无菌检查标准操作程序

1.目的：建立无菌检查标准操作程序，规范检验操作。

2.范围：适用于本公司产品无菌检查—薄膜过滤法的操作。

3.职责：检验人员对本程序的实施负责。

4.本规程的编制依据为2010年版《中华人民共和国药典》二部附录“无菌检查法”中的“薄膜过滤法”。

5.检验环境要求：

5.1本项检查应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。

5.2检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

5.3单向流空气区、工作台面及环境应按《洁净厂房环境监测规程》（SOP-）及《沉降菌监测的标准操作规程》（SOP-）、《洁净室悬浮粒子数测定的标准操作规程》（SOP-）定期进行洁净度监测。隔离系统按相关要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

6.操作规程：

6.1培养基的准备：

6.1.1培养基的制备：按《培养基配制、灭菌的标准操作规程》（SOP-）制备。

①硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）。

注意：在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并应防止污染。

②改良马丁培养基（用于培养真菌）。

6.2培养基的适用性检查

每批培养基应按《无菌检查的标准操作规程》（SOP-）进行培养基的无菌性检

查及灵敏度检查。

只有本项检查合格的培养基方可用于供试品无菌检查。

本项检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

6.3稀释液、冲洗液及其制备方法：

6.3.1 0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至

7.1±0.2，分装，灭菌。

6.3.2 pH

7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

6.4仪器、用具的准备：

①过滤器：洗净，安放孔径不大于0.45μm亲水性的微孔滤膜（用前用水浸润），用牛皮纸包裹，置高压蒸汽灭菌器内，于121~126℃湿热灭菌20分钟。

②不锈钢剪刀、镊子、注射器、针头、烧杯：洗净后，置适宜的密闭容器中，于160~170℃干热灭菌2h。

③无油式真空泵、耐压软管、缓冲瓶等。

6.5阳性对照的制备：

6.5.2.1根据供试品的性质，选择阳性对照菌：

①无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；

②抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；

③抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；

④抗真菌的供试品，以白色念珠为对照菌。

6.5.2.2阳性对照试验的菌液制备：按《无菌检查的标准操作规程》（SOP-）中“培养基灵敏度检查”中制备，大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌。

6.6供试品的处理：

6.6.1根据各品种项下的规定随机抽取规定数量的供试品。

6.6.2用消毒液对供试品及检验用具的外表面擦拭消毒后，移入无菌检查室内。

6.6.3供试品外部消毒：先用75%酒精棉球擦拭供试品外壁及瓶盖，待干，用消毒镊子去除铝塑盖上的塑盖，用75%酒精棉球擦拭胶塞及铝盖。并用酒精棉球盖于塞上待取样。

6.6.4供试液制备：用灭菌镊子取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，供试品瓶盖和注射器针头均迅速通过火焰数次，用注射器吸取适量的稀释液在已消毒好的穿刺部位刺入小瓶加入溶剂，使溶解，混匀后，将供试品溶液全部转移至灭菌烧杯中，混匀。

6.7薄膜过滤

6.7.1安装薄膜过滤器：用耐压管将过滤器与缓冲瓶瓶及真空泵相连。

6.7.2过滤少量的冲洗液以湿润滤膜。

6.7.3将供试品溶液注入过滤器中，启动真空泵进行减压抽滤。

6.7.4如供试品具有抑菌作用，需用冲洗液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，冲洗次数不得少于3次。（具体品种的冲洗次数，需经验证确定，总冲洗量不宜过大，以免滤膜上的微生物受损伤。）

6.8打开过滤器，用灭菌镊子将滤膜取出，用灭菌不锈钢剪刀将滤膜分成三等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份做阳性对照用。

6.9向上述阳性对照容器中加入小于100cfu的阳性对照菌。

6.10阴性对照：取相应的稀释液和冲洗液同法操作，滤膜分成二等份，分别加至硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基中，作为阴性对照。

6.11培养与观察：

6.11.1将硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃，改良马丁培养基置23~28℃培养14天。

6.11.2培养期间，逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管培养48~72小时，应生

长良好。阴性对照不得有菌生长。

6.11.3如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基上是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片、染色，镜检，判断是否有菌。

6.12结果判断

①若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；

②若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。

③当符合下列任何一个条件时，方可判试验结果无效：

ⅰ）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；

ⅱ）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；