《现代生命科学研究技术》实验指导-EMSA验证蛋白与DNA的结合-笔记版
利用凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白与DNA的结合
一、实验原理及应用
凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是一种研究蛋白和核酸相互作用的技术。蛋白质与放射性标记或生物素标记的探针结合后，形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率比自由探针的迁移率大大降低，表现为条带滞后。
凝胶阻滞实验具有简单、快捷、灵敏等优点，可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来进一步确定阻滞条带所结合的蛋白质。结合定点突变技术，还可以用来研究蛋白结合核酸的关键位点。
许多生物学过程，如染色体的包装、维持及控制，都与蛋白质-DNA间的非特异性相互作用有关。在古菌中发现的某些小分子量DNA结合蛋白具有与组蛋白类似的功能，按分子量不同分为7kDa、8kDa和10kDa三类。本实验中所用的蛋白质Sul7d是来源于嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）中的7kDa 蛋白，能够和DNA非特异性结合。本实验中利用EMSA实验验证体外表达的Sul7d蛋白和DNA的相互作用。60 bp的DNA片段由公司合成。部分DNA片段由生物素标记。将纯化好的Sul7d蛋白与DNA底物共孵育，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；将凝胶上的样品转移到NC膜，利用显色剂显影后即观察到目标蛋白与不同结构底物的结合情况。
生物素标记法采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，以随机引物为起始引物，将生物素标记的dUTP引入到合成的DNA探针中，产生高活性生物素标记的DNA片段。生物素标记相对于同位素标记，操作方便、安全。
为了获得准确的实验结果，还应该在蛋白质-核酸混合液中分别加入不同浓度的“竞争剂”（competitor）。竞争剂与探针序列相同，但没有被标记。如果被检测的滞后条带随“竞争剂”浓度增加而逐渐减弱，说明蛋白质和探针之间的结合是特异的。
二、实验材料、试剂、仪器
1.实验材料：
（1）纯化好的目标蛋白Sul7d(4mg/ml)
（2）具有特定序列的寡核苷酸双链（由公司合成），60 bp左右
2.试剂：
（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂，胶浓度为5%，现用现配。
（2）DNA片段标记试剂盒（如生物素化标记）
（3）寡核苷酸纯化试剂盒
（4）5×蛋白-DNA结合缓冲液：
100%甘油 500 μl
1 mol/L Tris(pH8.0) 250 μl
BSA(10 mg/ml) 125 μl
5 mol/L NaCl 30 μl
0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 10 μl
1 mol/L二硫苏糖醇（DTT） 10 μl
H2O 75 μl
总体积： 1000 μl
（5）非特异竞争物：10 mg/ml，用灭菌ddH2O配制。
（6）电泳缓冲液 0.5×TBS（由10×储液配制）
（7）蛋白质样品缓冲液（非变性,5×）：30%甘油，0.25% 溴酚蓝，0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8
3．仪器及用品
电泳仪、镊子、剪刀、尼龙膜、蛋白湿转仪、摇床、紫外交联仪、水浴锅、X-光片、暗室、洗片设备等。
三、实验步骤
1．丙烯酰胺凝胶的配制
配制5%非变性聚丙烯酰胺凝胶，使用常规的制备蛋白电泳胶的模具，注意不能有SDS残留。待胶完全凝后，小心将梳子拔掉，电泳槽加入预冷的0.5×TBE 缓冲液至加样孔底部，100V电压预电泳1小时。
2．DNA片段的标记
按照试剂盒具体说明严格操作。
3. EMSA结合反应
按照下述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的DNA片段前先混匀，室温(20~25℃)放置10min，从而消除可能发生的DNA和蛋白的非特异性结合。然后加入标记好的DNA，混匀，室温(20~25℃)放置20min。
表1. 蛋白质与探针的结合反应
试剂 阴性对
照 样品反
应
竞争反应1竞争反应2
ddH2O 14μl9 μl8 μl 7 μl
5×结合缓冲液 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl
Poly (dI?dC) 1μl 1μl1μl 1μl
Sul7d蛋白质样品 5μl5μl 5μl
未标记探针（特异竞争
剂）
1 μl
2 μl
标记探针 1μl 1μl1μl 1μl 4. 电泳
将上述样品分别加入5μl上样缓冲液（5×），混匀后立即上样，100 V 电压，冰浴中电泳约1 hr。胶的温度不能超过30℃，如果温度升高，可适当降低电压。待上样缓冲液中的前沿指示剂溴酚蓝移至胶的下缘1/4处时停止电泳。
5. 转膜
（1）取一张和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5×TBE 浸泡至少10min。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可
能接触样品的边角处。
（2）取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5×TBE浸湿。
（3）把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，尼龙膜和滤纸间不能有气泡。小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，确保胶和膜之间没有气泡。另
取一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，确保滤纸和胶之间没有气泡。 （4）利用湿法电转膜方法，以0.5×TBE为转膜液，在冰水浴中进行转膜，100V 电压下约30~60min。
（5）转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，小心吸掉表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜变干。
6. 交联
用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45 sec。
7. 化学发光法检测生物素标记的探针
（1）37℃水浴溶解封闭液和洗涤液。取一套干净方形培养皿，加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜，在摇床缓慢摇动15min。 （2）同时，取5μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（Streptavidin-HRP）结合液加入到15ml封闭液中(1:3000稀释)，混匀备用。
（3）去掉（1）中培养皿中的封闭液，加入（2）中配制的15ml含有Streptavidin-HRP结合液的封闭液，继续在摇床上缓慢摇动15min。 （4）将尼龙膜转移至另一装有15ml洗涤液的干净方培养皿，漂洗5min，然后将洗涤液倒掉，重新加入15 mL 洗涤液继续在摇床上缓慢摇动5 min，共
洗涤四次。
（5）将尼龙膜转移至另一装有20ml平衡液的干净方培养皿，在摇床上缓慢摇动5min。同时，取荧光检测试剂（ECL）的工作液A和工作液B各5ml，混
匀，配制成显色工作液。
（6）取出尼龙膜，用吸水纸吸去多余液体后，将膜的样品面向上，在尼龙膜的表面小心加上配制好的共10ml显色工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。
室温放置5min。
（7）取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜中，固定于压片暗盒内。用X光片压片1~5min。可以先压片1min，立即显影定
影，然后根据结果再调整压片时间。
四、数据与结果分析
根据显色结果，验证目标蛋白与DNA底物的结合现象。蛋白质与DNA结合后形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中比游离的DNA迁移慢，可以根据迁移率的变化来判断。
五、参考文献
1．DR.马歇克 JT.门永等蛋白质纯化与鉴定实验指南朱厚础译，北京：科学出版社，2002，126
2．Taylor JD, Ackroyd AJ, Halford SE. 1994: The gel shift assay for the analysis of DNA-proten interactions. Methods Mol Biol 30:263-279
3．3. Chen X, Guo R, Huang L. 2002. Evolutionary conservation and DNA binding properties of the Ssh7 proteins from Sulfolobus shibatae. Sci China Ser C. 45:583-592
铁蛋白结构与功能
铁蛋白结构与功能 摘要：铁元素是生物体中的半微量元素，铁元素子生物体内的平衡对生物体的健康有着很重要的作用，而作为可以调节体内铁元素平衡的铁蛋白很早就出现在学者的研究中。铁蛋白不仅直接在人体内发挥作用，也通过植物食物的铁元素积累影响着人类的健康，所以通过阅读了几篇文献后，简单概括一下目前对铁蛋白的结构和功能的研究情况。 关键词：铁蛋白结构功能 铁是生物体很重要的一种半微量元素，对生物体的健康有着极为重要的作用，铁在动物体内参与造血、运输氧气、免疫和防御等生理过程，在植物体内则参与叶绿素的形成，但是铁含量超标则会造成消化功能紊乱、生长受阻等。所以，维持生物体体内铁含量平衡至关重要。铁蛋白是生物体内的铁贮藏蛋白质，起着调节生物体铁平衡的作用。 目前，在动物、植物和微生物体内都对铁蛋白进行了大量研究[1]，除了对其基因[2]、结构和功能做了大量研究之外，也在不断探索研究铁蛋白的方法[3]、铁蛋白的新作用[4-5]以及铁蛋白的作用方法等6-7]。由于铁元素在生物体内的重要作用和植物性食物的铁含量很低，甚至在某些地区有缺铁现象的发生，为了提高植物食物中的铁含量，有学者已经开始了通过转基因技术，将豌豆铁蛋白基因专人水稻[8-9]。
虽然铁蛋白对动物和植物都很重要，但是无论是存在分布、结构和功能上，动物和植物体内的铁蛋白都不同[10]。与动物铁蛋白相比，植物铁蛋白具有两个显着的特点：首先，植物铁蛋白在其N端具有一个独特的EP 肽段；其次，植物铁蛋白只含有H型亚基，且有两种不同的H型亚基组成。 1.铁蛋白的结构 铁蛋白分子通常由24个亚基形成一个中空的球状蛋白质外壳，内径通常为7~8nm，外径为12~13nm，厚度为2~。每个球状铁蛋白分子大约有4500个三价铁原子储存在其中。每两个铁蛋白亚基反向平行形成一组，再由这十二组亚基对构成一个近似正八面体，成4-3-2重轴对称的球状分子 (图1)。每个铁蛋白亚基外形成空心的柱状(长约5nm，直径约，且由一个两两成反向平行的4个α螺旋簇 (A、B和C、D)、C末端第五个较短α螺旋(E)以及N末端的伸展肽段 (EP) 构成。B和C螺旋之间由一段含18个氨基酸的BC环连接，E螺旋位于4α螺旋簇的尾端并与之成60° 夹角 (图2)。每个铁蛋白分子形成12个二重轴通道、8个三重轴通道和6个四重轴通道，这些通道被认为是铁蛋白内部与外部离子出入铁蛋白的必经之路，起着联系铁蛋白内部空腔与外部环境的作用。
重组铁蛋白的活性研究[设计+开题+综述]
开题报告 食品质量与安全 重组铁蛋白的活性研究 一、选题的背景与意义 铁是人体生理代谢必需元素之一，也是不可缺少的营养元素。缺铁对儿童的智力、身体发育，免疫功能，消化吸收功能均有较大影响。缺铁性贫血是世界上最普遍的营养缺乏症，会损坏免疫系统，降低人的生理和心理机能，也会阻碍大脑认识能力的发育。据估计，全球约有30％的人口受缺铁的痛苦。在以稻米等植物性食物为主食的发展中国家，缺铁的影响程度更大，有近半数的5岁以下儿童和超过一半的孕妇患有铁缺乏症。 铁蛋白是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的铁储存蛋白，是动植物生长发育的储存铁的共同来源。当细胞内二价铁离子含量高时，铁蛋白通过它的亚铁氧化还原中心，在氧气的帮助下，将其催化氧化生成无毒的三价铁储藏在它的内部，1分子铁蛋白最多可储存4500个三价铁，这个特点是铁蛋白与其它酶最大的不同之处；当细胞需要铁时，铁蛋白在还原剂的帮助下，将三价铁还原为二价铁离子从其内部释放出来，以供其它蛋白质合成利用，所以铁蛋白在细胞内具有去除二价铁离子的毒性以及调节铁代谢平衡的双重作用，同时它还参与细胞RNA代谢的调节。有研究认为该蛋白是解决动物和人类全球饮食缺铁的有效方法。 纽虫是一类生活在浅海潮间带的无脊椎动物，在世界各地都有分布，它具有柔软、能伸展、无分节的身体，以及一个极具特征性的捕食器——能够翻转的吻。研究表明其铁蛋白有较强的结合铁的能力，因此通过基因工程技术导入铁结合蛋白基因来提高食品铁含量以改良其营养品质将具有十分重要的意义。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 基本内容： 1、重组铁蛋白的获取 （1）IPTG诱导重组蛋白的表达，SDS—PAGE检测表达的情况； （2）大量表达蛋白并检测该蛋白为可溶性还是包涵体形式存在；
人乳铁蛋白转基因研究进展
*基金项目:国家高技术研究与发展计划(863)重大专项(2002AA206111)资助。 赵春江，男，1970年生，中国农业大学生物学院博士后。E-mail:
华南理工大学生物化学与分子生物学2008真题精
878 华南理工大学 2008年攻读硕士学位研究生入学考试试卷 (请在答题纸上做答,试卷上做答无效,试后本卷必须与答题纸一同交回 科目名称:生物化学与分子生物学 适用专业:微生物学,生物化学与分子生物学,生物医学工程 共 8 页 (考试时间3小时,总分数150分 一. 选择题 (从备选答案中选出一个正确的答案, 每小题 1分,共 30分 1.反转录酶除了有以 RNA 为模板生成 RNA-DNA 杂交分子的功能外,还有下列活性 A DNA聚合酶和 RNase A B DNA聚合酶和 S1核酸酶 C DNA聚合酶和 RNase H D S1核酸酶和 RNaseH 2.一个酶有多种底物,判断其底物专一性强弱应依据参数 A Kcat B Km C Kcat/Km D 其它 3.DNA 分子上被依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶特异识别的顺式元件是 A 弱化子 B 操纵子 C 启动子 D 终止子 4.蛋白质形成三级结构的驱动力是:(B A 范德华力 B 疏水作用 C 氢键 D 离子键 5.利用羟基磷灰石分离提纯蛋白质是属于
A 离子交换层析 B 吸附层析 C 亲和层析 D 分子筛层析。 6.下述哪种方法不适合用来测定核酸分子的大小及其分子量 A 电镜测量法 B 沉降分析法 C 粘度法 D 吸咐层析法。 7 .今有 A,B,C,D 四种蛋白质, 其分子体积由大到小的顺序是 A>B>C>D,在凝胶过滤柱层析过程中,最先洗脱出来的蛋白质一般应该是 A A, B B, C C, D D 8.生物体内甲基的直接供体是 A S-腺苷蛋氨酸 B 半胱氨酸 C 蛋氨酸 D 牛磺酸 9 .如果要测定一个小肽的氨基酸顺序,下列试剂中选择一个你认为最合适的 A 茚三酮 B CNBr C 胰蛋白酶 D 异硫氰酸苯酯 10 .在天然蛋白质组成中常见的一个氨基酸,它的侧链在 pH7.2和 pH13都带电荷,这个氨基酸是 A 谷氨酸 B 组氨酸 C 酪氨酸 D 精氨酸 11.某蛋白质 pI 为 7.5,在 pH6.0的缓冲液中进行自由界面电泳,其泳动方向为 A 原点不动 B 向正极泳动 C 向负极泳动 12.在接近中性的pH的条件下,下列哪种基团既可以为H +的受体,也可为H +的供体 A His-咪唑基 B Lys-ε-氨基 C Arg-胍基 D Cys-巯基 13.测定蛋白质在 DNA 上的结合部位常用方法 A Western印迹 B PCR C 限制性图谱分析 D DNaseI保护足印分析 14.人细胞 DNA 含 2.9×109碱基对,其双螺旋的总长度约为
铁对基因表达的调控
铁对基因表达的调控 摘要：铁作为动物生长发育及生产所需要的重要营养成分,既可作为代谢过程的底物和辅助因子,又可对许多编码基因的表达进行直接或间接的调控,本文综述了铁对基因表达的调控方式及途径,介绍铁对部分基因表达的主要影响。 关键词：铁；基因表达；调控 各种营养物质作为外部因子与基因表达相互作用,它们的关系表现在两个方面:一方面养分的摄入量影响基因表达;另一方面基因表达的结果影响养分的代谢途径和代谢效率,并决定动物的营养需要量。随着分子生物学理论和技术的快速发展,微量元素铁调控基因表达的方式、途径、机制得以不断揭示,其重要性得到了重视。 1铁的生理功能 铁对动物有多种功能，主要表现在：铁是构成血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素和多种氧化酶的重要成分，作为氧的载体，保证体组织内氧的正常输送；血红蛋白中的铁对于维持机体每个器官和每种组织的正常生理作用是不可缺少的；铁在胎盘中是以转铁蛋白的形式存在；以乳铁蛋白的形式存在于哺乳动物乳汁-胰液-泪液及白细胞胞浆；以铁蛋白和血红素形式存在于肝中；在禽卵和爬行类卵蛋白中存在的卵转铁蛋白；并且铁也是构成机体内许多代谢酶的活性成分，如：铁硫蛋白、细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化物酶等；铁与某些酶的活性有密切的关系，如乙酰辅酶A，琥珀酸脱氢酶，黄嘌呤氧化酶，细胞色素还原酶，是激活这些碳水化合物代谢酶的不可缺少的活化因子[1]。在细胞生物氧化过程中发挥着重要作用。现代研究证明：铁与能量代谢密切相关，因为三羧循环中有一半以上的酶和因子含铁或者只有铁存在时才能发挥其生化作用，完成生理功能#铁还影响动物体内的蛋白质合成和免疫机能。 缺铁或铁的利用不良，将导致氧的运输、贮存，二氧化碳的运输及氧化还原等代谢过程紊乱，影响生长发育甚至发生贫血等各种疾病。机体若贮铁或摄铁不足，或因寄生虫感染缺铁，或红细胞分解速度大于合成速度则出现缺铁性贫血，贫血可发生于生长的任何阶段,需要人工补铁。 2铁对基因表达调控的主要机制 2.1在转录水平上的调控 基因表达是指动物体内的DNA转录成几股信使RNA(mRNA),再以mRNA为模板合成蛋白质的过程.基因的表达要受到转录水平,转录后、mRNA翻译、翻译后等过程的调节[2]。.研究表明,营养物质在每一步都可对基因的表达产生影响,但主要是在转录水平的调控,这种调控的主要内容是对RNA聚合酶活性及正确起始位点的调节,这种调节主要是由DNA分子上所谓的启动子部位来完成,这一部位可与RNA聚合酶Ⅱ以及许多转录因子相结合.启动子位于同一条DNA 链上结构基因5′侧翼区上游,被称为顺式作用元件,通常位于距转录起始点40-200碱基对的位置.反式作用元件是由那些影响转录的其他基因所产生的因子,主要包括一些蛋白质或肽类激素,类固醇-受体蛋白复合物,维生素-受体蛋白质,矿物质或矿物质-蛋白质复合物。
乳铁蛋白基因的获取
摘要：本实验通过基因工程的方法进行编码目的基因的DNA的制备，主要通过以下形式：真核生物mRNA的获取、表达乳铁蛋白的mRNA获取纯化、通过mRNA反转录cDNA等一系列步骤完成。 关键字：目的基因获取基因工程乳铁蛋白 cDNA的制备PCR技术
目录 一、实验目的 (2) 二、真核生物组织中获取基因简介 (2) 三、RNA的获取 (3) 四、相应DNA的获取处理 (4) 五、获取编码目的基因的mRNA方法·4 六、cDNA获取 (5) 七、心得体会 (6) 八、参考文献 (6)
RT-PCR法获取人乳铁蛋白基因 一、实验目的 乳铁蛋白出现在动物乳，特别是初乳中，为婴幼儿提供多种生物功能，尤其是调节免疫和对病原微生物的抵御功能。乳铁蛋白是从牛乳中提取的一种安全可靠的天然物质，其在食品方面的应用已得到许多国家和地区法律的承认。随着乳铁蛋白作用机制的不断阐明和开发应用范围的扩大，乳铁蛋白在疾病防治、营养补充、食品和药品防腐、化妆品等方面有广阔的应用前途。基于众多的研究成果和试验，在婴幼儿配方食品中添加乳铁蛋白带来重大意义。在婴幼儿配方奶粉中添加乳铁蛋白，既可满足婴儿生长发育的需要，同时又对婴儿的健康起到保护作用。目前在全球的农业发达国家像新西兰、瑞士、澳大利亚、荷兰等，不仅拥有着全球最优质的奶源，而且，更加注重免疫、吸收等功能效果。在这些国家的高端婴幼儿配方奶粉当中，多数有添加乳铁蛋白这一重要的母乳成分，例如瑞士百立乐金装婴幼儿配方奶粉、美素奶粉等。 应用人群 1.孕产妇：孕产妇补充乳铁蛋白，可以提高其抵抗力，有效预防或治疗孕期、哺乳期的细菌、病毒性感染；同时，促进铁吸收，预防孕产妇贫血。 2.非母乳喂养、混合喂养的婴幼儿：乳铁蛋白是母乳中的核心免疫蛋白，能帮助婴幼儿抵抗细菌、病毒等有害微生物，预防病毒引起的呼吸道感染及腹泻等婴儿常见疾病；同时还可以促进婴儿的生长发育和增强造血功能，为婴儿构筑起健康成长的第一道防线，“吃母乳的宝宝少生病”正是这个道理。遗憾的是，目前市场上的婴幼儿配方奶粉中很少有添加乳铁蛋白的产品，这也是配方奶粉与母乳的最本质区别。因此，对非母乳喂养儿、混合喂养儿，食用配方奶粉的同时，额外补充乳铁蛋白，可以大大改善配方奶粉的不足，使其营养成分更趋向于母乳！ 3.缺铁性贫血者：乳铁蛋白能高效促进铁吸收，临床试验证明，铁与乳铁蛋白结合后吸收率是单纯补铁的4倍。缺铁性贫血者在补铁时配合摄入乳铁蛋白，可达到减少铁制剂摄入量，增强补铁效果的作用，同时，由于乳铁蛋白的摄入，还可以明显缓解铁对肠道的刺激。 4.免疫力低下者：体弱多病者大多抵抗力低下，乳铁蛋白能够帮助他们激发、建立、修复、完善免疫系统，增强抗病能力。 人体实验 1.有助于肠道比菲德氏菌的繁殖。 2.除了干扰素外，乳铁蛋白是第一个被发现具有抗C型肝炎的活性物质，可以减少血浆中HCV-RNA值（其值可作为C型肝炎病毒活性高低的评估）。 3.减少导致胃溃疡重要原因幽门螺旋杆菌 H.pylori的数目 二、真核生物中基因获取方法简介 目的基因制取策略有直接获取和间接获取。对于一些低等的生物一般用直接法，而像人这样的高等动物，基因组比较复杂，而且还没有研究清楚，所以一般用间接获取法。常用的有人工合成法，逆转录PCR法，构建基因文库法等。其中以逆转录PCR（RT-PCR）法最常用。 逆转录PCR（RT-PCR）的基本步骤如下： 1，总RNA的提取
铁蛋白研究进展
铁蛋白研究进展 摘要 铁蛋白是广泛存在于生物体的铁贮藏蛋白,具有调节铁代谢平衡、抗氧化胁迫、消除部分重金属和有毒分子的毒害等功能.随着其结构和功能研究的深入,铁蛋白渐成为相关领域研究的热点之一.铁蛋白在基因研究、与疾病的关系、生物反应器、分离与纯化、含量测定方法、铁释放动力学、纳米材料和抗体制备等方面都有了很大的进展. 关键词:铁蛋白;功能;研究现状;转基因;疾病 铁蛋白(ferritin)于1937 年由Laufberge 从脊椎动物马的脾脏中纯化分离出来[1],具有耐稀酸p H = 2. 1、耐稀碱p H =12. 1和耐较高温度70～75 ℃不变性等特性[2].铁蛋白分子质量450 kD ,外形结构呈球形,由蛋白壳和铁核两部分组成.蛋白壳由24 个亚基组成高度对称性的结构,厚度约2～2. 5 nm ,外径11～13 nm ,内径8～9 nm.铁核位于蛋白壳中心,由数千氢氧化铁分子和数百磷酸盐分子组成非均匀的结构,直径约7～8 nm.哺乳动物铁蛋白由H 和L 两种亚基以不同比例组成,植物、原核生物以及非脊椎肝铁蛋白由相同亚基组成[2].动物铁蛋白大部分分布在肝、脾、骨髓、骨骼肌和肠粘膜中[3].植物中主要分布在低光合活性的非绿色质体如前质体、白色质体、有色体、造粉体以及种子、幼苗、根的顶部[4]和豆科植物年幼的根瘤中[5].目前有关铁蛋白的研究越来越多,本文简单介绍了铁蛋白的主要功能,对其国内外研究现状进行了详细的综述. 1 铁蛋白的主要功能 1. 1 调节铁代谢平衡 铁在细胞内的浓度需要严格控制[1],一方面,机体缺铁会引起很多生理上的变化,
也会引发某些疾病,最常见的是缺铁性贫血;另一方面,铁又不可过量,否则可发生铁中毒,引起胃肠道出血,大量铁积聚在肝脏等重要脏器,引起肝功能损害等疾病[3].铁蛋白主要在释放和储存上对铁代谢进行调控[1].当体内铁含量过高时,铁以Fe2 +的形式贮存于铁蛋白中[3],铁蛋白贮存铁的过程包括二价铁氧化、铁离子移动和矿质铁心的形成和生长[6].在出血或其他需要铁的情况下,贮存的铁可以释放,参与造血或其他含铁化合物的合成[3] 1. 2 抗氧化胁迫 过量铁会导致氧化性胁迫,称为Fenton 反应( Fe2+ + H2O2→Fe3+ + OH - + ·OH) .二价铁能活化H2O2,形成羟自由基( ·OH) ,它具有很强的氧化能力,能改变细胞的成分,导致细胞完整性的损失,甚至导致细胞死亡.铁蛋白通过截获细胞间铁,从而阻止铁参与Fenton反应,避免产生具有很强活性的·OH,从而保护细胞免受因各种环境胁迫而导致的细胞氧化性损伤[1]. 1. 3 消除部分重金属和一些有毒分子的毒害 铁蛋白不仅可捕获各种重金属和劳氏紫等有机小分子[7],也适合于捕获有机磷农药[8].除上述功能外,铁蛋白在体外还有吸氢及直接从金属电极上接受电子等功能[9]. 2 铁蛋白基因研究现状 2. 1 植物铁蛋白基因研究 由于植物性食物的铁含量低,且存在吸收率低的问题,使得人类铁营养主要依耐于动物食品.在以谷物等食物为主要来源的人们中,尤其是发展中国家存在严重的缺铁问题[1].近年来铁蛋白基因作为提高植物铁含量的候选基因而倍受关注[10],原因是: (1)铁蛋白贮存铁的能力高于其它蛋白; (2)铁蛋白由特殊酶亚基形成,无需导入任何其它基因诱导产生翻译产物; (3)铁蛋白在单、双子叶植物中都存在; (4)铁蛋白中铁以生物可以利用形式存在.克隆其基因并导入经济作物,实现稳定而高效的表达,将会提高植物的铁营养成分. 植物中有关铁结合蛋白基因的分离和克隆已涉及大豆、豌豆、豇豆、苜蓿、玉米、油菜、拟南芥、马铃薯、兰花等植物[1].迄今,运用转基因技术将外源铁蛋白基
铁代谢和可溶性转铁蛋白受体(sTfR)
铁代谢和可溶性转铁蛋白受体（sTfR） ??功能性缺铁的最灵敏的标志物 铁以三种不同的方式分布于人体：大多数的铁（～80％）参与转运氧的血红蛋白和储存氧的肌红蛋白，还有几种存在于细胞氧化和呼吸链的酶中。过剩的铁与铁蛋白和含铁血黄素结合以备使用，因为游离的铁对细胞是有毒性的。只有相当少的铁（～0.1%）在血液循环中被运输，它们与转铁蛋白结合，从“产地”??与具有生理功能的铁结合的蛋白（例如：在骨髓中合成的血红蛋白）被运往“储存地”（例如：肝中的铁蛋白）。在健康的人体中，每天从食物中摄取大约1mg的铁，并且有等量的铁丢失。红细胞含有大多数的铁（～2500mg），另外有少部分但是必不可少的（～500mg）铁提供给肌肉和酶，使它们进行正常活动。过剩的铁与铁蛋白结合，储存在不同的细胞中。 体内铁的平衡可被一些情况破坏，例如，铁需求量的增多（生长发育、怀孕）；铁供应的不足（营养不良/素食、吸收功能紊乱）或是体内铁过度丢失（急慢性出血，如月经过多、胃溃疡出血）：大多数（70％或更多）的缺铁都是由贫血造成的，这种贫血的特征是红细胞变小和血红蛋白的量过少。缺铁会影响几项生理功能：肌肉功能减退、对于神经系统来说就是注意力不集中和学习能力下降、温度调节功能受影响、细胞介导的免疫反应缺陷以及对孕妇来说缺铁会引起早产。 然而，由不同原因造成的贫血应采用不同的治疗方法。血红蛋白或红细胞生 ）、慢性炎症或原发性骨髓病成的不足可由营养缺陷（缺铁、叶酸盐或维生素B 12 造成。另外，还有一些原因，如溶血、脾机能亢进、血丢失增加和血浆扩容剂的增容作用。 另一方面，铁不能过量补充，过量补充铁也会造成损害。铁过多负荷的最常见的病有：血色素沉着症，它是常染色体隐性遗传病。这种病的患者，由于肠对铁的过量吸收并以与铁蛋白结合的形式储存在肝、心脏和胰中，损害该脏器的功能。治疗方法包括周期性静脉放血，以增加铁丢失，直到储存铁（铁蛋白的量）以及补充到组织的铁量（转铁蛋白饱和度或可溶性转铁蛋白受体）都达到正常。对评价铁代谢来说，测定不同的参数以了解不同状态的铁的情况是必不可少的。铁蛋白反映了储存铁的情况，它在血浆中的浓度与细胞内总的铁蛋白储存量成一定的比例关系。转铁蛋白在“储存地”和“吸收地”之间运输铁，还将铁运往骨