大型真菌分子遗传连锁图谱研究进展

刘伟肖扬边银丙*

华中农业大学应用真菌研究所武汉430070

A review of research advance of molecular genetic linkage map in macrofungi

LIU Wei XIAO Yang BIAN Yin-Bing*

The Institute of Applied Mycology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

大型真菌（macrofungi）中包括一些重要的食用真菌和药用真菌，在人类的经济生活中占有十分重要的地位（Chang & Miles 1989）。真菌学研究是生物学研究中的一个重要分支，但对大型真菌遗传学的系统研究目前仍集中在少数分类单元中，例如子囊菌中的链孢属Alternaria、Neurospora及担子菌中的鬼伞属Coprinopsis和裂褶菌属Schizophyllum （Peever et al. 1999；Nargang & Rapaport 2007；Kües 2000；Clark & Anderson 2004）。近年来，随着现代生物学研究技术和方法的飞速发展，真菌分子生物学研究也不断深入，在系统发育、遗传作图、基因定位、基因克隆及遗传转化等方面都有了长足的发展（Hamer & Givan 1990；Zhong et al. 2002；Fincham 1989）。

分子遗传连锁图谱（genetic linkage map）是基因组内反映基因以及专一性多态性DNA标记相对位置的图谱，能显示标记和基因在染色体上的相对位置，有利于更好地理解基因组结构和进化，是进行基因组系统研究的基础，也是遗传学研究的重要方向（Botstein et al. 1980；Marra et al. 2004；de Vos et al. 2007；Manzo-Sánchez et al. 2008；Xu et al. 2009）。遗传连锁图谱的构建以及建立在此基础上

的数量性状（quantitative trait loci）定位成为了现代遗传学研究中的热点（Lander & Botstein 1989；Liu et al. 2004；Fischer et al. 2004；Welter et al. 2007）。

1 大型真菌分子遗传图谱研究的现状

真菌遗传图谱的构建工作较高等动植物起步晚，研究基础相对落后，其构建方法主要参考高等动植物。构建过程包括：1）确定作图群体及亲本的组合；2）培养大量遗传标记处于分离状态的分离群；3）确定作图群体中不同个体基因型；4）选择合适的分子遗传标记；5）构建标记间的遗传连锁群。

大型真菌分子遗传图谱的构建工作最早始于Kerrigan et al.（1993）对双孢蘑菇Agaricus bisporus 的遗传研究。随后糙皮侧耳Pleurotus ostreatus （Larraya et al. 2000）、香菇Lentinula edodes （Terashima et al.2002；Kwan & Xu 2002；Terashima et al. 2006；et al. 2008）、灰盖鬼伞Coprinus cinereus（Muraguchi et al. 2003）、双色蜡蘑Laccaria bicolor（Labbéet al. 2008）、肺形侧耳Pleurotus pulmonarius（Yasuhito et al. 2009）和Amylostereum areolatum（van der Nest et al. 2009）等图谱的构建工作也相继展开。据统计，目前公开发表的大型真菌遗传连锁图谱仅有14张（表1），而国内还未见有相关的研究报道。双孢蘑菇和香菇是两种重要的食用菌，也是大型真菌遗传学研究中研究比较深入的食用菌。

表1 大型真菌遗传连锁图谱构建情况Table 1 Construction of macro-fungi genetic linkage map

物种Species 构图群体

Population

遗传标记

Genetic marker

连锁图谱

Genetic linkage map 参考文献

Reference

标记数

Number

覆盖长度

Length (cM)

连锁群数

Linkage number

平均图距

Average distance (cM)

双孢蘑菇Agaricus bisporus 52 RAPD、RFLP 64 543.8 11 / Kerrigan et al. 1993 103 SCAR、Others 7 28 1 / Callac et al. 1997 121 RAPD、SCAR 26 339.5 5 / Moquet et al. 1999

118

AFLP、SSR、

CAPS、Others

320 1156 13 3.9 Marie et al. 2010

双色蜡蘑

Laccaria bicolor 45

AFLP、RAPD、

SSR、SNP

294 812 13 2.76 Labbéet al. 2008

糙皮侧耳Pleurotus ostreatus 80 RAPD、RFLP 203 1000.7 11 5.3 Larraya et al. 2000 80 RFLP、Others 99 1061 11 / Park et al. 2006

肺形侧耳

Pleurotus pulmonarius

150 AFLP 300 971 12 5.2 Yasuhito et al. 2009 灰盖鬼伞

Coprinus cinereus

40 RAPD、RFLP 247 1346 13 / Muraguchi et al. 2003

香菇Lentinula edodes 95 AFLP 203 1956.7 11 9.5 Terashima et al. 2002 32 RAPD、SSCP 69 622.4 14 9.0 Kwan & Xu 2002 95 AFLP-H 166 1398.4 11 8.4 Terashima et al. 2006 92 RAPD、SSCP、SCAR 289 908.8 11 3.1 et al. 2008

Amylostereum areolatum80 AFLP 204 1693 25 8.3 van der Nest et al. 2009

1.1双孢蘑菇遗传连锁图谱的构建

双孢蘑菇在西方国家己有300多年的栽培历史，而且对它的研究也较为深入。双孢蘑菇的担孢子多数为异核体，仅有少量的同核体，获得用于分析子代重组率的单倍性同核体较为困难（Elliott 1985；Moquet et al. 1998）。Kerrigan et al.（1993）在1993年构建了双孢蘑菇的第一张遗传图谱，作图群体由52个个体组成，其中包含从671个单孢

分离物中获得的48个同核体，1个异核体单孢（n+n）以及通过这个异核体单孢原生质体再生获得的3个同核体（n）。利用包括同工酶标记、RAPD 标记、RFLP、rDNA标记以及少量表型性状在内64个标记，得到11个连锁群，其中9个连锁群通过核型电泳和点杂交可以与对应的染色体相吻合。该图总长度有543.8cM，与染色体物理距离之比大约为48.5kb/cM，覆盖了基因组的大部分。

Callac et al.（1997）利用来自JB3-83×U1-7杂交的后代103个同核体作为群体，构建了染色体I 的连锁图。该图跨度28cM，有4个源自RFLP的SCAR标记和一个异型酶羧肽酶位点PEP2，一个交配型座位MAT以及担孢子数量位点BSN。染色体I的遗传图谱是对Kerrigan et al.（1993）在1993年所构建的双孢蘑菇遗传图谱的进一步丰富和补充，也表明了由不同作图群体构建的遗传图谱可以在遗传标记的定位上找到切入点，进行对比研究和使用。

Moquet et al.（1999）将JB3-83×U1-7的子代同核体群体数量扩大到121个，通过SCAR、RAPD 和同工酶乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）标记分析，将26个标记定位在5个连锁群上。与Callac et al.（1997）构建的图谱比较发现，在相同的连锁群上（连锁群I）相同标记间的距离增大，标记间的顺序有变。研究表明群体数量的选择至关重要，它会影响到标记之间的准确定位。

Marie et al.（2010）用双孢蘑菇异宗结合突变株A. bisporus var. burnettii和次级结合变异株A. bisporus var. bisporus的种内杂交获得的118个同核体，用31个AFLP、21个SSR、68个CAPS和MAT、BSN、PPC1、ADH基因标记，构建了一张覆盖度为1,156cM、平均图距为3.9cM，共13个连锁群的连锁图谱，与染色体物理距离之比大约为33.05kb/cM，这也是双孢蘑菇第一张详尽的分子遗传连锁图谱。双孢蘑菇总遗传图谱长度（L e）估计在1,256cM，据此估计，在这张连锁图中，以20cM 的距离间隔存在一个标记的话，此图能覆盖双孢蘑菇99%的基因，以10cM一个标记为间隔，将能覆盖双孢蘑菇93%的基因。

1.2 香菇遗传连锁图谱的构建

香菇是年产量仅次于双孢蘑菇的世界第二大食用菌（Lin et al. 2000），属于四极性异宗结合担子菌，其交配系统由2个非连锁的交配型因子A与B 控制（Tokimoto et al. 1973；Murakami & Takemaru 1975）。早期的香菇遗传图谱是用形态标记和生化标记所构建的（Hasebe 1991；Bowden & Royse 1991）。2002年，Kwan & Xu（2002）最早构建了香菇的分子遗传连锁图，亲本菌株L-54采用原生质体单核化处理后获得两种不同交配型（A1B1、A2B2）的单核体，作图群体为32个F1（L-54 A1B1×A2B2）的孢子单核体，共采用62个RAPD标记，3个基于BSA（bulked-segregant analysis）的RAPD标记，2个表型位点（Mat-A、Mat-B），1个基因（priA）位点和1个测序的DNA片段位点（MAT）构建了14个连锁群，该图谱的总长度为622.4cM，平均图距9.0cM。

Terashima et al.（2002）2002年构建了香菇的AFLP连锁图。作图群体为亲缘关系较远的2个菌株杂交后所得的95个单孢子后代，该图有203个AFLP标记和2个交配型因子，共鉴定了11个连锁群，其中有8个大连锁群和3个小连锁群，遗传图谱总长度为1,956.7cM，平均约18.4kb/cM。Terashima et al.（2006）之后通过高效基因组扫描（high-efficiency genome scanning）电泳系统得到的AFLP标记（AFLP-H）及一些功能位点的整合，进一步完善了于2002年构建的连锁图，该图仍为11个连锁群。该图谱包含10个功能性基因位点，这对于香菇遗传连锁图谱之间的对比分析较为有利，如该图中MatA和PriA都定位在连锁群LGⅡ上，表明此连锁群与Kwan构建的连锁图中LG Ⅲ相对应（Kwan & Xu 2002）。

2008年，Miyazaki et al.（2008）选取了23个香菇四分体孢子组合共计92个孢子单核体为作图群体，构建了一张包括289个标记11个连锁群的香菇分子遗传连锁图谱，覆盖度为908.8cM，平均图距为3.1cM。孢子四分体的选择避免了孢子萌发慢、菌丝生长速度慢的菌株被遗弃，理论上是选择最合理的群体材料。2010年，Miyazaki et al.（2010）用PCR及SSCP技术新定位了12个与子实体发育

相关的基因，进一步完善了之前由孢子四分体构建的香菇遗传连锁图谱。

2大型真菌分子遗传图谱的应用

遗传连锁图能显示标记和基因在染色体上的相对位置，有利于更好地理解基因组结构和进化，是进行基因组系统研究的基础，也是遗传学研究的重要方向。目前遗传图谱在大型真菌中的应用范围相对较窄，仅限于初步的数量性状定位和标记辅助育种（molecular assisted selection），尚未应用于基因的图位克隆（map-based cloning）（Huang et al. 2003；Balogh et al. 2007）和比较基因组学（comparative genomes）（Ahn & Tanksley 1993；Axelson-Fisk & Sunnerhagen 2006）的研究。

2.1数量性状（QTL）定位

除同宗结合的种类外，目前大型真菌分子遗传图谱的作图群体一般采用孢子单核体，而大型真菌的大部分数量性状均表现在有性生殖的子实体阶段，子实体的形成大多需要双核（异核）的作用，相对于高等动植物来说，大型真菌某些重要的数量性状的定位仍有一定的难度。1999年Moquet et al.（1999）通过QTL定位的方法研究了双孢蘑菇褐斑病的抗病性状，连锁分析发现，抗病和感病这两个性状与3个标记ADH、PPC1、PR25明显连锁，其中与PPC1的相关系数最高，进一步研究发现双孢蘑菇对活细菌或毒素的抗性性状基因的QTL与PPC1位点非常贴近，遗传连锁图显示两者间的遗传距离仅为1.3cM，PPC1基因本身可能就是抗性基因。研究人员在糙皮侧耳遗传图谱（Larraya et al. 2000）的基础上，初步定位了控制菌丝生长速度（Larraya et al. 2002）、产量及品质性状（Larraya et al. 2003）和木质素降解酶活性（Santoyo et al. 2008）的信息位点。Miyazaki et al.（2008）在其香菇遗传图谱的构建过程中，将营养菌丝在PDA培养基上生长速度这个数量性状初步定位在LOD2号连锁群上。van der Nest et al.（2009）在构建Amylostereum areolatum分子遗传连锁图谱的过程中，发现营养菌丝生长的QTL定位在“识别位点”（交配性因子mat-A和体细胞不亲和因子het-A）附近，这也是首次观察到菌丝生长速度和自我识别系统的连锁关系。

2.2 分子标记辅助育种

Larraya et al.（2003）在对糙皮侧耳高产和质量优良性状的基因定位研究中，尝试通过鉴定杂交子是否含有相关性状的基因进行优良杂交子的筛选，结果表明，这些杂交菌株中确实有部分在产量或质量上优于亲本菌株或一些商业菌株，这为标记辅助育种在大型真菌上的应用提供了技术支撑。但迄今为止，还未见有大型真菌标记辅助育种的系统研究报道。

3大型真菌分子遗传图谱研究的方向与前景

3.1高质量遗传连锁图谱的构建

遗传连锁图谱饱和度是指单位长度染色体上已定位的标记数或标记在染色体上的密度。一个基本的染色体连锁框架图要求标记平均间隔不大于20cM；进行主基因的定位遗传连锁图，要求其平均间隔在10－20cM间；用于QTL定位的连锁图，其标记的平均间隔要求在10cM以下；如果构建的连锁图谱是为了进行基因克隆，则要求间隔更小（Darvasi et al. 1993）。

高质量的遗传连锁图谱是基因组学发展的必然趋势，选择合适的分子标记对保证高质量遗传连锁图谱是必须的，研究人员首先应选用稳定的分子标记构建遗传连锁图谱，如RFLP、SSR、SCAP、SNP等；受真菌遗传学发展的限制，对一些物种来说，分子标记的选择并非易事，在选用其他的多态性标记时（如RAPD、AFLP、SRAP等），务必要保证扩增条带的准确性，如可以提高扩增的重复次数、在数据统计时由不同的人员重复统计等。然而由于任何一种标记在基因组中分布都不是完全随机的。在实际研究中，为了提高图谱的饱和度，应有针对性地寻找在该区域上有差异的亲本构建作图群体，在一定程度上扩大作图群体，利用特性上互补的不同DNA标记进行遗传作图或增加遗传标记的数量。

3.2功能基因在分子遗传连锁图谱上的定位

随着分子生物学的发展，大量的功能基因被识别鉴定，通过有效的手段将功能基因在遗传连锁图谱上进行准确定位，将使遗传图谱的构建工作更有

意义，也将有助于比较基因组学和遗传图谱之间的整合。

在所报道的大型真菌遗传连锁图谱构建中始终有功能基因定位研究。功能基因定位通常采用RFLP、CAPS、SSCP、SSR、SNP等常规的遗传标记手段。Park et al.（2006）以Larraya et al.（2000）构建糙皮侧耳遗传图谱时采用的作图群体及其亲本为材料，鉴定并定位了82个在菌褶中表达的功能基因，进一步丰富了该遗传图谱，这些工作为研究从营养生长到生殖生长转变过程中的基因调控提供了试验平台；Labbéet al.（2008）在双色蜡蘑遗传连锁图谱的构建中运用SSR和SNP标记，成功地实现了物理图谱和遗传连锁图谱的完美对应，也为双色蜡蘑基因组序列（Martin et al. 2008）的准确组装提供了支撑。

3.3基因图位克隆

目前，大型真菌分子遗传图谱构建和QTL定位的研究相对滞后，基于遗传连锁图谱的基因图位克隆工作仍存在一定的难度。尽管如此，以分子遗传图谱和QTL定位研究为基础的数量性状基因的图位克隆工作仍将是今后大型经济真菌遗传育种研究中的重要发展方向。

3.4开展比较基因组学的研究

不同物种间同源关系的研究不仅在物种起源与演化研究上具有重要意义，而且在分子育种及基因克隆等方面也有着重要的作用（Naruse et al. 2000）。比较基因组学基于相关物种的基因组均起源于共同的祖先，进化上相近的物种之间的染色体上必然存在着同源区域（Ahn & Tanksley 1993），利用相同的DNA分子标记构建相关物种的遗传连锁图谱或物理图谱，比较相同标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因排列顺序的相同（共线性）或相似性（同线性），并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。比较基因组学的发展可显著提高遗传标记在物种之间的运用范围，并加深对非模式种基因组结构的认识。目前，依据遗传连锁图谱进行比较基因组学的研究已经在高等动植物之间陆续展开（Dunford et al. 1995；Debry & Seldin 1996；Jardim 2007；Kucuktas et al. 2009），而在大型真菌上类似的研究却极少。

真菌生活史相对简单，部分模式真菌的遗传学研究基础已经相当深入，完全可以在现有的基础上开展大型真菌分子遗传图谱的构建工作。随着分子生物学技术的日益成熟，利用DNA分子标记和重要功能基因标记构建的高质量分子遗传图谱在大型真菌的遗传育种研究中将具有广泛的应用前景。基于重要数量性状基因的转基因育种结合分子标记辅助育种，对大型真菌进行遗传改良，最终将培育出更符合人类需求的优良品种。

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分子标记技术的种类

分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原

遗传图谱

学情分析基础，对于知识不能灵活运用课题遗传图谱分析学习目标与考点分析学习目标：1、对基因的分离定率和基因的自由组合定律能熟练的牢记把握考点分析：1、遗传图谱的分析与把握学习重点重点：1、基因的分离定律和自由组合定律学习方法讲练结合练习巩固学习内容与过程知识点梳理第三章遗传和染色体第一节基因的分离定律一、相对性状性状：生物体所表现出来的的形态特征、生理生化特征或行为方式等。相对性状：同一种生物的同一种性状的不同表现类型。二、孟德尔一对相对性状的杂交实验 1、实验过程（看书） 2、对分离现象的解释（看书） 3、对分离现象解释的验证：测交（看书）例：现有一株紫色豌豆，如何判断它是显性纯合子(AA)还是杂合子(Aa)？相关概念 1、显性性状与隐性性状显性性状：具有相对性状的两个亲本杂交，F1表现出来的性状。隐性性状：具有相对性状的两个亲本杂交，F1没有表现出来的性状。附：性状分离：在杂种后代中出现不同于亲本性状的现象） 2、显性基因与隐性基因显性基因：控制显性性状的基因。隐性基因：控制隐性性状的基因。附：基因：控制性状的遗传因子（DNA分子上有遗传效应的片段P67）等位基因：决定1对相对性状的两个基因（位于一对同源染色体上的相同位置上）。 3、纯合子与杂合子纯合子：由相同基因的配子结合成的合子发育成的个体（能稳定的遗传，不发生性状分离）：显性纯合子（如AA的个体）隐性纯合子（如aa的个体）杂合子：由不同基因的配子结合成的合子发育成的个体（不能稳定的遗传，后代会发生性状分离）4、表现型与基因型表现型：指生物个体实际表现出来的性状。基因型：与表现型有关的基因组成。（关系：基因型＋环境→表现型） 5、杂交与自交

分子遗传学名词解释

2014分子遗传学复习一、名词解释 1、结构基因（Structural gene）：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。 2、调节基因（Regulatory gene）：指某些可调节控制结构基因表达的基因，合成阻遏蛋白和转录激活因子。其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。 3、基因组(genome)：基因组（应该）是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA 分子所携带的全部遗传指令。或单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA或RNA。 4、C值悖理(C-v a l u e p a r a d o x)：生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(C——value paradox)。 N值悖理（N-v a l u e p a r a d o x）：物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性，这被称之为N（number of genes）值悖理(N value paradox)或G（number of genes）值悖理。 5、基因家族(gene family)：由同一个祖先基因经过重复(duplication)与变异进化而形成结构与功能相似的一组基因，组成了一个基因家族。 6、孤独基因（orphon）：成簇的多基因家族的偶尔分散的成员称为孤独基因（orphon) 。 7、假基因(pseudogene): 多基因家族经常包含结构保守的基因，它们是通过积累突变产生，来满足不同的功能需要。在一些例子中，突变使基因功能完全丧失，这样的无功能的基因拷贝称为假基因，经常用希腊字母表示 8、①卫星DNA（Satellite DNA）：是高等真核生物基因组重复程度最高的成分，由非常短的串联多次重复DNA序列组成。 ②小卫星DNA(Minisatellite DNA) ：一般位于端粒处，由几百个核苷酸对的单元重复组成。 ③微卫星DNA (Microsatellite DNA)：由2－20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次组成。 ④隐蔽卫星DNA(cryptic satellite DNA)：用密度梯度离心分不出一条卫星带，但仍然存在于DNA主带中的高度重复序列 9、DNA指纹(DNA fingerprints)：小卫星DNA是高度多态性的，不同个体，各自不同。但其中有一段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”，如果把核心序列串联起来作为探针，与不同个体的DNA进行分子杂交，就会呈现出各自特有的杂交图谱，它们和人的手纹一样，具有专一性和特征性，因个体而异，因而称为“DNA指纹”。 10、超基因(super gene) ：是指真核生物基因组中紧密连锁的若干个基因座，它们作用于同一性状或一系列相关性状。超基因家族（supergene family）：是DNA序列相似，但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族的总称。 11、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)：主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA顺序多态性。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。 12、遗传标记（Genetic marker）：可示踪染色体、染色体片段、基因等传递轨

分子标记遗传图谱的构建方法---完整

分子标记遗传图谱的构建检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。为了有效地分析利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。利用DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。至今为止，已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图。本章侧重介绍利用DNA标记构建分子遗传连锁图谱的原理与方法。第一节作图群体的建立要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。一、亲本的选配 / 亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一般应从四个方面对亲本进行选择，首先要考虑亲本间的DNA多态性。亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可用地理的、形态的或同工酶多态性作为选择标准。一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低。例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的群体就可成为理想的RFLP作图群体；番茄的多态性较差，因而只能选用不同种间的后代构建作图群体；水稻的多态性居中，美国康乃尔大学实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和爪哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。在作物育种实践中，育种家常将野生种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA 多态性非常丰富。第二，选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。第三，要考虑杂交后代的可育性。亲本间的差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间的重组率偏低，并导致严重的偏分离现象，降低所建图谱的可信度和适用范围；严重的还会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分离群体的构建。由于各种原因，仅用一对亲本的分离群体建立的遗传图谱往往不能完全满足基因组研究和各种育

分子标记技术综述

分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用分子标记技术分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。技术种类及原理分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显

遗传题练习(系图谱和概率题)汇总

遗传系谱图的解题方法及练习高中生物学会考要求学生对遗传系谱图应达到综合分析水平。遗传系谱题多涉及一系列问题的解答，如①判别遗传类型、②写出指定个体的基因型、③计算患病机率。而教材中有关内容又较少，因而准确分析遗传系谱即成为一个难点。对学生来说经常出现听得懂，看得明白，就是不会做题。学生普遍认为解题过程中思路不清晰，书写紊乱。因此我认为突破这一难点的有效方法首先是：帮学生理顺解题思路，排除干扰解题的非智力因素；其次，加强变式训练。遗传病特点病例常染色体显性①代代相传②发病率高 ③男女发病率相等多指（趾）、并指、软骨发育不良常染色体隐性①可隔代遗传②发病率在近亲结婚时较高③男女发病率相等白化、苯丙酮尿症双眼皮 X染色体显性①连续遗传②发病率高③女性患者多于男性患者④男性患者的母女都是患者抗维生素D性佝偻病 X染色体隐性①隔代遗传或交叉遗传②男性患者多于女性患者③女性患者的父亲、儿子都是患者色盲、血友、进行性肌营养不良 Y染色体遗传①患者都为男性②父传子、子传孙（患者的儿子都是患者）外耳廓多毛症细胞质遗传母系遗传紫茉莉质体的遗传二、解题思路（一）遗传系谱图的判定第一步：根据题干。如果题干中已告之是“色盲”，则马上可判定此病为伴X隐性遗传病；如告之是“白化病”，则可判定此病为常染色体隐性遗传病。如果题干没告之具体的病例，则往下看第二步。第二步： 1、先确定是否为细胞质遗传 (1)若系谱图中，女患者的子女全部患病，正常女性的子女全正常（即母系遗传）则为细胞质遗传 (2)若系谱图中，出现母亲患病，孩子有正常情况，或者，孩子患病母亲正常，则不是细胞质遗传 2、确定是否为伴Y遗传（1）若系谱图中患者全为男性，而且男性全为患者，女性都正常，正常的全为女性，则为伴Y遗传。（2）若系谱图中，患者有男有女，则不是伴Y遗传 3、确定是显性遗传病还是隐性遗传病（1）无病的双亲，所生的孩子中有患者，即“无中生有”，或患者隔代才有，即“隔代遗传，则为隐性遗传。（2）有病的双亲，所生的孩子中出现无病的，即“有中生无”，或连续几代有患者，即“连续遗传”，则为显性遗传。 4、确定是常染色体遗传还是伴X遗传（1）若已确定是显性遗传 ①男患者的母亲和女儿均为患者，即“子病母不病，父病女不病”，正常女性的父子均正常，患者中女性多于男性为Ｘ染色体显性遗传； ②男患者的母亲和女儿中有正常者，或正常女性的父子有患者为常染色体显性遗传。（2）若已确定是隐性遗传 ①女患者的父亲和儿子均为患者，即“母病子不病，女病父不病”，正常男子的母女均正常，患者中男性多于女性，甚无女患者为Ｘ染色体隐性遗传； ②女患者的父亲或儿子中有正常者，或正常男性的母女有患者为常染色体隐性遗传。例题1： [解析] 据图母亲有病，子女均有病，子女有病，母亲必有

4答案连锁遗传与基因作图

连锁遗传与基因作图习题1 一、填空 1．acb ? 2、这一区段的实际双交换率高于理论双交换率二、名词 1、两点测交法（two-point test cross）：利用三次杂交，三次侧交分别求出3对基因间的交换率，然后进行基因的定位。 2、三点测验法（three-point test cross）：：利用三对连锁基因杂合体，通过一次杂交和一次测定，同时确定3对基因在染色体上的位置。 3、双交换（double crossover）：指在一个性母细胞内的一对染色体同时发生两次单交换。 4、干扰或干涉（interference）：在1对染色体中，1个位置上的1个单交换对于邻近位置上的交换发生的影响称干扰或干涉。 5、正干涉：1个交换的发生减少了另一交换发生的概率。负干涉：一个交换的发生增加了另一交换发生的概率。 6、并发系数或并发率(coefficient of coincidence，C)：观察到的双交换率与预期的双交换率的比值称做并发系数或并发率。一般用并发系数来表示干涉作用的大小。并发系数＝双交换发生率／两个单交换发生率的乘积 7、连锁遗传图（linkage map）：1条染色体的多个基因按一定顺序，间隔一定距离作线性排列的位置图称连锁图或遗传学图。 8、complete linkage：完全连锁: 同一对染色体上非等位基因不发生分离而被一起传递到下一代的现象。 9、不完全连锁：是指位于同一条染色体上的非等位基因在形成配子时会因重组而分开的现象。三、选择题 1-5：c、bc、c、c、d； 6-10：b a d a d 11、acd 四、问答和分析题 1．试述交换值、连锁强度和基因之间距离三者的关系。

分子遗传(名词解释及简答)

名词、简答（依据ppt）一、基因表达调控 1.基因(Gene) 遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位；负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。 2.基因表达(gene expression) 从DNA到蛋白质的过程。对这个过程的调节即为基因表达调控(regulation of gene expression)。 3.基因表达的特点时间特异性——发育阶段特异性空间特异性——组织细胞特异性 4.基因表达调控的概念机体各种细胞中含有的相同遗传信息(相同的结构基因)，根据机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因的过程。 5.基因表达的方式 1）组成性表达(constitutive expression):基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。如管家基因 ★管家基因(housekeeping gene)：某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达。 2）诱导和阻遏表达诱导表达(induction expression)——在特定环境信号刺激下，基因表现为开放或增强，表达产物增加。阻遏表达(repression expression)——在特定环境信号刺激下，基因被抑制，从而使表达产物减少。 6.基因表达调控的意义 1）以适应环境、维持生长和增殖 2）以维持细胞分化与个体发育 7.原核生物基因表达的调控 8、真核生物基因表达的调控——多层次和复杂性 ★转录前水平：染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质结构

分子标记技术

分子标记技术摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用引言分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。一．常用分子标记原理分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝

分子标记种类及概述

分子标记概述遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。分子标记种类利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。

分子标记技术的类型原理及应用

分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术

遗传标记的发展及其类型

遗传标记的发展及其类型 1形态标记 19世纪60年代，Mendel以豌豆为材料，详细研究了豌豆的7对相对性状的遗传规律。由于这些性状都具有典型的外部形态，很容易识别，从而构成了最早的遗传标记，即形态学标记，由此奠定了近代遗传学的基础。形态标记是利用植物外部形态多态性进行的标记技术。自然界中的生物存在着许多非常明显的形态标记，如果形、花色、矮杆、卷叶等。形态标记简单直观且经济方便，但大多数植物中的形态标记数量有限，多态性较差，表型易受环境影响，且形态标记的获得周期长，不适于需要完整的基因组测试的数量性状位点分析，故形态标记在作物遗传育种中的作用有限。 2细胞学标记细胞学标记是利用植物细胞染色体的变异的标记技术。植物细胞染色体的变异包括染色体核型和带型的变异。细胞学标记虽然能进行一些重要基因的染色体定位，但标记材料的培育需要大量的人力和时间，并且有些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，难以获得标记材料，从而限制了细胞学标记在遗传育种上的应用。 3生化标记生化标记主要指同工酶标记，是依据植物体内有效成分的化学分析进行标记的技术。同工酶是同种功能的酶的不同形式，由一个以上基因座位编码，其可通过电泳和组织化学染色法分离成肉眼可见的酶谱带型。与形态标记和细胞学标记相比，生化标记表现近中性，对植物经济性状无大的不良影响，且是基因产物差异的直接反映，受环境影响较小。但由于在植物群体研究中能表现出位点多态性的同工酶种类较少，使其应用也受到限制而不能成为较理想的遗传标记。 4分子标记分子标记是以生物大分子的多态性为基础的标记技术，目前使用的分子标记主要是指DNA分子标记。DNA分子标记能反映植物个体或种群的基因组DNA 间的差异，如由于碱基易位、倒位、缺失、插入、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列而产生的差异。起步于20世纪70年代的分子标记在近40年间发展迅速，目前已出现了几十种分子标记方法。与前3种标记(形态、细胞学和生化标记)技术相比，分子标记具有巨大的优越性: ①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，受季节、环境限制，不存在表达

分子标记技术简介

分子标记技术简介分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。

【分子标记的种类】一、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。

分子标记技术的种类Word版

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来

SSR分子标记简介

微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用摘要微卫星DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性，使其成为居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。本研究系统介绍了微卫星DNA在结构和功能上的特点，并对微卫星DNA标记技术应用的遗传学机理和一般方法进行了扼要的阐述。另外，本研究还探讨了微卫星DNA标记技术在遗传多样性研究中的应用现状，并进一步提出其发展前景。关键词：微卫星DNA；微卫星DNA标记；遗传多样性大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。真核生物的基因组中，重复序列占有很大比重（＞50%）。按照重复序列在染色体上的分布方式，分为散布重复和串联重复（VNTR）两种类型。散布重复序列的拷贝数很多，在重复单位之间彼此常有序列的变化，难以用做分子标记。串联重复序列根据重复单元数目的大小又分为卫星序列(satellites)、小卫星序列(mini-satellites)和微卫星序列(microsatellites)3种类型。其中，卫星序列的重复单元大，一般分布在染色体的异染色质区，采用分子标记系统来揭示其多态性有一定的困难；小卫星序列主要存在于染色体近端粒处，通常以15~75个核苷酸为核心序列，长度从几十到几千个碱基不等；微卫星序列一般较短，属于以1~6个核苷酸为基本单元的简单串联重复。微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星DNA也称简单串联重复序列（SSRs）或简单串联重复序列多态性（STRP）。这些位点由非常短的串联重复DNA 片段（1-5个碱基）组成。微卫星DNA 最早是在人类基因组研究中发现的，它极其丰富，分布在整个基因组中[1] 。人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A、AC、AAAN、AAN 或AG（这里N 代表G、C或T）的序列。这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。微卫星DNA 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现，并且通过聚合酶链式反应可以确定其类型[2] 。（AT）n和（ATT）n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列，它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。Wang等[3]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DNA非编码区，而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。在植物中，约29kb中有20bp的微卫星序列[4]，例如鹰嘴豆中（TAA）n、（GA）n和（CA）n 序列在平均60kb的长度中出现于12000个位点上[5]；而动物中，约每6kb中就有20bp的微卫星重复序列。另外，研究还发现植物中最丰富的微卫星是（A）n，其次是（AT）n，再次是（GA）n。 Weber[6]将微卫星分为3类：完全重复（无间隔）、不完全重复（有非重复单位的碱基间隔）和复合重复（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）。这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其他未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异[7]。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有2.5×10-5~1×10-2突变，因此造成了它们的多态性。但微卫星周围的单拷贝序列一般不受其影响。Davierwala等对水稻及其近缘种利用（GATA）n和（AC）n微卫星两侧的序列合成的引物进行PCR扩增，再通过克隆、测序获得了大小不等的8个等位基因。测序分析的结果表明，不同等位基因的大小变异是由于微卫星重复数目的变异和微卫星两侧区域的序列的变异。尽管目前对这些重复序列的功能和起源还不清楚，但许多研究已经证明，重复序列可以作为种或基因组水平的遗传标记，是分子水平上研究遗传多样性的一个有力工具。微卫星序列的重复单位小，而且这些重复单位的序列差异和数目变化能够形成丰富的多态性，因此得到了广泛的应用。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫