性强、可靠性高、速度快、能够弥补传统方法分析微生物群落的不足，已成为前述微生物多样性、分类与鉴定、环境检测与修复、研究微生物与植物之间的相互关系等现代微生物学领域一种重要的研究手段。但该方法在分析微生物种群差异方面，如果细菌存在多个ｒＲＮ操纵子，或者利用简并性引物在ＰＣＲ中获得的双链ＤＮＡ片段，则可能夸大群落差异和扩大群落的多态性。可见，该方法仍存在一定的局限性，在研究中仍需要考虑到各种因素或情况。

参考文献

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１０ＴｏｒｓｒｉｋＶＬ，ＧｏｋｓｏｙｒＪ，ＤａａｅＦＬ．ＨｉｇｈｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎＤＮＡｏｆｓｏｉｌｂａｃｔｅ－ｒｉａｌ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，５６（３）：７８２￣７８７１１ＳａｌｌｅｓＪＦ，ＳｏｕｚａＦＡ，ＶａｎＥｌｓａｓＪＤ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｔｈｏｄｔｏａｓｓｅｓｓｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｕｒｋｏｌｄｅｒｉ－ａｌｓｐｅｃｉｅｓｉｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，６８（４）：１５９５￣１６３０

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１９ＣｏｓｋｕｎｅｒＧ，ＣｕｒｔｉｓＴＰ．Ｉｎｓｕｉｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｉｆｉｅｓｉｎａｎａｃｔｉｖａｔ－ｅｄｓｌｕｄｇｅｐｌａｎｔ：ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉ－ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，９３：４３１￣４３７

２０Ｄｕａｒｔｅ，Ｇ．Ｆ．，Ｒｏｓａｄｏ，Ａ．Ｓ．，Ｓｅｌｄｉｎ，Ｌ．ｅｔａｌ．．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＢａｃｔｅｒｉａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎＳｕｌｆｕｒｏｕｓ－Ｏｉｌ－ＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＳｏｉｌｓａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｐｅｃｉｅｓＣａｒｒｙｉｎｇＤｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈ－ｅｎｅＤｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ（ｄｓｚ）Ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，６７：１０５２￣１０６２

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２３ＹａｎｇＣＨ，ＣｒｏｗｌｅｙＤＥ．Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｒｏｏｔｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｐｌａｎｔｉｒｏｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓｔａｔｕｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，６６（１）：３４５￣３５１

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（责任编辑：回文广）