蛋白质结构解析研究进展作业

《蛋白质结构解析研究进展》

一、蛋白质结构分类

人类对于进化的认识及蛋白质结构相似性比较的研究使蛋白质结构分类成为可能，而且近年来取得的研究进展表明，大部分蛋白质可以成功的分入到适当数目的家族中。目前国际上流行的蛋白质结构分类数据库基本上采取两种不同的思路，一种是数据库中储存所有结构两两比较的结果；第二种思路是致力于构建非常正式的分类体系。由于所有分类方法反映了各研究小组在探究这个重要领域的不同角度，所以这些方法是同等有效的。目前，被广泛应用的四种分类标准是：手工构造的层次分类数据库SCOP，全自动分类的MMDB和FSSP，和半手工半自动的CATH。

蛋白质结构自动分类问题可以被纳入机器学习的范畴，通过提取分析蛋白质结构的关键特征，构造算法来学习蕴含于大量已知结构和分类的数据中的专家经验知识，来实现对未知蛋白质结构的分类预测。目前，对蛋白质结构的不同层次分类，结果比较好的机器学习方法是：神经网络多层感知器、支持向量机和隐马尔可夫模型。支持向量机应用于分类问题最终归结于求解一个最优化问题。上世纪90 年代中期，隐马尔可夫模型与其他机器学习技术结合，高效地用于多重比对、数据挖掘和分类、结构分析和模式发现。多层感知器即误差反向传播神经网络，它是在各种人工神经网络模型中，在机器学习中应用最多且最成功的采用BP学习算法的分类器。

二、蛋白质结构的确定

蛋白质三维空间结构测定方法主要包括X射线晶体学分析、核磁共振波谱学技术和三维电镜重构，这三种方法都可以完整独立地在原子分辨水平上测定出蛋白质的三维空间结构。蛋白质数据库PDB中80%的蛋白质结构是由X射线衍射分析得到的，约15%的蛋白质结构是由核磁共振波谱学这种新的结构测定方法得到。

1、X射线晶体学

X-射线晶体学是最早也是最主要的测定蛋白质结构的方法，第一个蛋白质的三维结构——血红蛋白的结构就是通过X-射线晶体学方法解析的。目前PDB中收录的蛋白质的结构85%左右是利用X射线晶体学方法解析的。X射线衍射法的分辨率可达到原子的水平，使它可以测定亚基的空间结构、各亚基间的相对拓扑布局，还可清楚的描述配体存在与否对蛋白质的影响。蛋白质晶体结构的X 射线衍射分析包含样品制备、蛋白质结晶、衍射数据收集和处理、相位求解、模型建立和修正等五个主要步骤。五个步骤彼此密切相关，每一个部分取得进展可以加快下一步的研究，同样任何一个部分的瓶颈也可以成为下一步的限速步骤。其中样品制备和蛋白质结晶阶段是要获得足够量的蛋白样品以及可以用于衍射数据收集的高质量单晶，前者可以通过针对所选目的基因的特性构建和改造高效表达质粒，而后利用多种表达系统，高质量单晶的获得是蛋白质晶体结构研究的主要瓶颈之一，由于不同蛋白质的物理化学性质差别以及各种修饰和相互作用更增加了蛋白质的复杂性，所以不是所有的蛋白质都可以获得单晶的。

1990 年以后，利用X-射线晶体学解析蛋白质结构取得了突飞猛进的发展，目前平均每天有15个蛋白质通过该方法获得结构。X-射线晶体学的缺点是分子在晶体中往往是被锁定于某一状态，所得到的晶体往往是分子处于基态或不同构象的平均，而化学分子行使功能时多发生在激发态、过渡态、X-射线晶体技术很难捕捉到分子的动态信息。但是无论怎样，X-射线晶体学方法无论过去、现在或将来都会是蛋白质结构研究的主要方法。

2、核磁共振波谱学

多维核磁共振波谱学是对X-射线晶体学的有力补充。目前，该技术已经成为确定蛋白质和核酸等生物大分子溶液三维空间结构的主要手段。核磁共振波谱学技术在蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA等分子间的相互作用方面，具有高分辨率的特点，仅次于X-射线晶体学技术，可以在溶液中操作，在近似蛋白质生理环境下测定其结构，甚至可以对活细胞中的蛋白质进行分析，获得“活”的蛋白质结构。NMR技术最大的优点不在于它的分辨，而在于它能对溶液中和非晶态的蛋白质进行测量。在晶体结构分析中给定大量结构因子，确定电子密度分布函数的位相的问题，其实就是从图像分析得到结构坐标数据过程中出现的数学问题。核磁共振波谱学技术在分析蛋白质折叠稳定性、运动性和蛋白质复合体中各亚基的

相互作用方面具有优势。核磁共振波谱学技术的缺点是只能测定小蛋白和中等大小的蛋白质分子（相对分子质量一般在30000以下），并且图谱分析工作极为费时，往往需要数月到一年的时间，导致实验周期延长，速度缓慢；另外核磁共振衍射技术的反应是在溶液中进行的，研究对象必须是可溶的蛋白，对不溶蛋白的研究就比较困难；而且样品需要同位素标记等，这些在一定程度上制约了核磁共振波谱学技术的应用。

Karle和Hauptman采用的非线性最小二乘法和联合概率分布方法成功解决了小蛋白分子的位相问题。对于巨大蛋白分子的位相问题，Bricogne结合贝叶斯统计和信息论方法给出了解决方案，当给定蛋白质结构中部分原子的距离时，求解原子坐标的方法是将距离空间的约束矩阵转化为坐标空间的矩阵，由坐标空间矩阵构建蛋白质分子的初始矩阵，运用模拟退火等算法对初始结构进行优化，经分子动力学进行能量最小化，由此得到一组收敛的蛋白质三维结构的坐标。关于蛋白质的氨基酸序列分析。到目前为止，经典的蛋白质的氨基酸序列分析方法是Sanger等人基于Edman降解原理研制的液相蛋白质序列仪，及后来发展的固相和气相的蛋白质序列分析仪。人们通过串联质谱技术（MSPMS）和源后衰减基质辅助的激光解析P离子化（PSD-MALDI-MS），就可以从质谱分析中获得多肽及蛋白质的结构信息。

随着一些新技术的发现，如G矩阵傅立叶变换式核磁共振波谱学技术等，使得核磁共振波谱学的发展速度也很快，目前PDB中收录的蛋白质的结构15％左右是利用核磁共振波谱学方法解析的，其快速发展主要归功于以下几个方面：仪器技术的不断发展，计算速度的飞速提升和实验方法上的不断创新和发展。1990 年以前平均每年只能解10个结构，现在平均每天可以解2个结构，相信随着核磁共振波谱学技术不断的改进和发展，核磁共振波谱学技术在未来结构生物学上的贡献将会越来越大。

3、三维电镜重构

电子显微镜在结构生物学中的应用近年来变得越来越重要，成为解析大型蛋白质复合体、病毒乃至细胞器的三维纳米分辨率结构的有力手段，同时电子显微镜二维晶体学在膜蛋白的三维精细结构解析上也有特殊的优势。冷冻电镜三维重构的基本技术路线为：利用快速冷冻技术对样品进行冷冻固定，然后利用冷冻电

镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像，利用高灵敏底片进行成像记录，利用高分辨率扫描仪对底片进行数字化，对数字化的图像进行二维图像分析——选点、分类、校正和平均，最后完成样品的三维重构计算。自从1968年DeRosier 和Klug第一次用电子显微镜对T4噬菌体的尾部进行了结构解析至今，已有140余种蛋白质通过该方法获得了结构，尤其是最近5年随着计算机图像处理技术和显微镜设备的不断发展，使得三维电镜重构技术成为继X-射线晶体学和核磁共振波谱学技术后，蛋白质结构研究的另一种重要方法。三维重构技术的优势在于：（1）可以直接获得分子的形貌信息，即使在较低分辨率下，电子显微学也可给出有意义的结构信息；（2）适于解析那些不适合应用X-射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品，如难以结晶的膜蛋白、大分子复合体等；（3）适于捕捉动态结构变信息；（4）易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；（5）电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X-射线晶体学直接和方便。

三、药物研究中发挥的作用

根据预测蛋白质结构大概有2000种不同的折叠类型，3000-5000 蛋白质超家族，当前为止，仅发现1000余种不同的折叠类型和1600种蛋白质超家族。人类基因组测序研究揭示，人体大约有3万个编码蛋白质的基因，这就是说，人类生命过程中大约需要3万种不同的基础蛋白质，它们在生命活动中发挥着重要功能，而这些功能的发挥则依赖于这些蛋白质的三维结构。因此，获得这些蛋白质并阐明它们的精细三维结构及与其生物功能的关系，成为揭示生物体活动本质的关键一步。近年来基因组工程的迅猛发展及生物信息学的新进展，给结构生物学分析开创了道路，使此目标的实现成为可能。

随着人类基因组计划的执行，找到人类5万到10万个基因的碱基序列是指日可待的事，因而确定人的上千万个原癌基因和几万个与疾病有关基因表达产物的氨基酸顺序也会逐渐实现。然而要了解它们的功能还必须知道它们的三维立体结构，且药物设计、基因芯片均需要知道三维结构。当前，虽然众多技术为蛋白质空间结构测定提供了有效的实验手段，但蛋白质三维结构的增长速度远远小于蛋白质序列的增长速度，并且这些方法仍然存在局限性。于是要求现代生物信息

学工作者运用数学物理思想、方法和计算手段进一步研究分子生物机理，使人类更准确地掌握蛋白质结构知识，从而促进生物学、医学、药学等生命科学领域的发展。

对蛋白质结构的研究是蛋白质研究中的核心内容之一，虽然它还处于一个初级发展阶段，其研究方法和系统还不够完善，但随着其不断深入发展，相信在揭示诸如生长、发育和代谢调控等生命活动规律上将会有所突破。蛋白质结构研究将为从细胞和分子水平上探讨人类重大疾病的机制、诊断、防治和新药开发提供重要的理论基础从而使蛋白质科学研究达到一个新的高度。