实验三、四病原菌的分离和(一)鉴定

微生物实验设计-醋酸菌

实验设计：醋酸菌的分离与纯化 ——生物科学2班秦琬莹辛吉瑀张博文一、实验目的 学习醋酸菌的分离纯化、鉴定的原理。 掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 二.实验原理 1.菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 2.接种操作方法 涂布平板法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 3. 结晶紫 结晶紫是一种碱性染料，也一种极佳的精密酸指示剂，pH 0.5(绿)～2.0(蓝)~弱酸（蓝紫）~中性（紫色）~碱性（赭红色）；所以在醋酸菌分离纯化平板培养基中加入少量的结晶紫溶液，既不会影响醋酸菌的生长，又可根据变色圈的大小很快把产酸高的醋酸菌株分离出来。 二、材料、用品 1.样品：食醋 2.培养基： （1）分离纯化平板培养基 葡萄糖1 g，酵母膏1 g，碳酸钙2 g，琼脂2g，水100mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃加入4mL无水乙醇和0.5mL 0.02％结晶紫冰醋酸溶液。 （2）液态发酵培养基 葡萄糖l g，酵母膏1.5 g，磷酸二氢钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，水100 mL，pH6.5，灭菌后冷却至60 ℃以下加入无水乙醇3.5mL。 3.器材：接种环、冰箱、试管、培养皿、无菌玻璃涂棒、移液管、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅等。 三、醋酸菌分离纯化流程 样品——醋酸菌发酵液中富集培养——稀释分离——纯化——保藏平板培养基保藏 四、实验步骤方法 1.富集培养 取家用食醋以10％的量接入醋酸菌液态发酵培养基富集培养24h。

醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究

第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究 2.1引言 醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。 本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。 2.2实验材料与方法 2.2.1材料与仪器 分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。 试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。 表2.2.1.a主要仪器设备 Tab 2.2.1.a Main instrument equipment 主要仪器型号厂家 生化培养箱 双目生物显微镜 分析天平 手提式不锈钢蒸汽灭菌锅 超净工作台 精密数字式酸度计 PYX-250S-A BME（BA/E3） BS224S DSX-280B SW-CJ-1FD pHS-3C 长沙科技 科力仪器 德国莱卡 北京化丰 上海南鹏 上海科技

试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。 2.2.2培养基[33-37] 表2.2.1.ｂ培养基成分表 Tab 2.2.1.ｂMedium composition 名称葡萄 糖 酵母 膏 无水乙醇 (v/v) 琼 脂 CaCO3备注 ⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5 ⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然 ⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然 ⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然 ⑸改进后的斜面液体 保藏培养基 1%1%3%2%1%pH自然 ⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5 ⑺Horyer-Frateur培养 基 3%pH自然 ⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然 ⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3% ⑾产5-酮基葡萄糖酸 盐培养基 3%1%2%2%pH自然 ⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH 7.2 ⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2 ⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。 2.2.3醋酸菌的分离纯化 2.2. 3.1分离纯化实验 称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，

根际细菌分离纯化及鉴定实验方案

根际土壤细菌分离纯化及鉴定实验方案 一、方法： 稀释涂布分离法 二、培养基： 1、GPM 培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar) 2、牛肉膏蛋白胨培养基（NB ） 3、金氏培养基B （King ） 4、CSEA 培养基(Cold extracted soil extract agar) 5、YG 6、NA 7、无氮培养基 8、分解纤维素菌筛选培养基 9、TSA 培养基 三、实验流程 梯度稀释 涂板分离 挑取不同的单菌落于斜面培养 液体培养及液体保种 提取DNA PCR 扩增 酶切带型分型确定操作单元 连接转化 克隆子挑选及PCR 鉴定 测序 序列拼接 建树 采集根际土壤样品

四、具体实验方案 1、采集根际土壤样品：将植株根系及附着的根际土壤一同装入无菌袋带回实验室。 2、土壤样品稀释及选择合适浓度梯度进行涂板分离：梯度稀释土壤样品，取10-1、10-2、10- 3、10- 4、10- 5、10-6六个梯度涂板，每个浓度梯度涂3个平行，过后放于37℃培养箱中培养1-2d观察菌落生长情况。选择合适的浓度平板，根据形态、大小、颜色，挑取不同菌株的典型单个菌落，达到分离纯化的目的。 3、挑取不同单菌落于斜面保种：通过上述的分离纯化步骤，可筛选得到不同的菌株，对筛选到的菌株接种于斜面放于37℃培养箱中培养。最后斜面放于4℃冰箱保存，备用。 4、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于相应的液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min，37℃）培养。过后吸取菌液与灭过菌的甘油按7:3的比例于1.5ml灭过菌的EP管中放于-20℃保种。剩下的菌液用于以下实验。 5、提取DNA（CTAB法）： （1）取1.5ml菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。 （2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。 （3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），混匀，于55℃温育1h。 （4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。 （6）冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP 管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。 （7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。 （8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。 （9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。

醋酸菌

葡萄酒与醋酸菌 梁曼发酵工程2011050783 摘要：葡萄酒是一种成分复杂的胶体溶液，从葡萄汁酿成葡萄酒以后，不管是在酒厂的贮藏阶段，还是装瓶以后，它总是在一刻不停地变化着。由于各种微生物在葡萄酒中的生长繁殖，使得葡萄酒失去了原有的风味，这种现象称为葡萄酒的病害。在酿酒学领域，醋酸菌几乎不受关注，可能是因为醋酸菌是严格好氧菌，因此人们认为该类菌在葡萄酒中不能生存，除了葡萄酒表面能够永久的与空气接触。醋酸菌是葡萄酒酿造中的大敌。凡是有酒花生长之处，就有醋酸菌在一起繁殖；一旦条件具备，会迅速把酒精氧化变成醋酸，使葡萄酒产生醋酸气味，有刺舌感，严重破坏酒质。在发酵过程中，可通过合理措施来防治醋酸菌的污染。 关键词：醋酸菌；醋酸菌污染；防治措施 1葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌 1.1醋酸菌的分类 醋酸菌是能够将酒精氧化成醋酸的一类微生物的总称。醋酸菌是多种形态，细胞椭圆到杆状，0.5-0.8×0.9-4.2微米。单个，成对或成链，不形成孢子。革兰氏染色阴性。醋酸菌是专性好氧菌。有的醋酸菌不会运动，也有具极生或周生鞭毛的运动型。 醋酸菌被分为醋杆菌属（Acetobacter）、酸单胞菌属(Acidomonas)、葡糖醋杆菌（Gluconobacter）、葡糖酸醋酸杆菌（Gluconacetobacter）( Ruiz et al., 2000)。其中关于各属醋酸菌间的不同（表1），主要区别是葡糖杆菌不能将乙醇最终氧化生成CO2和H2O，而其他属均可。 1.2与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌 与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌一般有下列几种：氧化葡糖杆菌、纹膜醋杆菌、巴士醋杆菌、Gluconacetobacter liquefaciens（原来一直被认作是液化醋杆菌）、Gluconacetobacter hansenii（以前一直被认作汉生醋杆菌）。 在未损坏葡萄上发现的醋酸菌主要是氧化葡糖杆菌，菌体数量一般为 102-105cells/mL( Du Toit and Lambrechts, 2002)。人们认为氧化葡糖杆菌低耐酒精能力，所以在酒精发酵过程中很快就死了，在酒中分离得到其细胞数量为104cells/mL(Drysdale and Fleet, 1985)。一般在酒精发酵结束后其细胞数目会减少，为0-102cells/mL( Du Toit and Lambrechts, 2002)。 腐烂或感染灰霉菌的葡萄上醋酸菌数量会大幅度增加，细胞数目由每毫升很少到106cells/mL(Barbe et al., 2001)。葡萄刚污染醋酸菌时，醋杆菌属为优势菌。可能是由于受损葡萄污染了的野生酵母产生的酒精的原因，醋杆菌属能够优先利用酒精作为碳源。 当压榨完的葡萄带皮在较低温度下放置几天，冷浸渍用来在酒精发酵开始前浸提更多色素(Ribéreau-Gayon et al., 2000)。在这段时期内，发酵液的微生物学状态会发生变化，尽管会添加SO2来防止危害酵母菌和细菌的生长。在该过程中，发酵液的pH也会影响醋酸菌的数量：较高pH，细菌数量增加，在这种状况下，较少SO2会产生抗菌作用，而是在较低pH下（pH＜3.5）保持最初的浓度(Du Toit and Lambrechts, 2002)。 由于对酒精耐受力和把酒精作为碳源和能源的偏好的不同，多种醋杆菌经常从葡萄酒中分离得来，而葡糖杆菌常从葡萄汁中分离得到。氧化葡糖杆菌是葡萄与葡萄汁的混合液中主要的菌种。汉生醋杆菌和液化醋杆菌最近被重新指定为汉生氧化葡糖杆菌和液

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

醋酸菌分离及鉴定

醋酸菌分离及鉴定 一、培养基 1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无 水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼 脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌 后培养基温度降到75 ℃左右时加入。 2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5% （体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。 3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分 数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。 二、醋酸菌分离纯化流程 样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管 保藏→产醋酸定性测试。 三、步骤 1 、菌株分离 取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。取 10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中， 30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。

2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面， 4℃冰箱保存。 3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极 其相似的菌株归为一大类。 4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于 装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上 混匀后得到菌悬液。 四、鉴定 1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成 对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。 2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生 长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能 产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生 CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。在斜面培养基上生长良好, 培养2 d后呈油脂状,并产酸。在10% ( v / v)乙醇的培养基上、 Hoyer2Frateur培养液中、30%葡萄糖培养基上均不生长。 五、测试 1、产酸量的测定方法取1 mL 发酵液, 加入10 mL 蒸馏水, 3 滴～ 5 滴0.02 %酚酞酒精溶液, 用标定的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定 至浅粉色。由所耗的NaOH 溶液的量来计算样品中的含酸量(以 醋酸计)。 产酸量( %) =( V- V0) ×CNaOH×0.06×100 %

醋酸菌菌种分离筛选方法

醋酸菌菌种分离筛选方法 醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。 醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。 可进行分离菌鉴别。 1.培养基： 1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000mlCaCO 310-15g95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入）PH自然 1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L酵母膏10g/L CaCO 315g/LPH 6.8 1.3乙醇30mL/L酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO 310-15g/L（常规筛选培养基）PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。 1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO 315-20g/L琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。 1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH 2PO 40.5g/L MgSO 40.5g/L PH 6.5-6.8 2.菌种筛选：

2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中， 130-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。形态与醋酸菌相符即可分离。 2.2混菌法分离：（分离及初筛） 适度稀释10-5、10-6、10-7取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃24-48h。根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。 2.3性能测定：（复筛） 不同菌落接种于液体曲汁乙醇培养基（30-50ml/250ml）中，30℃震荡培养24-48h。2.3.1镜检：染色镜检细胞整齐，椭圆或短杆状，革兰氏阴性菌。 2.3.2性能测定： 醋酸定性分析：取发酵液（离心去菌体）5.0ml于洁净试管中，用10℅氢氧化钠中和PH至7.0，加入1℅三氯化铁溶液2-3滴，摇匀，观察溶液是否变黄褐色，加热共沸，形成红褐色沉淀，原液变无色者为产醋酸细菌。 生酸量测定：1.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。 醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx60.06x10-3/样品毫升数x100 2同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。 3

优势醋酸菌的分离筛选

优势醋酸菌的分离筛选 焦文娟王花秀李鲜鲜彭浩然焦晓阳 周口师院07生物工程（2）班 摘要:利用液醋分离筛选出2株较优醋酸菌,同时对这2株醋酸菌的 产酸速度、耐酒度、耐温度、耐食盐能力、酒精转化率等性能及果汁发酵产生果醋进行了研究。结果表明: 2株醋酸菌产酸速度均较快, 最适发酵温度均为30℃左右;酒精转化率醋酸菌28号为89.0% ,醋酸 菌36号为92.8% ,醋酸菌36号要比醋酸菌28号更耐高浓度酒精;用醋 酸菌36号纯种进行果汁发酵产生果醋,其总酸为42.7g/ L 。 关键词醋酸菌;果醋;耐酸度;耐温度 （-）研究的意义及现在的进展： 果醋作为一种酸性发酵健身饮料,含有丰富的维生素、无机盐、氨基酸和有机酸类,且风味独特,因而深受广大消费者欢迎。在果醋生产中,醋酸菌的性能对产品质量、发酵效率有很大影响。所以,选育产酸快、耐酒度、耐高温、耐食盐、酒精转化率高、适合果醋生产的醋酸菌是一项十分重要的工作。此外，因醋酸菌的活动将乙醇氧化为乙酸，即醋酸，可用于食品酿造中。食醋的酿造大体上可分为表面发酵法和深层发酵法仁忍。这两种发酵方法主要都是依靠醋酸菌的活动将乙醇氧化为乙酸即醋酸。国外对醋酸菌优质菌株的选育和醋酸发酵机理的 研究非常重视, 做了大量工作。国内对醋酸菌优良菌种的应用也日益重视起来, 并积累了不少有关醋酸菌分类鉴定及性能研究的资料。目前我国应用于液体醋生产的醋酸菌有工恶臭醋酸杆菌混浊变种普遍

应用于酿醋生产。最适培养温度28到30度。最适pH值3.5到6.0耐乙醇能力小于0.08, 最高产酸量70到90g/l。能进一步将醋酸氧化为二氧化碳和水过氧化反应。沪酿1.01:罗旺醋酸杆菌,是上海醋厂从丹东速酿醋中分离到的一株优良醋酸菌, 也是我国酿醋行业普遍使用的菌种。沪酿1.079:是1984年从上海醋厂老法发酵醋酷中分离到的一个新菌株。在0.1乙醇时产酸达到63.6g/l, 而且耐乙醇能力达到0.17乙醇时仍能产酸。 （二）材料与方法 1 实验材料 液醋:由大连调味食品厂提供;浓缩苹果汁:由大连真爱果汁公司提供。葡萄酒酵母:由大连轻工业学院微生物教研室提供。 2 实验方法 培养基的制作、酸度测定、醋酸定性试验. 一基础培养基 1%酵母膏,1%葡萄糖。pH 4.5,50000Pa 灭菌30min。使用前加入0.03无水乙醇。 二产酸试验培养基 1’基础培养基临用前加入0.07无水乙醇, 分 装于500ml三角瓶, 每瓶50ml;2’酵母膏1%,pH4.5 使用前按需要量加入无水乙醇, 分装于500ml三角瓶, 每瓶70ml。以上培养基用冰乙酸调pH值。 三分离和斜面保藏培养基 100ml基础培养基中加入2%琼脂, 灭菌 后加入5%无菌碳酸钙和0.03无水乙醇, 为分离培养基。分装试管,灭菌后摆成斜面即为保藏培养

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】

细菌分离纯化及鉴定protocol

细菌分离纯化培养及鉴定protocol 样品菌株分离： 准备工作 1用报纸将平板包好（约12个一包）灭菌后放入烘箱烘干，最好隔夜； 2按照培养基的配方配制好液体培养基后，调pH值（注意灭菌后培养基pH会略有升高），其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼脂后，倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量不能超过锥形瓶的三分之二，约一半左右；剩余液体培养基加入试管中，每支5ml（其中3ml用于保种，2ml用于提取菌株基因组DNA），用胶塞封好，与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌； 3将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟，将灭好菌的培养基放置冷却到不烫手后，在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中，每块板中倒入约20ml，厚度约为培养皿的1/3~1/2之间。倒好后的培养皿叠放在超净台内，待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使用。暂时不用的，可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4在培养皿上写清样品名称，标注日期，姓名。用枪加入100uL液体样品到培养皿上，尽量把培养皿托平，将涂布玻棒插入酒精中取出在酒精灯外焰灼烧完全，待冷却后，在酒精灯下将液体涂布均匀（最好涂布至培养基将液体全部吸收）。 5将涂好的培养皿正置培养2小时后，用封口膜封好，倒置培养。

定时观察平板，描述菌落的颜色、形状，记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化： 1待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用挑取同一培养皿中不同颜色、不同形状的菌落进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标出。 2将接种针在酒精灯外焰灼烧完全，稍冷却后，在平板上进行Z字形三个方向划线。 3若在新板上又长出新菌落，再次分离划线 4划线需做至少2－3次，直至菌落完全纯化（纯化步骤很关键） 保种： 1 将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内（注意要取单菌落），摇床150r/min， 28℃培养，直到其生长至指数期 2在2ml冻存管（预先灭菌并烘干）中加入1ml 30%甘油（甘油预先配置好灭菌后待用），再加入1ml上述1中的菌液，盖紧管盖，混匀后在管壁做好样品标记和日期，同时在实验记录本上做好记录3以上每个样做三管，做好记录，放入冷存盒，放入－80度冰箱内，记录存放位置。 4将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中待提取DNA。 DNA的提取：可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备

一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml

琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧

实验 金黄色葡萄球菌的分离和鉴定

实验题目金黄色葡萄球菌的分离和鉴定 一、实验目的 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。为控制金黄色葡萄球菌的对人的危害，我们要分离出它们并研究。 二、实验原理 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8um左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1—2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10—15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，V—P反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。 三、实验材料和设备 1.培养基 牛肉膏蛋白胨培养基（13%NaCl）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠130g，琼脂15g，蒸 馏水1000ml，121℃灭菌20min后倒平板。 肉汤培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。 甲苯胺兰-DNA平板 2.试剂 磺胺类药物、革兰氏染液 3.仪器和设备 显微镜、超净工作台、水浴锅、培养皿、锥形瓶、移液器、灭菌锅、培养箱、试管、载玻片、接菌环。 四、实验方法 金黄色葡萄球菌的分离： 1.称取5g土样，在无菌条件下放入灭菌的锥形瓶中，加入50ml蒸馏水，再加入200ul 磺胺类药物，振荡10min，使土样充分混匀。利用金黄色葡萄球菌对磺胺类药物敏感性低的特性，杀死其他细菌。 2.从上述锥形瓶中取5ml上清液放入一只干净的试管中，30℃，200rpm，24h。 3.取培养好的菌液，按梯度稀释法稀释土壤悬液，依次制备成100、1000、10000、100000倍悬液后，分别取200ul涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，置于37℃培养箱中培养24h。利用高盐培养基抑制其他细菌的生长，从而分离金黄色葡萄球菌。 金黄色葡萄球菌的鉴定： 1.菌落形态：菌落较小，较湿，较透明，边缘整齐，隆起。

病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可

细菌分离及鉴定的实验方案

从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:

1.1实验总流程 1土壤取样：

2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基

肠道致病菌的分离与鉴定

肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 （1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 （2）掌握平板划线分离法 （3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 （1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 （1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 （2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。

（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与

土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY 本科毕业论文（设计） 题目：土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定 学院：生物科学与工程学院 姓名： 学号： 专业：生物工程 年级： 指导教师：职称： 二0一一年五月

摘要 目的：通过分离、筛选与纯化，从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株。方法：根据解磷圈大小判断其解磷能力。从桔子、柚子、石榴3种不同植物根系土壤中分离出降解无机磷的解磷菌，通过平板法进行初筛，根据水解圈直径和菌落直径比值大小筛选到水解圈直径和菌落直径比值较大的菌株,连续纯培养五代，选择遗传稳定的解磷菌,进一步通过液体摇瓶培养复筛，最后筛选出分解无机磷能力较强且能稳定遗传的菌株。结果：从桔子根际土壤中分离降解出了三株透明圈明显的解磷菌，筛选出两株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的解磷菌，1号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.625，2号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.44，经过五代培养，将稳定性最好的菌株进行液体摇瓶培养7天，然后进行解磷能力测定，测得结果是菌株1号水溶性磷含量为31.13mg ∕L，菌株2号水溶性磷含量为25.43mg∕L，具有较强解磷能力。结论：通过菌落形态观察以及水溶性磷含量的测定结果可鉴定菌株为无机磷解磷细菌。 关键词：果树根际土壤，解磷菌，无机磷，分离，鉴定

Abstract Objective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus XieLin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria, further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrolyzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is, water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured results of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria. Keywords:Fruit trees rhizosphere, XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal