拟南芥叶绿素荧光异常突变体cfa的图位克隆

摘要........................................................................................................................................... I ABSTRACT ............................................................................................................................. III 缩略词....................................................................................................................................... V 1 前言.. (1)

1.1 植物叶衰老的概述 (1)

1.1.1 程序性细胞死亡 (3)

1.1.2 叶衰老的生理生化过程 (3)

1.1.3 叶衰老的调节 (4)

1.1.4 植物叶片衰老的展望 (7)

1.2 叶绿素荧光成像与叶衰老 (7)

1.2.1 叶绿素荧光成像的简要介绍 (7)

1.2.2 叶绿素荧光的来源 (8)

1.2.3 叶绿素荧光成像与叶衰老的联系 (9)

1.3 图位克隆 (9)

2 立题依据 (11)

3 材料与方法 (13)

3.1 常用仪器 (13)

3.2 常用实验软件及生物学网站 (14)

3.3 实验材料和菌株 (14)

3.3.1 实验材料 (14)

3.3.2 实验所用的菌株与载体 (14)

3.4 实验药品和试剂 (14)

3.5 培养基及溶液的配制 (15)

3.5.1 培养基的配制 (15)

3.5.2 溶液的配制 (15)

3.5.3 常用抗生素的配制 (16)

VII

3.6 实验方法 (16)

3.6.1 拟南芥的栽培 (16)

3.6.2 拟南芥的杂交 (16)

3.6.3 叶绿素含量的测定 (16)

3.6.4 叶绿素荧光成像仪的相关参数 (17)

3.6.5 拟南芥DNA的提取 (17)

3.6.6 琼脂糖凝胶的配制 (18)

3.6.7 拟南芥RNA的提取 (18)

3.6.8 拟南芥RNA反转录cDNA (19)

3.6.9 半定量RT-PCR实验 (19)

3.6.10 拟南芥基因的图位克隆 (20)

3.6.11 载体构建 (22)

3.6.12 大肠杆菌感受态的制备 (23)

3.6.13 大肠杆菌感受态的转化 (23)

3.6.14 重组菌落与质粒的鉴定 (24)

3.6.15 农杆菌感受态的制备 (24)

3.6.16 农杆菌感受态的转化 (25)

3.6.17 拟南芥浸染 (25)

3.6.18 转基因植株的筛选 (25)

4 结果与分析 (27)

4.1 突变体的获得 (27)

4.2 突变体cfa表型的确定 (27)

4.2.1 突变体cfa在叶绿素荧光仪下的成像 (27)

4.2.2 突变体cfa的性状表型分析 (29)

4.3 突变体cfa不育原因的探究 (30)

4.3.1 突变体cfa花粉萌发率的测定 (30)

4.3.2 突变体cfa雄蕊结构的观察 (31)

4.3.3 突变体cfa花粉粒结构的观察 (32)

4.3.4 突变体cfa雌蕊结构的观察 (33)

VIII

4.4 突变体cfa的遗传分析 (34)

4.5 突变体cfa的图位克隆 (34)

4.5.1 突变体cfa图位克隆群体的构建 (34)

4.5.2 图位克隆引物的检测 (35)

4.5.3 突变体cfa的粗定位结果 (35)

4.5.4 突变体cfa的精细定位结果 (36)

4.5.5 cfa测序结果 (38)

4.5.6 AT1G21700基因T-DNA插入突变体的纯合体鉴定 (39)

4.5.7 CF A相关载体的构建 (40)

4.6 CF A对叶衰老的影响 (41)

4.6.1 衰老相关基因表达量的检测 (41)

5 讨论 (43)

6 结论 (47)

参考文献 (49)

致谢 (55)

前言

1 前言

叶衰老是受一系列衰老相关基因调节的高度协调的过程，是长期进化的结果[1]。它能够随着植物生长发育的进行被自然的诱导或是被外界环境所诱导。近几年来，由于全球气候的变化，过早的衰老引起作物产量的下降，这个问题已受到广泛的关注。

衰老不只是对植物的生长发育有消极作用，同时还有积极影响，如在衰老过程中，衰老部位的营养物质会被运输到新生的种子中以提供足够的营养[2]。这种营养物质的再循环利用对植物的生命过程有非常重要的意义。衰老还受内外因素的综合调控，构成了一个复杂且规律的调节网络。虽然叶衰老的表型基本相同，但其内部的调节机制存在很大的差异[3]。为了研究叶衰老的分子机制，拟南芥是一种非常好的模式生物，它的生活周期较短，并且在不同的生长时期叶片有不同的表型，这有助于对叶衰老进行基因水平的分析。

1.1 植物叶衰老的概述

植物叶衰老构成了叶片发育的最后阶段，并且通过该过程，营养物质从衰老叶片转移到新生组织中，进行了营养物质的再循环利用[4]。衰老是导致有机体死亡或是生命周期结束的随着年龄变化的退化过程，叶片衰老是器官水平上的衰老但是也与细胞或有机体的死亡密切联系在一起。一年生植物的叶衰老伴随着有机体的衰老，而对于大树和其他多年生植物来说，叶衰老只是叶片颜色发生了改变，并不能影响有机体的衰老。衰老过程中，叶片细胞在细胞结构，新陈代谢以及基因表达上有着非常规律的变化，例如在细胞结构上出现的最早和最重要的改变就是叶绿体的降解[5]，叶绿体含有高达百分之七十的叶片蛋白质；在代谢方面，碳同化被叶绿素和大分子物质例如蛋白质，膜脂质和RNA 的分解代谢所替代[6]。对于叶器官来说，叶衰老是一个有害的过程，但是从别的方面来看，叶衰老也有其积极的作用：叶衰老对植物后代的产生以及在时间和空间的领域上植物能够更好的生存都起到了一定的作用[7]。在农业生产方面，叶衰老可能通过影响生长的时间最终影响了作物的产量，例如在收割果实后，叶片迅速变黄，营养物质大量流失

[8]。那么叶衰老是如何开始的。在植物中，糖对植物的生长发育有调节作用。实验表明

[9]，糖浓度较高时能够降低光合作用活性，诱导叶衰老的开始。也就是说，当糖浓度高