放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告
放线菌抗生素得发酵及目得产物得提取
一、实验目得
1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法
2、了解与掌握种子制备与摇瓶发酵技术与方法
3、了解抗生素发酵得一般规律与代谢调控理论
４、了解小型发酵罐得基本结构
５、熟悉掌握小型发酵罐得使用方法与保养
6。掌握抗生素生物效价测定得原理与方法;
7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关得操作方法、
8、掌握放线菌次级代谢物得初步纯化及牛津杯实验得基本原理与操作技术
二、实验原理
①发酵罐就是进行液体发酵得特殊设备。生产上使用得发酵罐容积大,均用钢板或不锈钢板制成;供实验室使用得小型发酵罐,其容积可从约lＬ至数百升或稍大些。一般来说,5L以下就是用耐压玻璃制作罐体,5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器与各种电极,可以自动地调控试验所需要得培养条件,就是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需得设备、
②抗生素(antibｉotics)就是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生得具有抗病原体或其它活性得一类次级代谢产物,能干扰其她生活细胞发育功能得化学物质。现临床常用得抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学
方法合成或半合成得化合物。
③放线菌发酵结束后,次级代谢物可能与菌体结合,工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理,释放与菌体结合得次级代谢物,并采用加热发酵液７0 ℃,2 min使蛋白凝固,所得酸性滤液,在经碱处理,进一步去除蛋白、
抗生素得效价常采用微生物学方法测定,它就是利用抗生素对特定得微生物具有抗菌活性得原理来测定抗生素效价得方法,如管碟法。管碟法就是目前抗生素效价测定得国际通用方法,我国药典也采用此法。管碟法就是根据抗生素在琼脂平板培养基中得扩散渗透作用,比较标准品与检品两者对试验菌得抑菌圈大小来测定供试品得效价。管碟法得基本原理就是在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管(内径6。０±0、ｌ mm,外径8、0±０。ｌ mm,高10±０。ｌｍｍ),管内放人标准品与检品得溶液,经16～１8小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIＣ(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明得无菌生长得区域,常呈圆形,称为抑菌圈。根据扩散定律得推导,抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系,比较抗生素标准品与检品得抑菌圈大小,可计算出抗生素得效价、
常用得管碟法有:一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品与供试品各稀释成一定浓度比例(2:1或4:１)得两种溶液,在同一平板上比较其抗药活性,再根据
抗生素浓度对数与抑菌圈直径成直线关系得原理来计算供试品效价。取含菌层得双层平板培养基,每个平板表面放置4个小钢管,管内分别放入供试品高、低剂量与标准品高、低剂量溶液。先测量出四点得抑菌圈直径,按下列公式计算出检品得效价、
（1）求出Ｗ与V: W=(ＳH+ＵH)－(SL+ＵL) (式 2。10-1)
V=(UH＋ＵL)－(ＳH＋SL) (式２.10-2)
式中:UH:供试品高剂量之抑菌圈直径;
UL:供试品低剂量之抑菌圈直径;
SＨ:标准品高剂量之抑菌圈直径;
SL:标准品低剂量之抑菌圈直径;
（2）求出θ: θ=Ｄ·aｎtilog(ＩV／W) (式 2。10-３)
式中:θ:供试品与标准品得效价比;
D:标准品高剂量与供试品高剂量之比,一般为1
Ｉ:高低剂量之比得对数,即ｌｏg2或lｏg4。
⑶求出Pr :Pｒ= Ａr×θ(式 2、１0—4)
式中:Ｐｒ:供试品实际单位数;
Ar:供试品标示量或估计单位
④甲醛滴定法测定氨基氮含量:水溶液中得氨基酸为两性离子,因
而不能直接用碱滴定氨基酸得羧基、用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合,可形成羟甲基衍生物,使NＨ3+上得H＋游离出来,这样就可用碱滴定NH３+放出得H+,从而计算出氨基氮含量。如样品中只含有某一种已知氨基酸,由甲醛滴定得结果即可算出氨基氮得含量、如果样品就是多种氨基酸得混合物(如蛋白质水解物),则滴定结果不能作为氨
基酸得定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质得水解程度,随着水解程度得增加,滴定值增加,当水解完全后,滴定值保持恒定。
甲基红得变色范围就是PH４。4~6。2,意思就是说:
1、其pH值在4。４～６。2区间时,呈橙色,
2、其pH值≦4。4时,呈红色,因就是靠近酸性强得一边时得颜色,故又称之为酸色、
3。其pH值≧6、2时,呈黄色,因就是靠近碱性强得一边时得颜色,故又称之为碱色
二、仪器与材料
(一)培养基
高氏一号培养基:
可溶性淀粉2０、０g NaCｌ０.5g KNＯ3 1.０ｇ
K２HＰO40。5ｇ MｇSO4.7Ｈ2Ｏ０、５g FｅSＯ4、7Ｈ２O 0、01g
蒸馏水 1000mｌ,ＰＨ７.4,
发酵瓶培养基:
①淀粉3%,葡萄糖2%, 黄豆饼粉2.５％, 蛋白胨０、5% ,
酵母粉０.5%,MgＳＯ40。1％,(NH4)2ＳＯ4 0、３%, KH２PO
0。03%,
４,
ＣaCO３0、4%,PH 6.0。
②黄豆饼粉4g,淀粉10g, 酵母粉0。25 ｇ, 蛋白胨１。５g,
MgＳO40。025 g, CaCO3 0、4g,(NH4)２SO4 ０。3 ｇ,
α—淀粉酶(1０5ｕ/ml) 0、01ｍl.100ml PH7。4—7、6
③可溶性淀粉2、0ｇ,NａCl 0。05g,ＫＮＯ3 ０、1g, K２HPO40。05ｇ,
MgSO４.7H2O 0、05g, FeSO4、7H2Ｏ0、001g,
加蒸馏水至１00ml,PＨ7.4,
牛肉膏蛋白胨
牛肉膏(５。0ｇ),蛋白胨(10.0g), ＮaCl(5g),蒸馏水(10０0ｍＬ),pＨ7.２～7。4 发酵罐培养基(2L):
黄豆饼粉 80g 淀粉200g
酵母粉 5 g 蛋白胨 30g
MgＳO4０、5 ｇ CaＣO38g
(NH4)2SO4 6 g
?-淀粉酶(１05u/ｍl) ０。２ｍｌ
(二)流加补料
碳源:葡萄糖(1０%)３０0ｍl,控制１%;２000＊1%=20g,200ｍｌ氮源:硫酸铵(1０％)２50ｍl,控制16％
调PＨ值:0。１MHCl ０。1MNａＯH
(三)分析指标及方法所用试剂及溶液
①测残糖-ＤＮS法
1.3,５二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):将6。3ｇ得３,５二硝基水杨酸与２moｌNａOH溶液加到500ml含有182g酒石酸钾钠得热水溶液中,再加5g结晶苯酚与5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容到1０00ml
2.1、0mg/mｌ葡萄糖溶液:称取1g葡萄糖,加蒸馏水定容到1L。
3、６moｌ/l氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠2４ｇ,加蒸馏水定容到１00ml。
4。6mol／ｌ得盐酸:取浓盐酸49。6８mｌ,加蒸馏水定容到100ml。
②测残氮得方法－甲醛法
１。甲基红:0、1ｇ甲基红,用95％乙醇定容100ｍl、
2. 0、３mol／LHCL:取浓盐酸2、48mｌ,加蒸馏水定容到100ｍl。
3。 0.028５8mol／ＬNａＯH:称0、1１432g,定容100ml、
4、 1%酚酞指示剂:称取1ｇ酚酞指示剂粉末。溶于100ml 95%乙醇溶液中。
5。 95%乙醇:取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值１00ml。
6.18%中性甲醛:取４8ml 38%得甲醛加入小于100mｌ容量
瓶,往溶液中加两滴酚酞用氢氧化钠滴定刚好变红,定容到10０ml。（四）器材
玻璃试管、试管架、吸管(1ml,2ml,10ml)、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶(250 ml,５0０ml)、量筒(250ml,500ｍl,1000ｍｌ)、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲(针)、振荡培养箱、恒温箱、台秤、５L-发酵罐,无菌室、培养皿(直径9 cm)、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台,无菌培养皿,酒精灯,牛津杯,镊子,移液器等等
(五)、生物效价测定所需材料
(１)菌种:大肠杆菌(Escｈerｉcｈｉａ coli),菌液浓度约为1０6个/mL。菌株保存得时间过久,影响其对抗生素得敏感度,导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯,也会造成这样得结果、因此,菌液在使用一段时间后,可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中得稀释倍数。
(2)抗生素标准品与供试品:头孢拉定标准品与供试品、
(3)培养基:效价检定用培养基1号、
(4)无菌缓冲液:称取磷酸氢二钾５、59ｇ,磷酸二氢钾0。41g,加水１000mL,即为ｐH 7.8得磷酸盐缓冲液。制备缓冲液得试剂应为分析纯,配制后得缓冲液应澄清,分装于玻璃容器内,经121℃蒸气灭菌3０ miｎ备用、
(5)草酸,1０ M NａOH
四、实验步骤
⑴筛选高产放线菌
从土壤里筛选出高产放线菌,于斜面培养基中保藏
⑵接种
在超净工作台上,将长好得斜面孢子用无菌接种针挖块约0、5×1ｃm2,接种于灭过菌得高氏一号培养基中。
⑶培养
将接种好得种子摇瓶于28℃恒温室摇床上,转速为20０ｒ
/min,培养48小时左右。
⑷实罐灭菌
１、将冷凝水管路断开,拔下电极,打开罐盖,将发酵培养基装入发酵罐及补料瓶,易产生泡沫得培养基尽量不要超过两升。
２、连接管路:取样管路连接,补料管路连接;空气过滤器用硅胶管与罐盖空气管连接,并用弹簧夹夹紧;排气口与过滤器用硅胶管连接;安装温度电极、ｐH电极、溶氧电极,pH电极用们帽盖紧电极上端口,溶氧电极用铝铂纸包裹电极上端口,防止受潮。盖紧其它罐盖接口。
３、提起玻璃罐体及补料瓶放入灭菌锅,盖好牛皮纸,盖好锅盖,确定发酵温度及时间。? 4、灭菌结束后,尽快将罐放回原位并尽快通入空气。
⑸发酵操作
１、将灭菌后得罐体放回原位,连接冷凝水管路,通入冷凝水,
连接通气管路,调整通气量至3～5L/min。
3、补 2、将温度电极、ｐH电极、溶氧电极与控制器连接。?
料管连接:打开补料蠕动泵防护盖,搬开进出口处得白色管夹,将硅胶管嵌入入口处得管夹并夹紧,用手转动泵头,将硅胶管沿凹槽安装直至出口处,开手动开关约十秒后夹紧出口处管夹,关手动开关;将酒精棉球放在罐盖补料口内,将针头插入并穿透密封盖;?打开蠕动泵手动开关,使输液管中充满料液,置于自动状态。
⑹接种
将培养48小时得摇瓶种子接种于发酵罐中,使用接种圈放置酒
精棉点燃,进行无菌接种,接入１00ml种子。接种后立即进行第一次
取样。
⑺发酵生产
⑻发酵过程得测定:
①发酵液状态观察:粘度、颜色、气味、菌丝形态
②发酵中残糖得测定-DＮS法:
１。取1。０mｇ/ml葡萄糖标准溶液,按下表加入试剂。沸水浴加热５mｉn,冷水冷却定容至2５ml摇匀,在52０nm按波长测吸光度。
编号葡萄糖标准溶液/ml 水/ml 溶液糖含量/mg Ｄ
NS试剂／ml
２。取发酵液0、5ml 置于50ml 容量瓶中,加6mol/ｌ得盐酸溶液2m ｌ,在沸水溶液中加热15m ｉn 水解,冷水冷却后及时6ｍｏl ／l 氢氧化钠溶液1.8m ｌ,并定容到5０ml 得总糖水解液。
3、取总糖水解液2ｍl 于25ml 比色管中,加入D ＮS 试剂1。5ml 沸水浴中加热5min,冷水冷却后定容至２5ml 摇匀,以空白作对照在５2０ｎm 波长测吸光度、
氨基酸氮得测定:甲醛法(陈钧鸣与徐玲娣,１991)。取2ml 发酵液滤液于三角瓶内,加蒸馏水10ｍl,甲基红指示剂2滴,用O 。3MHCI 调节pH 至溶液呈红色,再用0。0２858MNaOH 溶液调pH 至溶液呈橙色(中性),加18％中性甲醛溶液4m ｌ,摇匀,静置10m ｉn,加l%酚酞指示剂8滴,用0。０2８58N Ｎa ＯH 标准溶液滴定至微红色为终点。氨基氮得计算公式为:氨基氮(mg/l ００ml)＝滴定体积＊20。
0 0?2 0?1。５
1?0。2 １。8
０.2 1。５ ２?0、4?1.6 0。4?１、5
3 ０、6? 1、
4 ０.６? 1。5
４ 0、8
1、2 0。8 1、５
５?1。0 1、0?1、０ 1、5
6 １。2?0.8 1.2 1、5
7 1。4
0。6 １。4 １.5 8 1。6 ０。4 1。6?１。5
⑼放线菌次级代谢物得初步纯化及牛津杯实验得
1、配制培养基高压灭菌、
2、倒平板。
3、涂布指示菌。
4、以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯,轻轻加压,使其与培养基接触无空隙。
5、收集发酵液,缓缓加入草酸将发酵液酸化至pH 1。4- 3、０左右,70 ℃,２ mｉｎ, 以100０0 rpm离心2０min、
6、取上清加入水稀释2０％左右,在4℃,用10 M NaOＨ中与至pH6。４— 6。8。
７、吸取中与液１00 μL 加入牛津杯中,37℃培养１6ｈr,观察结果。
⑽效价测定
1、称量
称量前,将抗生素标准品与供试品从冰箱取出,使与室温平衡,供试品应放于干燥器内至少30 min方可称取。供试品与标准品应用同一天平;吸湿性较强得抗生素在称量前1～2小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20 ｍg,取样后立即将称量瓶或适宜得容器及被称物盖好,以免吸水
称样量得计算W=V*C/P (式2、１0－４)
式中:W:需称取标准品或供试品得重量(ｍg)
V:溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶得
体积量(mL)
C:标准品或供试品高剂量得浓度(U/mL,μg/mL) P:标准品得纯度或供试品得估计效价(U/ｍｇ,μg/ｍg)
2、稀释
从冰箱中取出得标准品溶液,必须先在室温放置,使其温度达到室温后,方可量取。标准品或供试品溶液得稀释应采用容量瓶,每步稀释,取样量不得少于2 ｍＬ,稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管,量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次,吸取样品溶液后,用滤纸将外壁多余液体擦去,从起始刻度开始放溶液、稀释标准品与供试品用得缓冲液应同一批与同瓶,(预计不够时,应事先与另一瓶混匀后再用),以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时,每次加液至容量瓶近刻度前,稍放置片刻,待瓶壁得液体完全流下,再准确补加至刻度。标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:１,但所选用得浓度必须在剂量反应直线范围内、
3.双碟制备
在超净工作台上,用灭菌大口吸管(2０ mL),取已融化得培养基20 mＬ注入双碟内,作为培养基得底层,等凝固后更换干燥得陶瓦盖覆盖,放置２0～30 min,备用、取出试验用菌悬液,按已试验适当得菌量(高浓度所致得抑菌圈直径１８～２2 mm),用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中(一般细菌48～50℃,芽孢可至60℃)得培养基内,摇匀作为菌层用、用灭菌大口5mL吸管,吸取菌层培养基5
mL,使均匀摊布在底层培养基上,置水平台上待凝固,用陶瓦盖覆盖,放置2０~30 min,备用。
4.放置钢管
用钢管放置器,或其她方法将钢管一致、平稳地放入培养基上,钢管放妥后,应使双碟静置５～10 ｍin,使钢管在琼脂内稍下沉稳定后,再开始滴加抗生素溶液。
5.滴加抗生素溶液
每批供试品取５~1０个双碟,滴加溶液用毛细滴管或定量加样器,在滴加之前须用滴加液洗２~3次。在双碟得4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液得高、低二种浓度得溶液,滴加顺序为ＳH →TH→SL→TＬ,也可用SL→ＴＬ→ＴＨ→SH、(Ｓ代表标准品,T代表供试品,H代表高浓度,L代表低浓度),滴加溶液至钢管口平满,注意滴加溶液间隔不可过长,因溶液得扩散时间不同影响测定结果、滴加完毕,用陶瓦盖覆盖双碟,平稳置于双碟托盘内,双碟叠放不可超过3个,避免受热不均,影响抑菌圈大小,以水平位置平稳移入35~37℃恒温培养室,培养至所需时间、
6、抑菌圈测量
用直尺或游标卡尺测量抑菌圈得直径,以毫米为单位,误差不超过0。１ｍｍ。
五、结果与计算
根据实验测量得抑菌圈大小,计算抗生素供试品得效价单位。