分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆主要技术：
（1）限制性内切酶酶切与连接
基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，而实现该技术的关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。每一种限制性核酸内切酶可以识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。依据碱基互补的原理，在DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段连接到合适的载体上形成重组子。
（2）转化与转染
作为表达载体，必须具有复制起始序列、多克隆位点及选择标记，可以在宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。作为宿主的工程菌或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性，从而易于将细胞表面附着的外源基因吸收到胞内，这一过程即转化（工程菌）或转染（细胞）。
利用选择标记可以很容易鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞，比如抗生素抗性筛选—凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。
（3）聚合酶链式反应
聚合酶链式反应，即PCR。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃（具体退火温度根据引物的Tm值确定）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
整个分子克隆从设计引物开始，根据需要拿到的目的蛋白相应地核酸序列，设计出含有酶切位点及所需Tag的特异性引物，至于设计引物的原则，可以从网上、书上查到，这里不再赘述。以下框架图给出了分子克隆的基本流程：
分子克隆全过程
本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程 克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序 1) 基因组DNA提取（以家蚕为例） 1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在 冰上充分研磨，转入5ml的离心管； 2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h； 3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h； 4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管； 5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清； 6. 重复5，再抽提1次； 7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次 8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的 无水乙醇，充分混匀，4℃过夜 9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干； 10. 200μl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA； 11. 检测OD值； 12. 做好标记，以供进一步实验之用。 2) 感受态细胞的制备 1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时； 2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜； 3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5 h， 使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成） 4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中， 冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！） 5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清； 6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h 后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。可以保存至少6个月。 3) PCR 1、PCR反应体系： ddH2O 37.7 μL 10×PCR buffer 5 μL （25mM） dNTP 4 μL 引物1/2 1μL/1μL Taq酶 0.3μL 模板 1μL PCR反应体系总体积 50 μL 充分混匀，稍离心。 2、PCR反应条件
分子克隆技术试卷
分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？
分子克隆——主要步骤
笔记3（分子克隆2——主要步骤） 分子克隆可以分为以下几个步骤： 分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。 1.带有目的基因的DNA片段的获得： 可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。 2.重组DNA分子的构建： 重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA 分子。在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。
3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选： 重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。 4.特定重组克隆的鉴别： 由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。 此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
分子克隆技术步骤
分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖( 细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体 外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA 和cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。每一cDNA 反映一种mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是：①有些生物，如RNA 病毒没有DNA ，只能用cDNA 克隆； ②cDNA 克隆易筛选，因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息； ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1. 方法： (1) DNA 片段的制备：常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段； ②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。 (2) 载体DNA 的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。 M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF) 在 寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体，又能方便地制备单链DNA ，用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos) 质粒：是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb 的外源DNA 片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA ，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3) DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA 往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。以λ或Cos 质粒为载体时，形成线性多连体DNA 分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4) 引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处 理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA 被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重
克隆技术简介
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
GsDREB1基因的电子克隆及体内结合特异性分析[1]
GsDREB 1基因的电子克隆及体内结合特异性分析 摘要：应用电子克隆技术预测到了一个5＇端缺失的contig5，并根据栽培大豆与野生大豆相关基因相似性很高的特点，将GmDREB 1基因的5＇端序列填补到contig5片段的5＇端上，此序列命名为contig5Gm 。ORF 预测结果表明，contig5Gm 只有一个开放阅读框。经RT-PCR 验证，分别得到了与contig5和contig5Gm 大小一致的片段。经克隆、测序发现，contig5Gm 与GmDREB 1基因序列相似性为99％，将其命名为GsDREB1。利用酵母单杂交系统对GsDREB1进行了体内结合特异性分析，结果表明，GsDREB1能够与DRE 顺式作用元件发生特异性结合。 关键词：DREB ；电子克隆；野生大豆；结合特异性；转录因子中图分类号：Q786；Q785 文献标识码：A 收稿日期：2008-03-03 基金项目：国家重大基础研究专项（973）前期项目（2003CCA03500） 作者简介：李莹（1980-），女，吉林人，硕士研究生，研究方向为植物基因工程与分子生物学。 *通讯作者E-mail:lijie_neau@https://www.360docs.net/doc/48189764.html, 转录因子又称反式作用因子，能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，通过它们之间以及其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制转录［１］。 ＤＲＥＢ蛋白含有ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ保守结构域，是一种极其重要的转录因子，广泛存在于被子植物中。多数ＤＲＥＢ类转录因子，如拟南芥ＤＲＥＢ１／２含有一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域［２－４］，通过与ＤＲＥ顺式作用元件相互作用调控相关基因表达［５］。目前在拟南芥中发现６种DREB １基因和８种DREB ２基因。ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ和ＤＲＥＢ１Ｃ诱导冷胁迫相关基因的表达，ＣＢＦ４／ＤＲＥＢ１Ｄ与ＤＲＥＢ１Ａ有很高的同源性，含有完整的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域，但是ＣＢＦ４／ＤＲＥＢ１Ｄ却只受冷胁迫以外的其他渗透胁迫诱导［６－７］，ＤＤＦ１／ＤＲＥＢ１Ｆ和ＤＤＦ２／ＤＲＥＢ１Ｅ受高盐胁迫诱导［７－８］。ＤＲＥＢ２Ａ和ＤＲＥＢ２Ｂ同时受干旱胁迫和高盐胁迫诱导［４］。ＤＲＥＢ２Ｃ、ＤＲＥＢ２Ｄ和ＤＲＥＢ２Ｆ在叶子中被高盐胁迫诱导，ＤＲＥＢ２Ｅ只受ＡＢＡ诱导，在根中有少量表达。Ｓａｋｕｍａ等发现ＤＲＥＢ２Ｇ和ＤＲＥＢ２Ｈ在干旱和冷胁迫诱导下并不表达［７］。最近，Ｓａｋｕｍａ等发现，ＤＲＥＢ２Ａ的Ｃ末端区域是 转录激活区，它的中间区域是负调控结构域［９］。以上研究表明，ＤＲＥＢ类转录因子基因有着相当复杂的调控机制，克隆新的DREB 基因对于阐明ＤＲＥＢ类转录因子的调控机制和植物抗渗透胁迫基因工程都有着重要的意义。 随着人类基因组测序和生物信息学技术的迅猛发展，表达序列标签（ＥＳＴ）成为人类寻找未知功能基因和克隆不同时空差异表达基因的重要途径。基于ＥＳＴ的电子克隆（in silico ｃｌｏｎｉｎｇ）策略已成为克隆新基因的主要方法。 电子克隆的技术原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过ＥＳＴ或基因组的序列组装和拼接，利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法快速地获得新基因［１０］。由于受到序列数据丰富度的限制，在植物领域基因克隆仍以常规的实验方法为主，但随着ＥＳＴ数据库的不断完善，利用生物信息学的方法进行某些植物基因的电子克隆已经成为可能［１１］。 本试验拟应用电子克隆技术，在耐盐野生大豆中克隆ＤＲＥＢ类转录因子基因，为ＤＲＥＢ类转录因子的调控机理研究和应用研究奠定基础。 １材料与方法 1.1材料1.1.1 植物材料 耐盐野生大豆５０１０９，由吉林省农科院提供。 李莹，才华，李 勇，李 杰*，刘西燕，田 佳 （东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030） 第３9卷第11期东北农业大学学报39(11):56~61 ２００8年11月Journal of Northeast Agricultural University Nov.2008 文章编号 １００５－９３６９（２００8）11－0056－06
基因克隆技术的研究进展_钟军
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.360docs.net/doc/48189764.html,
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
分子克隆技术实验讲义2016.3(最终版)
分子克隆技术实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2016年3月 甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定 一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。 5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识 （一）T载体的制备 pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点，用Eco RⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。 （二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆） 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。 相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。 （三）大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。 相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。 （四）重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降
分子克隆实验标准步骤
分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程： 二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1） 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例 体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞
2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2） 琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3） 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中， 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4） 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5） 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A
EST电子延伸克隆专题讨论总结
【EST电子延伸/克隆】专题讨论总结 目的： 方便后来战友的参考，积累资源。 原因： 1。最近求助较多； 2。是一种较常用的生物信息学手段。 形式： 1。可以为原创总结 2。可以为本版关于EST电子延伸讨论的总结(需要有连接) 3。以上二者结合（推荐） 内容： 1。在线/离线的工具，并简单介绍优缺点。 2。推荐优秀的工具。 3。可能存在的问题以及解决方法的探讨。 4。以上3点并不强求全部都有，能就一点深入即可。 5。也可提供线索。 奖励： 1。积分奖励：根据总结的情况，奖励底线：3分，最高奖励：20分或更高，不设上线（适用于自编软件）。 2。提供线索视情况加1-2分。 2。战友的点击、浏览、学习、肯定、收获、回报其实才是最大的奖励 衷心感谢参与讨论的诸位战友： starrweb；wxbing； tussah ；yinhp01 ；crickfrancis； hxygz ；sunxjk ；fxd ；楚布衣；ke nmed ；稀糊醋鱼；tonyybn ；yxiangmind； huazii_2003 ；Gmail ；newdragon； xiaoxiao ；ttdcs ；magicwang； tussah ；jef。 你们的参与促成了讨论的成功。 感谢magicwang；yinhp01；crickfrancis的精心总结，你们的工作使得大家的讨论更有意义。 --------imsupergene
电子克隆简介 新基因搜寻和蛋白质功能分析是人类基因组图谱公诸于世后的研究热点，电子克隆技术以数学为核心，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序列标签（EST）和生物信息数据库，可以加速对人类基因组未知功能新基因的发掘，为人类功能基因组学与蛋白质组学研究提供新的线索和基础。利用电子克隆并结合实验验证可以纠正或避免现有的人类基因组编码序列错误。 电子克隆定义： 依托现有的网络资源等,用同源性检索、聚类、序列拼装等获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。其方法是以目的EST作为种子序列，对选定的dbEST进行同源性搜索，将所选高度同源的ESTs归类，作为种子序列库，进行序列拼装，构建序列重叠群，再以此重叠群为种子序列重复进行同源性搜索、聚类、拼接直至无法进行，已达到最有效延伸。 电子克隆意义： 获得整个编码区或者可变剪接体，寻找全长基因并发现新基因，加速基因结构、功能研究的进程，推动比较基因组学的发展和基因的进化的研究。（以前我以为是设计好的引物做BLAST，观察引物的好坏，哈哈） 具体步骤: 获得了感兴趣的并可能有潜在功能位点的EST，以此EST为种子序列采用dbEST进行同源性搜索，以期获得有片段重叠、同源性高的ESTs。经聚类分析，尽量避免含有旁系同源基因，拼接后产生的序列重叠群，这相当于实验中的一部分cDNA步移工作。以新获得的为种子序列重复进行上述两步骤，至不能获得延伸为止。进行实验，PCR反应获得拼接片段，继续步移，最终获得全长cDNA序列。将新基因对非冗余库进行搜索，以证明这是个全新基因。将新基因注册，获取注册号。 普适性:这得取决EST数目大小，能否覆盖基因组的转炉产物。 大规模EST克隆新基因方法： 大概思路可否如下:组织文库基因获取---模拟消减杂交(类似试验中的SSH)---克隆全长cDNA---电子拼接、RACE----基因全长--功能域、功能基序分析--染色体定位--功能预测---推断新基因的功能----最终可获得一到几条序列即可。 如果能从现有的EST库中寻找差别：如正常组织和肿瘤组织的EST差别。甚至自己仅仅构建一些膜蛋白的文库，利用跨膜蛋白的保守区域克隆所有的细胞表面蛋白，分析表达差异，看看能否和理论预测达到比较好的吻合。 ------yxiangmind 电子序列延伸的生物信息学策略： 1.利用序列同源性比较软件将待进行电子延伸的序列的序列（以下简称种子序列）对库检索。 2.从数据库中挑选出全部相关序列。 3.对所有序列进行片段整合分析（即CONTIG分析），形成延伸后的序列。 4.将新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能被进一步延伸为止。 --------tussah 序列分析，电子克隆等初探 生物信息学可指利用信息技术管理和分析生物学数据。这就意味着生物信息学所涉及的范围相当广泛，从人工智能、机器人一直到基因组(genome)分析。就基因组分析这一角度来看，生物信息学主要是指核酸和蛋白质序列数据的计算机处理和分析。近年来，蛋白质结构数据的快速增长，使蛋白质三维结构的处理分析也归入到生物信息学的范畴。