植物根际土壤中稀有放线菌的选择分离及生物活性-厦门大学学报

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201604056

鹭宁两地植物根际土壤中放线菌的多样性分析及抗菌等生物活性评估

王霏1，黎丹1，黄耀坚1，邓贤明1，吴莹莹2*

（1.厦门大学生命科学学院天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，福建厦门361005；2. 上海市农业科学院食用菌研究所，上海2 01406）

摘要：为探究不同地区植物根际土壤中可培养放线菌的多样性，筛选具有抗菌及抗肿瘤活性的药源菌株，本研究采用改良聚乳酸-明胶和海藻糖-脯氨酸两种培养基，选择分离采自厦门市翔安区香山风景区、南京中山植物园及南京玄武湖公园的17份植物根际土壤样品中的放线菌，并进行16S rRNA基因鉴定、系统发育分析及抗菌、抗肿瘤生物活性测定. 共分离到178株放线菌，其中链霉菌151株，其余27株为稀有放线菌，占总数的15.2%. 稀有放线菌包含9个属：微杆菌属（Microbacterium）、拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis）、韩国生工菌属（Kribbella）、野野村氏菌属（Nonomuraea）、小单孢菌属（Micromonospora）、链孢囊菌属（Streptosporangium）、拟孢囊菌属（Kibdelosporangium）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium）和栖白蚁菌属（Isoptericola），包含2株新种. 对分离得到的所有放线菌进行液体小量发酵，并测定其发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性. 结果显示，所测定的178株放线菌中，有82株对一种或多种指示菌表现出抗菌活性，占供测菌株的46.1%；有60株对一种或多种肿瘤细胞具有抑制作用，占供测菌株的33.7%. 研究结果表明植物根际土壤中放线菌资源丰富，其中抗菌和抗肿瘤活性显著的菌株可为后续微生物药物研发提供有利资源.

关键词：放线菌；选择分离；系统分析；活性测定

中图分类号：Q 939 文献标志码：A

放线菌是天然药物的重要来源，目前临床及农业上使用的抗生素中，超过60%是放线菌产生的[1]. 自1944年美国放线菌学家Walksman[2]从灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中发现链霉素以来，大量新型抗生素被陆续从放线菌中分离得到，其中大部来自链霉菌，约占自然界来源抗生素总数的45%，另有16% 来自非链霉菌属的放线菌[3]. 随着对链霉菌资源的

开发，从其中发现结构新颖的活性物质的几率不断下降. 近年来，人们逐渐将探索的目光转向非链霉菌属的放线菌，即稀有放线菌[4]. 稀有放线菌产生的生物活性物质结构类型丰富，包含大环内酯类、氨基糖苷类、肽类、蒽环类、氧杂蒽酮类等[5-6]，其中如抗MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的万古霉素（vancomycin）、替考拉宁（teicoplanin）、道古拉宁（dalbavancin），治疗细菌感染的庆大霉素（gentamicin）、红霉素（erythromycin），抗结核杆菌的利福霉素（rifamycin）、卷曲霉素（capreomycin），以及降糖药阿卡波糖（acarbose）等已经成功应用于临床[7].

植物根际土壤是微生物的重要栖息地，它是由植物、土壤和微生物共同构成的一个微环境，三者之间相互作用、相互影响. 研究结果表明，植物根际土壤中的微生物多样性比非植物根际土壤中的丰富[8]. 根际微生物的代谢活动对于整个微环境中的碳循环、磷循环、植物固氮作用、调节植物根际微环境以及土壤中废物和毒素的清除都起到十分重要的作用[9]. 不同微生物在与植物和土壤进行相互作用的过程中，可能导致植物根际土壤的有机质含量、酸碱度等产生细微的差异，并反过来影响微生物的群落组成[10]. 放线菌在植物根际土壤微生物类群当中占有极其重要的地位，如在玉米等农作物的根际土壤中，放线菌属于优势菌，其含量仅次于变形杆菌[9]. 因此，本研究选择采集自两个地区的植物根际土壤样品作为放线菌的分离源，对分离到的放线菌菌株进行分类鉴定和多样性分析，并对其进行抗菌和抗肿瘤活性筛选，旨在了解植物根际土壤中放线菌的多样性，挖掘新的稀有放线菌分类单元，并获得可用以活性物质分离的药源菌株，为后续微生物药物资源的开发奠定良好基础.

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 样品来源

植物根际土壤样品由研究人员分别采集自福建省厦门市（2012年10月）和江苏省南京市（2012年11月）. 其中以X开头的9份样品采自厦门市翔安区香山风景区（N 24°37′45.84″，E 118°17′56.73″），分别为植物飞扬草（Euphorbia hirta L.）、榕树（Ficus microcarpa Linn.

f.）、红薯（Ipomoea batatas （L.）Lam.）、鬼针草（Bidens pilosa L.）、马樱丹（Lantana camara L.）、阴香（Cinnamomum burmannii）、紫茉莉（Mirabilis jalapa L.）、红花檵木（Loropetalum chinense var .rubrum）和凤凰木（Delonix regia）的根际土壤；以N开头的8份样品采自南京，分别为中山植物园（N 32°03′10.48″，E 118°49′40.66″）中水杉（Metasequoia

glyptostroboides）、桫椤（Alsophila spinulosa）、鹅掌楸（Liriodendron chinense）和金钱松（Pseudolarix amabilis （Nelson）Rehd.）的根际土壤，以及玄武湖公园（N 32°04′27.36″，E 118°47′19.58″）植物罗汉松（Podocarpus macrophyllus）、枫杨（Pterocarya stenoptera C. DC）、朴树（Celtis sinensis Pers.）和喜树（Camptotheca acuminata.）的根际土壤.

1.1.2 主要试剂和仪器

提取放线菌基因组DNA所用的溶剂按照《分子克隆实验指南》[11]进行配制. PCR所用的dNTP Mixture、Taq酶及琼脂糖凝胶电泳所用DNA Marker等购于宝生物工程（大连）有限公司公司. Beckman高速冷冻离心机购于美国Beckman公司，Tprofessional型PCR仪购于德国Biometra公司，Tanon GIS-2009型凝胶图像分析系统购于上海天能科技有限公司，DYY-8C型电泳仪购于北京六一仪器厂.

1. 2 放线菌的分离方法

1. 2. 1 样品预处理

参考姜怡等[4]的方法，将采集好的土样分别摊开于通风处自然风干20~30 d（视土样湿度而定），用研钵将其研细，之后用200目的筛子过筛，收集至自封袋，妥存. 称取1 g样品装入盛有9 mL无菌水和小玻璃珠的50 mL无菌离心管中，摇床充分振荡后制成10-1稀释液，再以相同方法制备土壤样品的10-2和10-3梯度稀释液，用于涂布选择分离培养基.

1. 2. 2 选择分离

分别使用改良聚乳酸-明胶（PLA-G）[12]和海藻糖-脯氨酸（YIM 212）[13] 2种培养基对土样进行放线菌的选择性分离. 均加入重铬酸钾、制霉菌素、放线菌酮至终浓度50 mg/L，加入萘啶酮酸至终浓度为25 mg/L. 涂布平板，倒置于28℃恒温培养箱中培养14~21 d后，挑取单菌落于高氏一号平板进行纯化.

1. 3 放线菌的鉴定

1. 3. 1 形态分类排重

根据在固体培养基上的生长的菌落形状、颜色、是否产孢子、是否产可溶性色素等方面对所分离到的菌株进行形态分组.

1. 3. 2 16S rRNA基因扩增及序列分析

将纯化后的菌株接种至25 mL 胰蛋白胨大豆肉汤-酵母提取物（TSBY）液体培养基中，于28 ℃，220 r/min摇甁培养3~4 d. 采用吴莹莹等[14]的方法提取各菌株的基因组DNA. 采用通用引物27 F和1492 R扩增菌株的16S rRNA基因，并送至上海英潍捷基公司进行序列

测定，用于系统分类研究. 测序结果提交在线分析网站EzTaxon-e （https://www.360docs.net/doc/4514683149.html,/eztaxon）进行相似性搜索，获得同源性相近的菌种序列. 运用MEGA6.06[15]的Neighbor-Joining 法构建系统进化树[16]，确定放线菌的分类地位. 对于最近似菌株的序列相似度低于98%且分类地位独特者，以TaKaRa公司的高保真酶对16S rRNA 基因再次扩增测序.

1. 4生物活性实验

1. 4. 1 放线菌发酵粗提物的制备

采用酵母-麦芽提取物（ISP 2）[17]液体培养基进行发酵，每株菌发酵200 mL，于28 ℃，220 r/min发酵培养7 d. 乙酸乙酯萃取发酵液2遍，萃取液用旋转蒸发仪45 ℃减压浓缩成膏状物，称重后以甲醇定容至20 mg/mL，作为活性测定的母液.

1. 4. 2抗菌活性实验

采用滤纸片法[18]对分离得到178株放线菌的小量发酵粗提物进行抗菌活性测定. 指示菌包括金黄色葡萄球菌A TCC 25923（Staphylococcus aureus ATCC 25923，简称S.a）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 9372，简称 B.s）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus CMCC63202，简称B.p）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus ACCC 41016，简称M.l）、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，简称M.t）、大肠杆菌（Escherichia coli A TCC 25922，简称E.c）、黑曲霉（Aspergillus niger ACCC 30005，简称A.n）和白色假丝酵母（Candida albicans As 2.538，简称C.a）.

1. 4. 3 抗肿瘤活性实验

抗肿瘤活性采用噻唑兰(MTT)法[19]检测. 分别选用人胃腺癌细胞BGC-823、人肝癌细胞HepG-2、人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549四株肿瘤细胞作为指示细胞株，粗提物样品的测定终浓度为50 μg/mL. 传代培养肿瘤细胞至浓度约为6×104个/mL. 样品孔及阳性、阴性对照孔内各加入80 μL细胞悬液，空白对照孔加入80 μL培养液. 每个样品进行三组平行测定. 置于37 ℃，1.5% CO2培养箱内培养24 h，加入待测样品. 于37 ℃继续培养72 h，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 溶液. 反应3~4 h，加入100 μL MTT终止液. 9~12 h后，用酶标仪测定OD值（波长595 nm），并计算样品对肿瘤细胞的抑制率.

2结果和分析

2. 1不同培养基的分离效果

使用2种选择培养基，经分离纯化共得到178株放线菌. 其中148株分离自PLA-G 培养基，占分离总数的83.1%. 观察发现，PLA-G 分离平板上的放线菌数量和种类都比较丰富，且细菌和真菌等杂菌污染较少. 经16S rRNA 基因鉴定，有26株为稀有放线菌，比例为17.6%. 30株分离自YIM 212培养基，占总数的16.9%，其中仅1株为稀有放线菌，占3.3%. 在相同培养条件下，同一份土样在 YIM 212分离平板上长出的放线菌数量较少且种类单一，并且出现较大范围的细菌污染，说明该培养基对放线菌的选择性较弱.由此可见，PLA-G 培养基对于放线菌的筛选效果优于YIM 212培养基，稀有放线菌的出菌率也较高.

2. 2 放线菌的多样性

178株放线菌中，107株分离自厦门香山的土壤样品，占总数的60.1%. 其中22株（20.6%）为稀有放线菌，分布于拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis ）、微杆菌属（Microbacterium ）、韩国生工菌属（Kribbella ）、野野村氏菌属（Nonomuraea ）、小单孢菌属（Micromonospora ）、链孢囊菌属（Streptosporangium ）、拟孢囊菌属（Kibdelosporangium ）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium ）和栖白蚁菌属（Isoptericola ）9个属. 71株分离自南京的土壤样品，占总分离数的39.9%，其中5株（7.0%）为稀有放线菌，分布于微杆菌属（Microbacterium ）、小单孢菌属（Micromonospora ）和链孢囊菌属（Streptosporangium ）3个属（图1）.选取分离所得放线菌各个属的代表菌株及其同属的标准参考菌株，构建16S rRNA 基因系统进化树，结果如图2所示. 进一步采用多相分类的方法对可能属于新分类单元的2株稀有放线菌XMU 506T （原始编号X5-6）和XMU706T （原始编号X7-6）进行新种鉴定，将其分别命名为马樱丹拟孢囊菌（Kibdelosporangium lantanae ）[20]和紫茉莉韩国生工菌（Kribbella mirabilis ）[21].

3040

t i n o m y c e t e s / (s t r a i n s )

PLA 培养基YIM 212培养基

注：Mba、Kri、Nom、Amy、Mon、Spo、Kib、Cel、Iso、Str分别表示微杆菌属、韩国生工菌属、野野村氏菌属、拟无枝菌酸菌属、小单孢菌属、链孢囊菌属、拟孢囊菌属、纤维菌属、栖白蚁菌属、链霉菌属.

图1 厦门地区(a)和南京地区(b)植物根际土壤放线菌选择分离结果

Fig. 1 Selective isolation of actinomycetes from Xiamen (a) and Nanjing (b) rhizosphere soil samples

图2 根据16S rRNA 基因序列构建的植物根际土壤放线菌菌株系统进化树

Fig. 2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences showing the diversity

of actinobacteria isolated from rhizosphere soil Streptomyces olivaceus NRRL B-3009T (JOFH01000101) N2-4 (KT443806) Streptomyces somaliensis NBRC 12916T (AB184243) N1-24 (KT443800)

Streptomyces glauciniger NBRC 100913T (AB249964)

N1-1 (KT443793) X4-8 (KT581288) Nonomuraea roseoviolacea subsp roseoviolacea ATCC 27297T (AB039959)

Nonomuraea bangladeshensis JCM 13930T (AB274966)

Kibdelosporangium phytohabitan KLBMP 1111T (HM153787) Kibdelosporangium philippinens DSM 44226T (AJ512464)

Kibdelosporangium lantanae XMU506T (KJ786942)

Kibdelosporangium aridum subsp argum DSM44150T (AJ512463)

X3-25 (KT581282) Streptosporangium canum HBUM 170018T (AJ512463)

Kribbella antibiotica YIM_31530T (AY082063)

Kribbella mirabilis XMU 706T (KM189813) Kribbella swartbergensis DSM_17345T （FN643223） Kribbella catacumbae DSM 19601T (AQUZ01000130)

Micromonospora endolithica DSM_44398T (AJ560635)

Micromonospora chersina DSM_44151T (X92628)

N5-4 (KT443821)

X1-15 (KT581264)

Isoptericola nanjingensis H17T (HQ222356)

N1-35 (KT443802)

Microbacterium trichothecenolyticum DSM 8608T （JYJA01000006）

N1-2 (KT443794)

Microbacterium pseudoresistens CC-5209T (FJ865214)

X6-36 (KT581320)

Cellulosimicrobium funkei ATCC BAA-886T (AY501364)

Amycolatopsis tolypomycina DSM_44544T (AJ508241) X2-6 (KT581268)

Amycolatopsis bullii SF27T (HQ651730)

Paracoccus fistulariae KCTC 22803T (GQ260189)

100 82 99 75 100 99 100 88 99 99

79 64

85 99 99

2. 3 生物活性测定

抗菌活性测定结果显示，有82株放线菌对至少一株指示菌具有抑制作用（抑菌圈直径≥6 mm），占供测菌株总数的46.1%. 其中37株对一种或多种指示菌具有较强的抑制作用

（抑菌圈直径≥9 mm），占总供测菌株的20.8%（表1），包含8株稀有放线菌，分别为微

杆菌属（Microbacterium）2株、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）3株、野野村氏菌属

（Nonomuraea）2株、链孢囊菌属（Streptosporangium）1株. 其中，编号为X2-6、X2-10

的2株拟无枝菌酸菌和编号为X3-25的链孢囊菌对多种指示菌都有显著的抑菌作用（抑菌

圈直径>15 mm），其抗菌活性优于大多数链霉菌属菌株. 所分离到的放线菌主要对革兰氏

阳性细菌表现出抑制作用，其中抗枯草芽孢杆菌的菌株数目最多；对供测的革兰氏阴性细菌

几乎没有抗性，少部分菌株对真菌具有抑制作用.

表1 178株植物根际土壤放线菌的抗菌活性

Tab. 1 Antimicrobial activity of the 178 isolated actinomycetes

抑菌圈直径活性菌株数（比例/%）

不同指示菌的抗性菌株数（比例/%）

B.s S.a B.p M.l M.t E.c A.n

C.a

直径≥6 mm

(46.1)

(30.3)

(28.7)

(25.8)

(12.9)

(0.0)

(8.4)

(5.1)

直径≥9 mm

（20.8）

(19.1)

(14.0)

(13.5)

(10.1)

(6.7)

(0.0)

(4.5)

(2.2)

采用MTT法进行抗肿瘤活性测定的结果显示，所分离的放线菌中有60株对至少一种肿瘤细胞株具有抑制作用（抑制率≥50%），占供测菌株总数的33.7%. 其中，对一种或多种指示细胞株表现出较强抑制作用（抑制率≥90%）的有23株，占供测菌株总数的12.9%（表2），包含2株稀有放线菌，分别为野野村氏菌属（Nonomuraea）1株和韩国生工菌属（Kribbella）1株.

表2 178株植物根际土壤放线菌的抗肿瘤活性

Tab. 2 Antitumor activity of the 178 isolated actinomycetes

肿瘤细胞株抑制率活性菌株数（比例/%）

不同肿瘤指示细胞株的抗性菌株数（比例/%）

BGC-823HepG-2MCF-7A549

抑制率≥50%

(33.7)

(30.3)

(28.7)

(25.8)

抑制率≥90%

(12.9)

(19.1)

(14.0)

(13.5)

(10.1)

3 讨论

选择合适的培养基对于选择分离稀有放线菌具有重要意义. 碳源是培养基的基本成分之一，寻找特殊的“稀有”碳源对于稀有放线菌的选择分离尤为重要. 采用聚乳酸（PLA）作为分离培养基的碳源进行放线菌的选择分离已有不少相关报道，大多数研究中采用的都是乳化PLA的方法[22-25]. 例如Jarerat[26]通过往PLA中加入氯仿使其乳化，然后真空抽干有机溶剂，制成PLA薄膜，再将其倒入基础培养基. 本研究对上述方法进行了改进，利用搅拌机将PLA颗粒直接打碎成粉末状，以此代替乳化处理方法，再将PLA粉末和明胶分别按0.1%的比例加入基础培养基当中配制PLA-G培养基. 采用PLA-G培养基从不同来源的植物根际土壤中共分离得到148株放线菌，且稀有放线菌出菌率高，分离效果远优于YIM 212培养基及已乳化PLA培养基. 由此说明，采用机械粉碎的PLA作为碳源制备的PLA-G培养基是优于YIM 212选择分离植物根际土壤中稀有放线菌的一种优良培养基.

对本研究分离得到的178株放线菌进行16S rRNA基因序列分析结果表明，所有放线菌分布于7个科，10个属当中，呈现出良好的多样性. 其中107株分离自厦门市翔安区香山风景区的植物根际土壤样品，包含2株稀有放线菌新种，分离效果优于南京采集的土壤样品，尤其是稀有放线菌的多样性较为丰富. 香山风景区位于厦门市翔安区东南部，坐落于鸿渐山脉南麓的生态保护区和自然景观保护区，该地区植被繁茂，生态环境大多保持原始自然状态；南京中山植物园和玄武湖公园属于旅游观光景区，生态环境受人类活动的影响较大.由此可见，未经开发或自然生态环境保持较好的生态系统，其植物根际土壤也保持着较原始的状态，所以其中可能蕴含着更丰富的微生物资源.

抗菌及抗肿瘤活性测定中，对至少一种指示菌和至少一种肿瘤细胞株具有抑制作用的活

性菌株分别占供测菌株的46.1%和33.7%，进一步证明了所分离放线菌的次级代谢产物中可能蕴含着活性良好或结构新颖的化合物，具有极大的开发潜力，有待进一步深入研究.

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Phylogenetic Analysis and Biological Activity of Actinomycetes from Rhizosphere Soil in Xiamen and Nanjing Area, China

W ANG Fei 1, LI Dan 1, HUANG Yaojian 1,

DENG Xianming1, WU Yingying 2*

(1. State-Province Joint Engineering Laboratory of Targeted Drugs from Natural Products, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. National Engineering Research Center of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201406, China)

Abstract: This study aimed to investigate the diversity of actinomycetes from rhizosphere soil in different regions, and to screen the strains with antibacterial and antitumor activity. The 16s rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis were used to explore the diversity of actinomycetes, which were isolated from 17 rhizosphere soil samples with two selective media. Using 6 bacteria, 2 fungi and 4 tumor cells as indicator to determine the biological acticity of actinomycetes. A total of 178 actinomycetes were isolated from rhizosphere soil, including 27 strains were rare actinomycetes, accounted for total 15.2%. The rare actinomycetes can be assigned 9 genera, which are Microbacterium, Amycolatopsis, Kribbella, Nonomuraea, Micromonospora, Streptosporangium, Kibdelosporangium, Cellulosimicrobium, Isoptericola, and 2 strains of them were novel species. Among them, 46.1% strains had antibacterial activity against one or more indicator, 33.7% strains had inhibitory activity of one or more tumor cells. The results showed that rhizosphere soil was a highly diverse actinobacterial communities，many of which appear to be novel candidate species. The actinomycetes having biological activity could be a promising source for secondary metabolites separation and microbial pharmaceuticals development.

Key words: actinomycetes; selective isolation; phylogenetic analysis; bioactivity

植物内生菌的分离

植物内生菌的分离钱昆121140041 一、实验目的 1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。 2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。 3、了解微生物分子实验的基本操作流程。二、实验原理在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。但需要注意的是，同种细菌定殖于不同宿主植物可能对宿主植物产生不同的影响。除根瘤菌外，还有放线菌侵入多种被子植物宿主，形成根瘤的共生固氮体系。早在十九世纪后期，人们就发现了这类非豆科的根瘤，并发现根瘤内有生微生物，1881年布隆科斯特将它称为Frankia，但当时并不知道它是什么微生物。确定内

放线菌筛选的一般方法(1)

放线菌筛选的一般方法摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。放线菌是革兰氏阳性细菌。因菌落呈放线状而的得名。常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。关键词：放线菌筛选微生物 1 放线菌的情况放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。它是一个原核生物类群，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。 2 放线菌的培养基高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、 K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。高氏一号合成培养基需要K2HPO4?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾 0.25,MgSO4?7H2O 0.125g，FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后， 121℃灭菌20分钟。 3 土壤中放线菌的分离编号，分装取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。稀释倾注分离称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。 4 倒平板分离培养于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约

(推荐)植物病原菌的接种

实验五植物病原物的接种一、实验目的人工使病原物与寄主植物感病部位接触，创造条件使病原物侵入并诱致寄主发病叫接种，接种是证病过程的重要步骤，在研究寄生现象发病规律，测定品种抗病性，药剂防病效果时都需要接种。因此，接种是植病工作者必须掌握的基本技术环节。植物病害人工接种方法，是根据病害的传染方式和侵染途径设计的，植物病害的种类很多、其传染方式和侵染途径各异。因此接种方法也不相同。本次实验以玉米大斑病，小麦根腐病，小麦秆锈病，梨褐腐病等为内容学习常用的接种方法。二、内容、材料和方法 (一)拌土法(小麦根腐病) 拌土法适于土壤传染的病害，方法是将消毒的土壤分别装入两个小花盆中，其中一盆表层覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培养菌1份加消毒土5份混合而成，另一盆不接种(不覆菌土)作为对照。将经0.1%升汞表面消毒3分钟并用无菌水洗3次的小麦种子，分别播种在两个花盆内，插上标牌，注明接种日期，方法病害名称及接种人姓名，花盆放在室温下，浇水保湿，遮阴管理，待幼苗出土展开叶子后(大约一周)，观察并记载根腐病发生情况。 (二)喷雾法(玉米大斑病) 气流及雨水传播的病害常用此法接种，将培养好的玉米大斑病的斜面

菌种一支，用移植钩刮于装有100毫升无菌水的三角瓶中，用力振荡，待孢子洗下后，以纱布过滤，并于滤液中加入

0.1克中性肥皂，即成孢子菌丝悬液，用卫生喷雾器均匀喷布在麦苗上。同时设一不喷菌液而喷无菌水的作对照，用塑料罩保湿48小时，揭布后正常管理，7天后作发病调查。 (三)涂抹法(小麦秆锈病) 这也是气流传播的病害常用的接种方法，用于禾本科锈病接种。方法是用姆指沾锈菌夏孢子悬液自下向上轻轻涂欲接种的小麦叶片，也可先用手指沾水摩擦叶片，使叶表有一层水膜，然后将夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子悬液或孢子粉的作为对照。塑料罩保湿48小时后揭布，正常管理，7天后作发病调查。 (四)创伤接种法(白菜软腐病及梨褐腐病) 创伤接种法是伤口侵入的弱寄生菌常用的接种方法。 1.白菜软腐病：取切成适当大小的白菜帮两块、经水洗，待水稍干后，以10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在两个灭过菌的上下铺有吸水纸的培养皿中，用酒精擦过的玻璃棒顺着白菜帮打三排不穿透的孔穴。将培养好的白菜软腐病菌斜面菌种的菌苔以无菌水洗下作成菌悬液。然后，先以灭过菌的兽用注射器吸取无菌水滴于菜帮的第一排内孔作为对照，再用该注射器吸菌液滴于第二、三排孔内。注意无论无菌水、还是菌液都不要滴的过多。以免流出孔穴，另一培养皿的菜帮以同法处理作为重复。盖好皿盖，置于26—28℃的温箱中，24小时后检查发病情况。 2.梨褐腐病：取白梨以酒精火焰表面消毒后，用炽热的解剖刀，在其上切成小手指粗的孔穴3

植物内生菌DNA提取方法

在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。 1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。 2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。 3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。 4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。 5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。 6. 加入200μL 5M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。 7．取上清液，并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），彻底混匀，12000×g离心10 min。 8. 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次。 9. 上清液转移至新的无菌离心管中，加入0.6倍体积（0.6 vol）的冰冷的异丙醇，4℃放置1 h。 10. 4℃，12000×g离心10 min，弃上清。 11. 沉淀用70%冰乙醇清洗，离心，弃上清。 12. DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。 13. DNA纯化采用TIANquick Midi Purification Kit。

植物病原菌分离方法

病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作： 1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml （1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌 30min。 2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。四、实验步骤： 1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、取样，病斑大小约20个（含病缘线） 3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装 (3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离实验目的： 1 掌握配制合成培养基的一般方法。 2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、 KNO 3、NaCI、K2HPO 4?3H 2O、MgSO 4?7H 2O、FeSO4?7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3 、 NaCI 、 K2HPO 4?3H 2O 、MgSO 4?7H2O 作为无机盐， FeSO4?7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（1h1）0或加入某种抑制剂（如加数滴 10% 酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备

放线菌筛选的一般方法定稿版

放线菌筛选的一般方法 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】

植物病原菌分离方法

第四章植物病原菌分离与纯化植物病原菌一、植物病原菌分离流程二、分离的准备 ?分离的准备工作无菌室操作前保持清洁无菌接种工作准备培养基的准备 ?分离材料选择以收获的材料从病健交界处采样果实腐烂从开始腐烂处分离根腐和枯萎层可能从离土较远处分离

有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等发病后分离 ?组织表面消毒 ⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3 －5min；所需时间因材料不同而异，消毒后灭菌水3－5次附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸2 －3秒

⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使用。 ◆最好现配现用，放久失效，有效成分 CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。（3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别、姓名、操作

植物内生菌

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 1. 内生真菌从牧草中分离得到的内生真菌香柱菌，所产生的波胺碱和黑麦草碱类物质对昆虫具有杀伤作用，对牲畜等脊椎动物无毒。Strobel等从雷公藤的茎中分离得到一株内生真菌，能产生一种肽类抗生素Cryptocandin，它能抑制灰葡萄孢）等一些植物病原真菌，分离自同一内生真菌的一种新酰胺生物碱cryptocin对稻瘟病菌（及其他多种植物病原真菌有强的抑杀作用。纪丽莲等人从黄海海岸低盐药用植物芦竹中分离得到一株木霉属的内生真菌，它对黄瓜灰霉病菌有较强的抑菌活性。 2. 内生细菌从辣椒中分离出的一株内生枯草芽孢杆菌，该菌株分泌的抗菌多肽对热稳定，在中性PH范围较稳定，并抗紫外线照射，对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等多种植物病原真菌和细菌有强的抑制作用。 3. 内生放线菌链霉菌属于放线菌，它占具有生物活性的植物内生放线菌的绝大部分。澳大利亚Coombs研究小组从小麦根部分离的60多株放线菌中筛选到防治小麦全蚀病的菌株，在温室试验中可使小麦全蚀病的危害降低70%。Strobel等在蛇藤中分离到一株新的链霉菌，它能产生4种新的广谱抗生素Munumbicins A、B、C和D，这些抗生素对多种人体和植物致病霉菌、细菌及疟原虫具有广泛的抑杀活性。最近，Strobel等又从一种有叶蕨类植物中分离到一株新内生链霉菌，它能产生一种被称为kakadumycins的新型抗菌素，对炭疽芽孢杆菌和疟原虫均具有抑杀活性，其生物活性比棘霉素强。从卫矛科植物分离的内生链霉菌产生的新chloropyrrol抗生素对多种耐药性细菌和分枝杆菌有抑制活性。从杜鹃花植物中分离的链霉菌产生新的抗真菌物质fistupyrone，对植物病原真菌甘蓝黑斑交链格孢有抑制作用。李萌等从油菜和芹菜的茎和叶中分离得到215株内生菌，18株对蔬菜立枯丝核菌、直啄镰刀菌、苹果黑腐皮壳有很好的拮抗作用，其中有8株为放线菌；从油菜茎中分离出的内生放线菌CHSH19A经鉴定为一株链霉菌Streptomyces sp．，活性筛选结果证明其具有极强的抗立枯丝核菌活性。植物内生菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物。近年来，植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有农药活性的次生代谢产物，在自然界中具有重要的生态学作用，引起了人们广泛的关注并取得很大进展。从微生物中寻找发现新型先导化合物，是新农药研制的重要途径。内生菌作为微生物中的重要类群，其物种丰富，数量庞大，这为新农药的研究和开发提供了巨大的资源库。最近一个全面的研究显示，51%的从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，而从土壤微生物发现的新物质仅为38%。由此

分离植物内生真菌操作流程

分离植物内生真菌操作流程 1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物拍照留用于鉴定，并做好相关记录。（2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。 2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。 3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。（3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。（4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。 4.表面灭菌：在无菌操作台中进行（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管

放线菌的分离与筛选方法

放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。 1.拮抗放线菌的筛选方法： 1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。选择抑制活性强的复筛。 1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。 1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测

发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。 2.放线菌分离与筛选. 2.1培养基； 2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%） 3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。 2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基 2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)或另添加1-2ug/ml青霉素，可显著抑制细菌和真菌生长，不影响放线菌的数量和种类。 2.3靶标菌：枯草杆菌大肠杆菌金黄葡萄球菌八联球菌变形杆菌 2.4放线菌分离与筛选 2.4.1传统的分离筛选思路；以对某些如病原菌或杂草，昆虫为靶标的抑制和杀灭效果为标准筛选产生活性物质的放线菌，即筛选拮抗放线菌。初筛：将分离得到菌株进行真对靶标抑制活性筛选。优点：较早知道是否筛选到拮抗菌株，筛选范围广。缺点：方法粗放，

植物内生真菌的分离

植物内生真菌的分离一、实验目的 1．理解内生真菌存在的普遍性和多样性 2.掌握常规的微生物分离纯化方法 3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能二、实验原理植物内生真菌( Ｅnｄophｙte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系,因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌三、实验材料板蓝根新鲜健康的叶片试剂:次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素培养基：PDA培养基、分离培养基四、实验步骤（一)、配制PDA培养基 10月27号晚上：

(1）配置ＰDA培养基,用电子称称取去皮的土豆10０g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热,加入琼脂７.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至5０0毫升。 (2)准备1０瓶无菌水，每瓶150ml左右。 (3)包好烧杯,培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。 (二)、配制分离培养基 28号中午：（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用,另一份待高温灭菌后,加入青霉素１0０mg／L、链霉素200mg/L的混合液20mｌ，即得到分离培养基。（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板,注意在整个过程中保证无菌操作。 (三)、采集新鲜板蓝根叶片２8号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。(四)、植物组织表面消毒 2８号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段(片）做如下表面消毒处理:75%酒精漂洗3ｍin，无菌水冲洗4~5次,5％次氯酸钠溶液漂洗叶3ｍin,无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。（五）、接种并培养 28号晚上: (1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.５ｃm 2 小块,放入含

植物病原真菌的分离培养精选文档

植物病原真菌的分离培养精选文档 TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-

酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使

实验二_____土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。实验6土壤中放线菌的分离（实训）实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的

植物病原真菌的分离培养

实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。三、实验材料及准备： 1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要

土壤中放线菌的筛选即其抗菌谱的测定实验论文

实验论文土壤中产抗生素放线菌的筛选及抗菌谱的测定作者：天奇666666 2017 年06 月

目录摘要 (3) 1、引言 (4) 2、实验材料与方法 (4) 2.1材料 (4) 2.1.1 土壤样品 (4) 2.1.2 培养基 (4) 2.2 实验方法及步骤 (5) 2.2.1 放线菌的分离及最佳土壤稀释浓度的选择 (5) 2.2.2放线菌纯化培养 (5) 2.2.3 保存备用菌株 (5) 2.2.4 供试菌液配置 (5) 2.2.5进行拮抗试验 (5) 3、实验结果与分析 (6) 3.1实验结果表（表二） (6) 3.2实验照片 (6) 3.3实验结果分析 (7) 4、结论与讨论 (7) 4.1结论 (7) 4.2讨论 (7) 5、参考文献 (8)

摘要本次实验选取了学校八个采样点进行采样，通过土壤悬液稀释进行固体培养基涂布培养，分离纯化出对其他微生物有拮抗作用的放线菌，使用牛肉膏蛋白胨固体培养基和PDA培养基进行抗菌谱测定。本次实验以双管齐下的方式分别进行主实验与次实验，保证了实验重复性并极大节省了时间，实验过程分两批进行，主实验通过培养细菌与真菌菌液，涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基平板分离出了五珠无拮抗作用的放线菌，次试验通过点接的PDA培养基的方式分离出一株对枯草芽孢杆菌有抗性而对黑曲霉有轻微抗性的放线菌菌珠。关键词：土壤、放线菌、拮抗作用

1、引言土壤----作为生物生存一种基本的资源，其中蕴藏着巨大的微生物资源，特别是以能产生多样的次级代谢产物而著称的放线菌，研究土壤沉积微生物，不仅可以发现新的放线菌资源，同时也可能发现新型活性产物，在医药、食品、化工、环保等行业意义巨大。放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物, 目前从微生物中发现的大约 8 000 种生物活性物质中, 近 70 % 是由放线菌产生的。放线菌是一群革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% ) 的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。 2、实验材料与方法 2.1材料 2.1.1 土壤样品理工大西校区西门附近校区内随机取8个采样点,采样点的选择以农田土壤、经常疏松的的种植土壤以及含有机质较为丰富的为主。 2.1.2 培养基高氏合成一号培养基：溶液与试剂、可溶性淀粉、NaCI、KNO3 、K2 HPO4 3H2 O MgSO4 ．7 H2 O 、FeSO4 ．7 H2 O，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCI。仪器与其他用具：试管，锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，高压蒸汽灭菌器，PH试纸，棉花，牛皮纸，麻绳，纱布等牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏、蛋白胨、NaCl PDA培养基：新鲜土豆；琼脂；葡萄糖、电磁炉；锅（带盖）；漏勺；刀、烧杯纱布；玻璃棒；天平；称量纸；蒸馏水 2.1.3 供试菌种

植物根际土壤中稀有放线菌的选择分离及生物活性-厦门大学学报

植物内生菌的分离

放线菌筛选的一般方法(1)

(推荐)植物病原菌的接种

植物内生菌DNA提取方法

植物病原菌分离方法

土壤中放线菌的分离

放线菌筛选的一般方法定稿版

植物病原菌分离方法

土壤中放线菌的分离

植物内生菌

最新土壤中放线菌的分离与纯化

分离植物内生真菌操作流程

放线菌的分离与筛选方法

植物内生真菌的分离

植物病原真菌的分离培养精选文档

实验二_____土壤中放线菌的分离

植物病原真菌的分离培养

土壤中放线菌的筛选即其抗菌谱的测定实验论文