筛查献血者乙型肝炎病毒中应用核酸检测的效果评价
筛查献血者乙型肝炎病毒中应用核酸检测的效果评价
目的对核酸检测在筛查献血者乙型肝炎病毒中的应用效果进行分析。方法选取我院2017年5月～2018年5月我中心血站采集到的51280份血液标本进行筛查，经酶聯免疫吸附试验证实均为阴性，然后采取核酸检测，在检测完成后对其检测阳性标本进行验证。结果阳性检出率为21.20/万，确认阳性率为16.31/万;乙型肝炎病毒酶联免疫吸附试验漏诊率为12.23/万;经核算筛查及确定14份标本均为阳性，HBsAg筛查则均为阴性。结论核酸检验在筛查献血者乙型肝炎病毒中有着重要的应用价值，其检验灵敏度比较高，更是缩短了窗口期，保证输血的安全性。
标签：核酸检测;筛查;献血者;乙型肝炎病毒
目前我国检测技术越来越成熟，因此极大的降低因输血传播乙型肝炎病毒的风险[1]。在对血液标本进行检测时，酶联免疫吸附法检测窗口期比较长，再加上病毒感染有窗口期等，因此在输血时仍存在风险[2]。此次研究针对筛查献血者乙型肝炎病毒中应用核酸检验的效果进行分析，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2017年5月～2018年5月我中心血站采集到的51280份血液标本进行筛查，24521份标本需要进行核酸检验。
1.2 方法
1.2.1 标本
将采集到的血样放置在乙二胺四乙酸抗凝真空试管（5 mL）中保存好，共三个。将试管放在冰箱中保存，将冰箱的温度维持在0～6℃，在24 h内将血浆分离开，然后Ⅰ号不带分离胶的试管进行血清学筛查，Ⅱ号带分离胶的无酶、无热源试管进行核酸检验，而Ⅲ号试管则继续在冰箱中进行保存。
1.2.2 使用仪器和试剂
酶联免疫试剂为HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、HIV抗原/抗体;核酸检验试剂为罗氏诊断试剂。HBV、HCV、HIV核酸联合检测试剂。使用的仪器为AT plus2&FAME24/20，STAR标本混样设备，Cobas S201核酸检测系统。
1.2.3 核酸检验
采取混样方式进行，每个一级混样池均有六个标准，将其视为内对照。混合
0922粪便核酸提取试剂盒说明书
磁珠法粪便核酸提取试剂盒（常规版） Faeces DNA Extraction Kit (Regular Version) 【目录号】FDE-5005、FDE-5030 【运输条件】2~25℃； 【保存条件】磁珠分散液、裂解液②2~8℃，其它组分室温； 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 在使用本试剂盒钱，请用户自备80%乙醇； 2. 使用前请检查裂解液①、②是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将裂解液置 于378℃水浴重新溶解； 3. 本操作指南经本公司反复验证，使用前请仔细阅读，并且按照操作指南的建议操作。
磁珠法·自动化：为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案 【产品简介】 本试剂盒采用具有独特分离作用的磁珠和独特的缓冲液系统，从各种固态或液态粪便样品中分离纯化高质量基因组DNA。特殊技术包埋的磁珠在特定条件下对核酸具有极强的 亲和力，而当条件改变时，磁珠会释放吸附的核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的。 提取的基因组DNA片段打，纯度高，质量稳定可靠，尤其适合高通量工作站的自动化提取，特别是本公司各型号的自动化核酸提取仪。 本试剂盒纯化的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Sputhem杂交、芯片检测和高通量测序等实验。 【试剂盒说明】 1. 磁珠分散液严禁反复冻融和离心，磁珠使用前务必充分混匀，可涡旋振荡10秒左右； 2. 实验中使用我先混合仪的目的是为使磁珠能够充分吸附核酸、将磁珠表面的杂质充分去 除或核酸从磁珠表面充分洗脱； 3. 使用前检查裂解液①、②是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将裂解①、② 于37℃水浴重新溶解。 【自备仪器、耗材和试剂】 仪器自动版 涡旋混合仪、高速离心机、水浴锅或金属浴、96孔方孔圆底板、无水乙醇、异丙醇、英芮诚ETP-300核酸提取仪。 手动版 涡旋混合仪、高速离心机、金属浴或水浴锅；EP管、EP管用磁力架、无水乙醇、异丙醇。 【仪器自动版操作步骤】 以英芮诚ETP-300型全自动核酸提取仪为例，可同步完成32个样本的提取工作。 1．上样准备 参照下表用量向96孔板中分别加入相应试剂。
核酸检测结果多久出来
核酸检测结果多久出来 核酸检测最快多久能出来结果 那做一次核酸检测需要多久时间才能出结果呢?有的人以为只要半个小时，但做过的人都是第二天才会出结果。众说纷纭，今天我们来给大家解说下从开始检测到完成结果需要经历哪些流程和步骤。根据我们采访到疾控中心的有关人员回答道：新冠病毒的核酸检测，首先是进行标本采集，之后进行实验室检测，广东省疾控中心病毒病预防控制所的实验室对于新冠病毒的核酸检测是依据国家方案，采用的方法是实时荧光RT-PCR。针对这种方法而言，半个小时是不可能的。这个实验的净操作时间也得需要2-4小时左右。这2-4小时，通常理解为是单纯的一份标本的操作时间。实验室通常进行批量标本的操作，一次送检标本往往数百份。就一般地级市实验室规模而言，500份检测的整个过程需要8-10小时。 疾控专家表示“整个过程”，是指理想的实验室操作过程，是指一次性成功;对于疑难标本，还需要重复进行检测，甚至还需要重复进行标本采集，那么它需要的时间会更长。通常我们要进行标本采集：三级防护、生物安全、通风良好的环境“三者”缺一不可。然后再到实验室检测：标本处理、核酸提取、PCR扩增、出具报告，“四步”均需时间。对于检测过程，几百份标本到实验室以后，标本核对、标本整理、标本前处理等环节需要3-4小时，之后才真正地开始核酸提取
的过程，核酸提取完之后需进行PCR扩增，也还需要80-120分钟。PCR结束之后，还要进行结果的判定、数据的核对以及报告的出具。所以一般医院或者检测机构出具的检测报告都是第二天才会通知被检测的人员，部分地方则是上传的手机微信或者APP上供被检测人员下载和阅览。那哪些人需要做核算检测呢?目前看来在境外的港澳台地区人员入境的时候需要做检测，并且隔离14天。但是港澳地区的入境人员则需要通过广东省商务部的免除免单后，则不需要隔离14天也能进入大陆。 核酸检测怎么做 核酸检测目前都是取咽拭子的方法(病毒感染口腔粘膜上皮后会寄宿于口腔粘膜上皮，通过采咽拭子达到取样目的)，1小时内送到专门检测室内进行。这个性质决定不可能每个患者想做就能立马做，比如大半夜来的患者就做不了，只能等待第二天仪器开机。 取咽拭子是一个高危的操作。据目前临床研究来看，新型冠状病毒感染肺炎的传播途径有三种，直接传播、气溶胶传播、接触传播。其中飞沫混合在空气中，形成气溶胶，吸入后导致感染。所以对于取样的人员而言，有被感染的风险。 结果判定: 如果测试结果为阴性，患者相对安全，但不能完全排除危险(因为可能由于标本质量或者存在抑制物等问题导致结果假阴性);如果测试结果为阳性，该患者就有危险性。第一步和第二步都有严格的操作流程
9.流感病毒的快速检测方法
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
中国乙肝病毒核酸检测试剂盒现状
Medical Diagnosis 医学诊断, 2014, 4, 21-24 Published Online June 2014 in Hans. https://www.360docs.net/doc/4c2400120.html,/journal/md https://www.360docs.net/doc/4c2400120.html,/10.12677/md.2014.42004 Present Status of Hepatitis B Virus Nucleic Acid Detection Kit in China Zhiwei Sui1*#, Linglei Ran2*, Ling Zhang1, Wen Chen2, Jing Wang1, Boqiang Fu1, Jiayuan Wang2 1National Institute of Metrology, Beijing 2College of Arts and Science of Beijing Union University, Beijing Email: #suizhw@https://www.360docs.net/doc/4c2400120.html, Received: Apr. 27th, 2014; revised: May 26th, 2014; accepted: Jun. 3rd, 2014 Copyright ? 2014 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/4c2400120.html,/licenses/by/4.0/ Abstract China has a high incidence of hepatitis B virus; nucleic acid amplification (PCR) quantitative de-tection of HBV nucleic acid biomarkers is one of the important means in diagnosis and treatment monitoring of hepatitis B virus. However, there are many commercial HBV nucleic acid detection kits in the Chinese market, it is necessary to evaluate and analyze the kit for hepatitis B virus nucleic acid production of different manufacturers. This article introduced HBV nucleic acid de-tection methods, present status and comparative analysis of HBV nucleic acid detection kits to provide the reference for the users and developers. Keywords Hepatitis B Virus, Nucleic Acid, Detection Kit 中国乙肝病毒核酸检测试剂盒现状 隋志伟1*#，冉令磊2*，张玲1，陈文2，王晶1，傅博强1，王佳媛2 1中国计量科学研究院，北京 2北京联合大学应用文理学院，北京 Email: #suizhw@https://www.360docs.net/doc/4c2400120.html, 收稿日期：2014年4月27日；修回日期：2014年5月26日；录用日期：2014年6月3日 *第一作者。 #通讯作者。
医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序文件
医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测 标准操作程序 一、目的 确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规化，降低人为不规操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。 二、适用围 医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。 三、样本采集、运送和保存 尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。患者有下呼吸道样本时，应优先采集。 根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP），并组织样本采集人员进行培训及考核。样本的采集应当严格按照SOP进行。
样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。 样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。 四、PCR检测 （一）样本处理 样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。样本应尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜进行加样、提取过程中，为防止RNA降解，可将试管架置于托盘平铺的碎冰上。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件，可于-20℃冰箱暂存。 （二）试剂准备 试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。
核酸检测实施方案
全面推行核酸检测试运行工作方案 为预防和控制经血传播疾病的发生，保障临床用血质量和安全，经研究决定我站将全面开展核酸检测。为稳步推进核酸全面检测，不影响血液批放行，满足临床用血需求，制定本试运行方案。 一、组织管理 为顺利开展全面核酸检测工作，成立核酸检测工作小组，工作组负责全面推行核酸检测试运行工作，协调处理试运行过程中的相关问题。核酸检测工作小组由田站长总负责，分管站领导和相关科室积极配合。 二、工作目标 根据卫计生发〔2013〕22号，国家卫生和计划生育委员会关于印发全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013—2015年）提出的工作目标，到2015年，血液筛查核酸检测基本覆盖全国。2014年5月27日，山东省卫计委又下发了“关于全面推进供血核酸检测工作的通知”，要求各市要按照原卫生部《全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013-2015年）》要求，迅速开展核酸检测工作。确保2014年下半年在全省全面开展供血核酸检测。为全面推进我站核酸检测工作，目前前期准备工作已就绪，人员、设备、资金已到位。经研究决定自2014年7月1日开始对我站所有献血员标本（包括沂源采血点）进行核酸检测。 三、保障措施 1、资源保障：器械科购买进口核酸采血管，仅供沂源采血点使用，为沂源采血点配备标本离心机二台（一台备用），购买标本运输箱3个（hiv送检一个，沂源采血点一个，备用一个）。（确认号之后到位，前完成） 2、沂源采血点标本的运送：沂源采血点工作人员严格按《血液标本留取程序 》留取标本和离心，置于2-6℃冰箱保存。标本由计划送血人员运回。根据工作需要，沂源计划送血增加一次，同时减少一次急症送血。即每周二、四、六计划送血三次，中午下班时由送血司机把标本及原料血捎回。为保证核酸标本检测不超48小时，沂源采血点工作人员工作时间调整，接血当日下午采血点工作人员休息，周日休息。 3、机采血小板计划的下达：血液供应科提前和临床沟通，说明我站下一步的工作目标和任务（全面核酸检测并纳入批放行）及造成的血液供应时间的变更，达成共识，取得谅解。合理安排血小板预约和采集计划，血小板采集计划截止到每天下午16：00点之前。？？？？？？ 4、机采血小板标本的交接：机采成分科按照血液供应科下达的采集计划预约献血员，安排献血员第二天早上7：30分之前到达血站，血小板标本必须于每天上午9：30之前分别与酶免实验室和核酸实验室当面交接。 5、全血标本的交接：各采血点2014年7月1日起，所有采集的血液同时留取核酸标本和酶免实验室标本。待检室每天早上与酶免实验室和核酸实验室当面交接标本，未检、待检和待放行的原料血和成分血分别存放并标识。 四、核酸检测 1、核酸实验室与酶免实验室同步对当天采集的单采血小板标本和前一天接回的沂源采血点的标本进行血筛三项检测，并对酶免实验室前一天初次检测无反应性的标本进行血筛三项的检测，对酶免实验室前一天初次检测单试剂呈反应性的标本进行血筛三项的单检模式，每天15:30前完成实验。若遇拆分标本，及时与相关科室沟通，调整放行和血小板发放时间，并且完成当天拆分检测，保证该批试验中不留待测的标本。若遇突发应急事件，核酸实验室和酶免实验室同步检测。每天核酸检测完毕后出具书面检测报告交血液质量控制科、血液成分制备科和献血服务科机采成分。 2、质量保证：核酸实验室应建立室内质控标准操作规程，实验室的每一批检测应至少有一个弱阳性室内质控品，该室内质控品应参与混样、核酸纯化、拆分或联检及鉴别检测的全过程。实验结束后，依据室内质控的判定规则对实验结果进行分析和审核，保证检测结果准确可靠。
BIOG核酸提取试剂盒操作步骤说明
BIOG 游离DNA 提取试剂盒操作步骤 说明 运输条件：常温运输 货 号：51019:50次反应 51020:100次反应 储存条件：室温（15-25℃），消化液、DNA Carrier 请于-20℃存放 产品特点 试剂盒组成 组分 50次 100次 吸附柱和收集管 各50个 各100个 裂解液 18mL 36 mL 洗涤液A 21mL 42 mL 洗涤液B 9 mL 18 mL 洗脱液 3mL 6 mL 消化液 1.2 mL 2.4 mL DNA Carrier 0.24 mL 0.48 mL 说明书 1份 1份 产品介绍 BIOG cfDNA Easy Kit 是常州百代生物科技股份有限公司研制的专门用于提取血清、血浆等游离DNA 的试剂盒。BIOG cfDNA Easy Kit 采用了最新的优质进口离子膜，裂解液和洗脱液经过多次优化，能高效地分离DNA 。提取得到的DNA 较其它品牌的同类试剂盒产量更大，纯度更高，最大限度地去除了蛋白、色素、脂类等杂质污染，可以直接应用于PCR 、荧光定量PCR 和各种酶切试验等。 操作步骤 1. 请自行准备：无水乙醇、1.5mL 离心管。 2. 取出洗涤液，按以下操作： a) 洗涤液A ：21mL 加入9mL 无水乙醇；42mL 加入18mL 无水乙醇。 b) 洗涤液B ：9mL 加入21mL 无水乙醇；18mL 加入42mL 无水乙醇。 c) 配制好的洗涤液如出现沉淀，可在37℃溶解，摇匀后使用。 3. 取1.5mL 离心管，加入200μL 样本，4μL DNA Carrier 混合均匀，加入300μL 裂解液及20μL 消化液，振荡混匀，56℃水浴10 分钟。 4. 加入1000μL 无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA 的提取与后续实验。 5. 将吸附柱放入收集管内，将760μL 上述溶液转入吸附柱内，静置2 分钟，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液； 6. 将吸附柱放回收集管内，将剩余760μL 溶液转移至吸附柱内，重复步骤5。 7. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液A 至吸附柱内，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液。 8. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液B 至吸附柱内，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液。 9. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 4℃离心2 分钟，离去残留的洗涤液。 10. 取出吸附柱，放入新的1.5 mL 离心管内，加入30-50 μL 洗脱液，静置3 分钟，12,000 rpm 4℃ 离心2 分钟，收集DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。 注意事项： 裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛， 请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时请就医。 储存、运输和有效期 本试剂盒可常温运输，室温（15-25℃）保存，有效期为12个月，消化液、DNA Carrier 请于-20℃存放，避免反复冻融。 质量控制 本产品经严格的质量检验证明，无生物污染 注意 ：本产品仅用于科研 BIOG 游离RNA 提取试剂盒操作步骤说明 运输条件：常温运输 ◎操作简便快速，可在半小时内获得理想的DNA ； ◎提取DNA 纯度高，无抑制剂，A260/A280为1.7-1.9； ◎产量更高，较国内同类产品高出20%； ◎可用于血清、血浆等游离样本中DNA 的提取； ◎不含苯酚和氯仿等有毒溶剂，安全无毒。
基层血站开展血液核酸筛查的必要性及可行性分析
基层血站开展血液核酸筛查的必要性及可行性分析 发表时间：2014-06-23T13:17:38.433Z 来源：《医药前沿》2014年第9期供稿作者：郭超群李运琴来祝檩 [导读] 主要原理是使用一些物理、化学和生物学方法，通过靶位核酸直接扩增或扩增其附带信号的方法。 郭超群李运琴来祝檩 （河南省焦作市中心血站 454000） 【摘要】目的探讨基层血站开展血液核酸筛查的必要性及可行性。方法就NAT在基层采供血机构的开展与应用特点等方面进行分析结果开展核酸检测可有效地缩短窗口期，从而减少输血风险。结论根据核酸检测在基层采供血机构的应用特点，应统筹规划血站核酸检测实验室，重视核酸检测工作的全面质量管理，建立人员培训机制，进一步完善现有检测模式加核酸检测模式下的实验室质量运行体系，以提高血液检测的灵敏度和特异性，进一步保障血液安全。 【关键词】基层血站核酸筛查血液安全 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）09-0084-02 目前，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行病毒抗原或抗体的检测是采供血机构普遍采用的筛查策略，随着试剂灵敏度的不断提高，经输血传播病毒的风险已降至很低，但由于免疫学方法的局限性，漏检的现象仍会发生，使临床用血安全存在隐患。因此，越来越多的采供血机构开始在血液筛查中引入核酸扩增检测技术（NAT）。我国从2010年开展血站核酸检测试点工作，2012版血站技术操作规程开始把核酸检测技术纳入血液筛查策略，鼓励有条件的地区和单位率先开展核酸检测。据初步统计，截至目前，全国共有53家血站利用核酸检测技术对血液进行筛查。2013年5月，国家卫生和计划生育委员会发出通知，要求2013年～2015年，全面推进血站核酸检测工作，并公布具体实施方案。方案提出，到2015年，血液筛查核酸检测基本覆盖全国。本文就NAT在基层采供血机构的开展与应用特点等方面进行分析，探讨开展NAT血液筛查的必要性及可行性。 一、核酸检测原理 NAT是一系列直接检测病毒核酸技术的总称。主要原理是使用一些物理、化学和生物学方法，通过靶位核酸直接扩增或扩增其附带信号的方法，让看不见的极微量的核酸变成直观的光电和可视信号，从而判断标本中是否存在相应的病原体。[1]目前适用于血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩增技术主要有PCR和TMA技术。PCR技术主要由引物、DNA聚合酶、原料dNTP、模板和镁离子等基本要素组成。通过加热变性、退火、延伸3个反应步骤的不断循环，完成模板DNA的扩增放大。[2]TMA是利用逆转录酶和多聚酶的共同作用，在等温条件下扩增的反应系统。[3] 二、核酸检测的必要性 安全输血是指从采血到输入至患者体内的整个过程中的安全保障，血液安全不仅关系到受血者的身体健康和生活质量，而且对预防经血传播疾病的发生，保障社会稳定均具有重要意义。但由于免疫检测的窗口期、病毒变异、免疫静默感染等因素造成的漏检往往在所难免，这就给输血安全带来较大的隐患。 国外早在20世纪90年代即开始将NAT用于血液筛查，国内自2000年开始有献血者血液核酸筛查的研究报道，2010年全国医政工作会议将15所采供血机构确立为我国内地首批核酸检测试点单位，标志着我国输血传染病的血液筛查工作又向前迈了一步。NAT在血液筛查中的意义主要是：1.减少窗口期长造成的漏检；2.减少病毒变异酶免试剂检测不出的漏检；3.减少隐匿性感染的漏检；4.减少试剂灵敏度低造成的漏检。核酸检测平均可将乙肝、丙肝和艾滋病病毒检测“窗口期”由原来的56、82、22天缩短至33、22、11天，分别缩短40%、89%和50%。另外，NAT还能检出免疫学方法尚无能为力的免疫静默感染、乙肝隐匿性感染、病毒变异株感染等，可进一步保障血液安全。 三、核酸检测在基层采供血机构的应用 NAT在我国采供血机构中仍处于起步阶段，但在血液筛查中的应用具有重要意义。相比临床而言，对试剂灵敏度的要求更高，因采供血机构的检测目的是为了获得安全的血液，主要强调的是试剂的灵敏度和特异性，并且对实验室的规范操作要求更高。因此，在基层采供血机构中开展NAT，应从以下几方面入手。 1. 严格核酸检测实验室的设置 开展核酸检测的血站要建立起符合标准的实验室，规范化的检测流程，做好核酸检测实验室质量控制和人员的技术培训，积极探索建立适合血站的核酸检测模式和管理体系。注重规范的操作和严格的防污染措施，避免样品间的交叉污染和扩增产物的污染。在设备和试剂的选择上应考虑自动化程度高、试剂灵敏度高、重复性、特异性好、操作方便等多方面。 2. 重视质量管理 2.1建立完善的样本留样和处理程序，样本留样和处理是核酸检测质量控制体系中的重要环节，否则在检测之前病毒核酸已降解，造成假阴性的检测结果。 2.2对HBV NAT试剂的灵敏度要求应比HCV、HIV NAT高，因HBV病毒载量在窗口期远低于HCV、HIV-1，HBsAg阴性的隐匿性HBV感染者的血清病毒也保持低水平的复制，这就要求检测试剂必须非常灵敏，可覆盖所有基因型，以防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检。且我国为HBV高流行区，数据表明，我国常规血清学筛查合格的献血者中，HBV NAT阳性检出率大大高于国外献血者，且NAT阳性者中HBV占绝大多数，远远高于HCV和 HIV。 2.3应尽可能采用小样本数混合检测或单人份检测，以防止低拷贝的病毒阳性血液漏检，提高检测效率。 3. 运行模式及经费基层血站如何在现有机制下获得维持核酸检测运行经费，成为保证核酸检测工作持续开展的突出问题之一。核酸检测设备及试剂无论进口还是国产的成本均较高，为切实保障血站核酸检测及正常工作经费需求，要积极争取地方财政支持，建立长期、稳定的投入机制，统筹经费使用，确保专款专用，发挥资金最大效益，才能保证核酸检测工作顺利持久地开展下去。此外，以何种具体形式开展血液核酸检测仍需深入探讨，要考虑核酸检测对技术要求较高的问题，探讨适合我国国情的进行集中化检测的可行性。 综上所述，对于献血者的筛选，开展核酸检测可有效地缩短窗口期，从而减少输血风险。按照国家政策要求，采供血系统开展血液核酸筛查势在必行。根据核酸检测在基层采供血机构的应用特点，应统筹规划血站核酸检测实验室，重视核酸检测工作的全面质量管理，建立人员培训机制，进一步完善现有检测模式加核酸检测模式下的实验室质量运行体系，以提高血液检测的灵敏度和特异性，进一步保障血
筛查献血者乙型肝炎病毒中应用核酸检测的效果评价
筛查献血者乙型肝炎病毒中应用核酸检测的效果评价 目的对核酸检测在筛查献血者乙型肝炎病毒中的应用效果进行分析。方法选取我院2017年5月～2018年5月我中心血站采集到的51280份血液标本进行筛查，经酶聯免疫吸附试验证实均为阴性，然后采取核酸检测，在检测完成后对其检测阳性标本进行验证。结果阳性检出率为21.20/万，确认阳性率为16.31/万;乙型肝炎病毒酶联免疫吸附试验漏诊率为12.23/万;经核算筛查及确定14份标本均为阳性，HBsAg筛查则均为阴性。结论核酸检验在筛查献血者乙型肝炎病毒中有着重要的应用价值，其检验灵敏度比较高，更是缩短了窗口期，保证输血的安全性。 标签：核酸检测;筛查;献血者;乙型肝炎病毒 目前我国检测技术越来越成熟，因此极大的降低因输血传播乙型肝炎病毒的风险[1]。在对血液标本进行检测时，酶联免疫吸附法检测窗口期比较长，再加上病毒感染有窗口期等，因此在输血时仍存在风险[2]。此次研究针对筛查献血者乙型肝炎病毒中应用核酸检验的效果进行分析，现报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取我院2017年5月～2018年5月我中心血站采集到的51280份血液标本进行筛查，24521份标本需要进行核酸检验。 1.2 方法 1.2.1 标本 将采集到的血样放置在乙二胺四乙酸抗凝真空试管（5 mL）中保存好，共三个。将试管放在冰箱中保存，将冰箱的温度维持在0～6℃，在24 h内将血浆分离开，然后Ⅰ号不带分离胶的试管进行血清学筛查，Ⅱ号带分离胶的无酶、无热源试管进行核酸检验，而Ⅲ号试管则继续在冰箱中进行保存。 1.2.2 使用仪器和试剂 酶联免疫试剂为HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、HIV抗原/抗体;核酸检验试剂为罗氏诊断试剂。HBV、HCV、HIV核酸联合检测试剂。使用的仪器为AT plus2&FAME24/20，STAR标本混样设备，Cobas S201核酸检测系统。 1.2.3 核酸检验 采取混样方式进行，每个一级混样池均有六个标准，将其视为内对照。混合
核酸检测和抗 体检测
核酸检测和抗体检测 核酸检测和抗体检测 究竟什么是病毒核酸检测？什么是抗体检测？为什么可以用核酸检测结果作为新型冠 状病毒肺炎的确诊依据？我们来了解一下这些问题。 病毒核酸检测是什么？ 病毒核酸检测是常见的病毒感染检查方法，并不局限于新型冠状病毒。在埃博拉、流感、禽流感等多种病毒性疾病诊断中，都会应用到病毒核酸检测技术，区别就在于所检测的病毒 特异性基因不一样。 核酸检测是实验室确诊的主要方法。可通过实时荧光PCR检测咽拭子、痰液或血液等标 本中2019-nCoV核酸阳性，或通过病毒基因测序，如与已知的2019-nCoV高度同源即为病原 学阳性。 它既不需要开刀也不需要打针，采集人体分泌物后，进行留样保存，在实验室条件下， 利用PCR技术进行检测，进行临床病原学的确诊。 抗体检测是什么？ 血清抗体检测，简称抗体检测。血清检测大多使用三类方法：间接免疫荧光（IIFT）、间接法 ELISA 和胶体金法。 血清抗体检测冠状病毒感染并不能像病毒核酸检测阳性一样作为病毒感染的“金标准”，因为抗体检测的准确性受制于检测方法、灵敏度、特异性、血样制备等因素。 如何判断有没有新冠病毒？ 最直接的方法就是通过分子生物学技术检测出属于新型冠状病毒的RNA，这就像法医找到嫌疑人的DNA一样，是可以帮助我们找到“幕后凶手”的直接证据。目前检测新型冠状病 毒核酸的方法主要包括实时荧光RT-PCR（简称为定量PCR）检测和基因测序，而新型冠状病毒核酸检测试剂盒就基于前者，也是最常用的方法。 核酸检测的流程 新型冠状病毒核酸检测样本一般来自咽拭子。检测时，医生会用一个像棉签一样的拭子 去擦拭扁桃体和咽隐窝附近的分泌物，也可以通过鼻腔取鼻咽后部的分泌物，然后放到试管里面，再交给检验部门做相应的病毒核酸的检查。因此，咽拭子采样前应提前漱口。 核酸检测需要经过取样、留样、保存、核酸提取、上机检测五个步骤。
2011—2013年辽阳市流感病毒实验室检测结果分析
2011—2013年辽阳市流感病毒实验室检测结果分析 发表时间：2014-04-09T14:43:02.983Z 来源：《中外健康文摘》2013年第39期供稿作者：刘婧媛 [导读] 2011-2013年两年间辽阳市均有流感病毒流行,通过实验室检测得知两年的流行病毒毒株型别不同,证实了流感病毒抗原性变异的特性。 刘婧媛 (辽阳市疾病预防控制中心质量管理科辽宁辽阳 111000） 【摘要】流行性感冒病毒是引起急性呼吸道感染的重要病原，传播迅速,常会引起暴发，甚至造成世界大流行。上世纪流感病毒就引起四次世界大流行，造成相当严重的损失[1]。目的为了探究流感病毒流行和变异规律，了解其根据流感病毒核蛋白（NP），M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲（A）乙（B）丙（C）三型[2],病毒具有抗原性变异的特性,提供控制流行的科学依据,对 2011—2013年度辽阳市流行性感冒的病原学监测结果进行分析。方法采集流感样病例的咽拭子标本,采用real time-PCR进行核酸检测，分别用人红细胞、狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HAI)进行流感病毒型别鉴定。结果 2011年4月~2012年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本388份,核酸检测PCR阳性13例，分离到流感病毒10株,阳性分离率为2.58%,经分型鉴定A型H3N2亚型2株(20%),B型Victoria5株(50%),B型Yamagata3株(30%),A型H1N1亚型、新H1N1未检出；2012年4月~2013年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本593份,核酸检测PCR 阳性40例，分离到流感病毒30株,阳性分离率为5.06%,经分型鉴定A型H1N1亚型2株(6.67%)，A型H3N2亚型,15株(50%),新H1N112株(40%)，B型Yamagata,1株(3.33%)，B型Victoria未检出。结论:2011~2012年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为B型,同时有A型H3N2亚型毒株的存在；2012~2013年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为A型H3N2亚型和新H1N1,同时有A型H1N1亚型、B型Yamagata毒株的存在。 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）39-0179-02 1.材料和方法 1.1标本 2011年4月1日-2012年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本388份；2012年4月1日-2013年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本593份。 1.2流感病毒核酸 real time-PCR 1.2.1采用Quant One step RT-PCR kit RNA 提取试剂盒提取流感病毒样本核酸。 1.2.2QIAGEN real time (荧光定量PCR法)检测试剂盒扩增病毒核酸，反应体系见表1 组分体积（μl） 2×QuantiText Probe RT-PCR Master Mix12.5× 上游引物（40μM）0.5× 下游引物（40μM）0.5× Probe （10μM）0.5× QuantiText RT Mix0.25× Rneasy Free Water UP to 25 病毒核酸RNA 5.0× 1.2.3将上述加好的反应体系的反应管放于PCR仪进行反应，反应程序如下：见表2 步骤反应温度(℃)时间(min)是否采集荧光循环数 逆转录酶605否1 5030否1 预扩增9515否1 950.25否45 扩增及荧光收集550.5否45 720.5是45 725否1 1.2.4结果判定及标准 对照：阴性对照无CT值或CT值为零，阳性对照CT值＜30。 样品：CT值≤35报告为阳性。 样品：37≤CT值≤40为灰区，需重新采样检测。 样品：无CT值或CT值为零报告为阴性。 1.3流感病毒分离 上述PCR结果为阳性的样本接种培养好的MDCK细胞生长液，观察细胞病变情况。 1.3.1将已长成单成的MDCK细胞生长液，用DPBS液洗两遍。 1.3.2每瓶接种标本0.5ml，每个标本接种1瓶，轻摇，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附2小时。 1.3.3倒掉感染液，用DPBS液洗两遍，每瓶加入含2μg/ml胰酶的病毒维持液10ml，35℃培养。 1.3.4次日起每天观察有无细胞病变（CPE）并记录，如病变明显细胞脱落可收获并做血凝，如未有病变，继续观察7日收获做血凝。 1.4血凝实验
质粒提取试剂盒-说明书-翻译
精品文档 。 1欢迎下载 E.Z.N.A.? 质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml 的LB 培 养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm ）孵育12-16h 。使用10-20ml 培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA 阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml 细菌室温10,000 x g 离心1min 。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A 重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉 淀对于获得高质量的DNA 非常重要。 4. 加入250μl 溶液II ，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。 可能需要孵育2min 。不要用力混合，以免使染色体DNA 断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min 。溶液II 不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl 溶液III ，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免 形成局部沉淀，加入溶液III 后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g 离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼．．．． 的吸取上清液，加入装配在2ml 收集管中的小量纯化柱I 中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g 离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入500μl HB 缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA 以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液清 洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA 清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA 清洗液稀 释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g 离心2min ，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可 遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml 微量离心管中。将30-50μl （取决于终产物的期望浓度） 洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min 。≥13,000 x g 离心1min 洗脱DNA 。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA 。 13. DNA 的产量和质量：分别在波长260nm 和280nm 处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA 的浓度计算如下： DNA 浓度=A 260×50×（稀释倍数）μg/ml A 260/A 280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA 的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA 样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA 是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强 翻译
流感病毒核酸检测作业指导书
流感病毒核酸检测作业指导书 1 适用范围 适用于鼻拭子、咽拭子、漱口液、鼻腔冲洗液、鼻腔吸取物、气管吸取物等样品中流感病毒的核酸PCR检测。 2 原理 基于PCR原理进行的核酸检测。 3 仪器设备 3.1 QIACube工作站 3.2 ABI7500荧光定量PCR仪器 3.3 核酸电泳仪 3.4 离心机 3.5 -20℃冰箱、-70℃冰箱、2~8℃冰箱 3.6移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL） 4 试剂耗材 4.1 QIAGEN核酸抽提试剂盒 4.2 PCR试剂盒 4.3 不同规格移液枪头 4.4 1.5 mL Eppendorf 离心管 5、操作步骤 5.1 核酸提取 5.1.1 使用QIAGEN手工抽提试剂盒进行核酸抽提 5.1.1.1 试剂准备 Carrier RNA试剂的准备：将310μL Buffer A VE加入到1管冻干的Carrier RNA（310μg）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装3~4小管，于-20℃冰箱保存。临用时根据具体样品量进行Buffer A VL工作液的配置。每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。 Buffer A VL工作液的配置：Buffer A VL原液保存于正常室温条件下，使用前观察有无结晶。若有，可置于80℃温度下少于5min快速溶解后使用。根据下列公式计算各成分含量进行Buffer A VL工作液的配置。 n × 0.56mL = y mL；
y mL × 10μL/mL = z μL n表示本次试验所要抽提的总样品数，包括空白阴阳性对照数； y 表示计算所得要使用的Buffer A VL工作原液； z 表示计算所得要使用的含Carrier RNA的Buffer A VE（Carrier RNA-A VE）的量； 下表列举出1-12个样品Buffer A VL工作液配制所要使用的Buffer A VL原液与Carrier RNA-A VE的量。 含Carrier RNA的Buffer A VL工作液4℃保存48小时有效，使用前置37℃水浴让结晶溶解，并混匀。 Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存） Buffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存） 说明：上述各表是根据目前所使用试剂配制所需的各成分含量，当试剂改进后需根据新的试剂说明书进行试剂的配制。 5.1.1.2核酸抽提 5.1.1.2.1取1.5mL离心管，加入560μL Buffer A VL工作液； 5.1.1.2.2分别加入140μL标本、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照，涡旋振荡混匀15秒； 5.1.1.2.3 室温放置10分钟，瞬间离心；
甲型H1N1流感核酸检测方法090510
5月9日更新： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程 中文翻译版（请同时参考英文原版） 请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。 美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版) 本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。 一、概述 （一）前提 本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。 （二）实验原理 实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan?探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。 （三）使用条件 一步法定量R T-P C R96孔板热循环系统。 （四）生物安全要求 样本处理应在相应的生物安全实验室完成。 （五）样本要求 1、呼吸道样本 支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准 1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本 2）以上未列的其它不当样本 （六）核酸提取 RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp?病毒RNA提取试剂盒，RNeasy?小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA 分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。 （七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。 二、实验材料 （一）试剂 1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒； 2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)； 3、正反向引物 (40μM)； 4、双重标记探针(10μM)； 5、阳性对照。 （二）供给 1、实验室标记笔； 2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管； 3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头； 4、0.2ml PCR 反应管盘； 5、光学反应盖板； 6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管； 7、一次性无粉手套。 （三）仪器设备 1. 微量离心机； 2. 漩涡振荡器； 3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。