分子生物学基本工具-分子生物学-复习资料整理

第二章分子生物学基本工具

第一节基因操作的工具酶

【限制性核酸内切酶】是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。

【限制性核酸内切酶的命名】

1.寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的

菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli表示为Eco；

2.用一个正体字母表示菌株的类型，比如Eco R、Hin d；

3.如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R

I、Hin d III。

【II型限制性核酸内切酶的基本特点】

1.识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成

的特定序列（靶序列）。

2.识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文

结构。

3.切割位点的规范性：交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。

【粘性末端】是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

【平末端】在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构，不易于重新环化。

【同裂酶】能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。

【同尾酶】识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。

**由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。

【一个限制酶单位（U）】在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1μgλDNA所需要的酶量。

【DNA连接酶作用的特点】

1.连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻，因此

不能封闭gap(缺口)，只能封闭nick(缺刻)。

2.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。

3.不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。

【常见DNA连接酶】

? E.coli DNA连接酶：连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末

端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。

?T4 DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。

【DNA连接酶的作用机制】

1.E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi

E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN

2.E－AMP ＋DNA＝DNA－AMP＋E

3.DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。

【衔接物/接头】由人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。

【末端转移酶】是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。

特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。

最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。

第三节克隆载体

【克隆载体的定义】通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。

【克隆载体必备条件】

1.克隆位点(一个或多个)

2.能携带外源DNA片段进入受体细胞，能自我复制或整入染色体随受体细胞DNA复制而复

制。

3.有选择克隆子的标记基因

4.安全性(不含损害受体的基因，不任意转入别的，尤其人的细胞)

【质粒载体的生物学特性】

1.质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状（少数为线性和RNA）DNA分

子。

2.质粒的大小差异很大。

3.质粒的生存：在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质

粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。

4.质粒的复制类型：一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将

质粒分为两种复制型：

“严紧型”质粒，拷贝数为1-3；

“松弛型”质粒，拷贝数为几十到上百。

5.质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体

质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。

6.质粒的转移：按是否含有接合转移基因分为：

转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。分子量大，进行严紧型复制。

非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。分子量小，进行松弛型复制。

7.质粒的存在形式：

超螺旋/双螺旋共价闭合环/（SC构型）

开环双螺旋/（OC构型）

线状双螺旋/（L构型）

【质粒载体的改造】

1.去掉不必要的DNA区段。

2.减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个（单一的限制性酶切位点）。

3.加入易于捡出的选择性标记基因。

4.对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。

5.改造或增加基因表达的调控序列。

【质粒pBR322】

1.结构特点：

1)氨苄青霉素抗性基因（amp r或Ap r），3种限制酶单一识别位点。

2)四环素抗性基因（tet r或Tc r），内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点。

3)DNA复制起点（ori）

2.优点

1)具有较小的分子量。

2)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

3)具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。

4)对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。

【pUC质粒载体】

1.结构特征：

1)来自于pBR322的Ori

2)氨苄青霉素的抗性基因(amp r)，但核苷酸序列发生了变化

3)LacZ′基因：编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。

4)MCS区段：是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制

性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。

2.优点：

1)具有更小的分子量和更高的拷贝数

2)适用于组织化学法检测重组体：通过α-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。

3)具有多克隆位点区段（MCS），可以定向克隆防止载体自我连接。

【α-互补】

大肠杆菌β-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的α-片段和ω-片段分开时就失去了这种显色的功能。

通常将编码该酶α-片段的Lac Z’ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的ω片段。这样一来，含有功能性完整的Lac Z’基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的α-片段就能和寄主编码的ω片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是alpha-complementation。

释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果Lac Z’插入外源基因被破坏，菌落则是无色的。

X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷

【TA克隆载体——针对PCR产物的克隆】

1.原理

PCR产物在Taq酶的非模板依赖活性作用下，于3`端加一非配对的A。故可研制一种线性载体，其5`端各带一不配对T，可直接与PCR产物以TA连接进行克隆，即TA克隆。

2.TA载体的再生方法

（1）克隆载体线性化

（2）克隆载体末端补平反应

（3）克隆载体末端加T反应

注：再生后的TA载体，原线性化的酶切位点消失

【穿梭质粒】是指一类具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。