实验六酵母菌细胞总数的测定

一、目的要求

1.学习并掌握血球计数板计数的原理；

2.掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验材料

1.菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）麦芽汁培养液

2.其它：显微镜、血球计数板、手动计数器、擦镜纸、吸水纸等

三、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物总数目。

血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。血球计数板的构造如下。

图6-1 血球计数板构造

常见血球计数板的计数室有两种规格：一种是16×25型，即计数室共分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格；另一种是25×16型，即计数室先被分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。但无论是哪一种规格的血球计数板，其计数室的小方格都是400个。我们采用的是25×16型。

计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。计算公式如下：

1ml菌液中总菌数＝5×104 A·B

A为5个中方格中的总菌数，B为稀释倍数

四、操作步骤

1.菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适当的菌悬液。

2.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬

液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细作用自动进入计数室（注意取样前要摇

匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生）。

3.找计数室：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找

到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数（注意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清晰）。

4.显微镜计数：取左上、右上、左下、右下和中央5个中方格进行计数。位于中方格边线

上的菌体一般只计上边和右边线上的（或只计左边和下边线上的）。如遇到酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半以上时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从上下两个计数室中得到的平均数值来计算样品的含菌量。

5.清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗

刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察计数室内是否有残留菌体或其它沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、实验内容

按上述方法及步骤测定所给酿酒酵母培养液的细胞浓度。

六、实验报告

2.根据你的体会，说说用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误

差，力求准确？

3.能否用血球计数板在油镜下对细菌进行计数？为什么？

PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

细胞增殖及细胞活力检测方法

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书）在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

酵母菌的培养和观察

酵母菌的培养和观察目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。步骤 1．观察酵母菌（1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。（2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。 2．培养酵母菌（1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。（2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol : PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS （根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心（1000r/300g 5mi n）收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇（乙醇终浓度70%），吹打混匀以免细胞团聚，4C固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g 5min ）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心（第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎）再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min，最后加入400卩lPI避光染色30 min （常温或4C 均可）【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS 临时配好总量，其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ） 4 C避光染色30分钟】 5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结

果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞。

七年级生物实验报告单_共10篇.doc

★七年级生物实验报告单_共10篇范文一：七年级生物上册实验报告单七年级生物实验报告册2015年秋季上学期学校三台花园初中班级七年级姓名目录一、调查校园、公园或农田的生物种类.............................................2二、非生物因素对某种动物影响......................................................3三、练习使用显微镜 (4) 四、观察植物细胞........................................................................5五、观察动物细胞 (6) 六、人体的基本组织........................................................................7七、观察草履虫 (8) 八、裸子植物和被子植物的种子...................................................9九、种子萌发的环境条件 (10) 十、植物茎内水分的运输...................................................11十一、观察叶片的结构 (12) 一、调查校园、公园或农田的生物种类实验报告年级班实验人：组次：试验时间：实验名称：调查校园、公园或农田的生物种类实验目的：1、尝试调查的方法，初步学会调查记录 2、描述身边生物和生活环境

实验器材：调查表、笔、望眼镜、放大镜实验设计： 1、选择调查范围。校园、公园或农田 2、分组。8人一组，确定组长 3、设计调查路线。选择生物多、环境变化多得路线。 4、调查记录。 5、归类。 6、进行整理，系在笔记本上。 7、汇报调查结果。二、非生物因素对某种动物影响实验报告年级班实验人：组次：试验时间：实验名称：非生物因素对某种动物影响实验目的：影响鼠妇分布的环境因素实验器材：10只鼠妇、湿土、铁盘（塑料盘、纸盒）、纸板、玻璃板实验设计： 1.取一个方形的月饼盒，清洗干净，用记号笔在盒内画一条中线。【已做】 2.将10条大小形同，健康状况良好的黄粉虫放入一个纸杯，然后倒扣在月饼盒中线中间静置2分钟。绝对保持安静，不要大声说话和拍打桌子（为什么？），待黄粉虫适应一下环境。 3.2分钟后拿走纸杯，让黄粉虫自由活动，然后迅速用黑卡纸将月饼盒的一半遮起来，另一半有光线照射。明暗反差越大越好。 4.从黄粉虫自由活动算起，每隔一分钟统计一次明处和暗处的黄粉虫数目。共统计10次填入下表。三、练习使用显微镜实验报告年级班实验人：组次：试验时间：实验目的：实验器材：实验设计： 1、_____：右手拿镜臂,左手托住镜座,放置于身体正前方偏左侧； 2、______：从镜头盒取出目镜和物镜,安装在镜头上；（拿物镜时手拿橡胶部位） 3、对光:转动转换器和遮光器,使物镜和遮光器较大孔对准通光孔,调节________使镜筒下降适当距离，转动__________，直到从目镜中看到一片白亮的视野。 4、放装片并固定：将永久玻片标本(有盖玻片一面向上)观察部分正对通光孔，压片夹固定； 5、观察：调节粗准焦螺旋使物镜与玻片靠近（下降过程眼睛注视物镜），通过目镜观察，_________调节粗准焦螺旋，使镜筒上升，直到看清物像，最后调节___________，使物像更加清晰。

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可）【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

用显微镜观察草履虫

用显微镜观察草履虫执教：新罗区白沙中心小学陈秋虎指导：【教材分析】显微镜的发明不仅使人们看到了细胞，还看到了身边的许多微生物。微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物在内的一大类生物群体。在前面几课使用显微镜观察生物细胞的基础上，本课重点指导学生观察草履虫。微生物在地球上分布很广，种类和数量极多，和人类的关系也十分密切。本课仅指导学生观察生活在水中的草履虫的样子、运动和颜色等，主要活动为“观察微生物”、“记录微生物”两部分。【学情分析】乡下孩子接触显微镜的机会少，对显微镜的使用较为陌生，为了上好这节课，首先要先教会孩子熟练地使用显微镜。可以通过观看微课，学习显微镜的使用，在学生实验的过程中，由听课教师手把手协助教学，做到规范使用。草履虫玻片的制作不属于小学生应掌握的内容，教师可以课前预先制作好草履虫的玻片标本，降低教学难度，腾出更多的时间让学生去探索微观世界，去交流感受。【设计意图】通过教学，使学生对草履虫的研究感兴趣，会用画图、文字的形式，记录观察到的内容，学会追踪观察活的草履虫的方法，学会与他人交流自己的发现。六年级的孩子对显微镜以及未知的微观世界有着深深的好奇心，满足他们对微观世界的探索欲望，体验科学探究的乐趣，教会他们探索微观世界的方法是本节课的宗旨，激发培养他们对世界的探索精神是我们的目的。【教学目标】科学概念： 1.用显微镜能看到肉眼不能看清楚的草履虫。 2.认识水中生活着很多形态各异的微生物。过程与方法： 1.进一步熟练使用显微镜。 2.学会在显微镜下观察水中活着的草履虫，用图文方式记录它们的形态和行为特征。

情感、态度、价值观：培养学生对微生物进行研究的兴趣，培养生物具有多样性和复杂性的意识，激发培养他们对世界的探索精神。【教学重点、难点】教学重点：用显微镜观察水中活着的草履虫。教学难点：追踪观察活的微生物，并记录它们的样子、运动和颜色。【教学准备】显微镜、擦镜纸、手电筒、含有微生物的水、含有微生物的生物玻片、记录单、课件【教学过程】一、引入课题。 1.引起学生的好奇心，激发学生的观察兴趣，观察水瓶中含有草履虫的水。询问学生想观察草履虫的什么？ 2.引出学习使用显微镜的话题。二、学习使用显微镜（播放使用显微镜的微课） 1.认识显微镜的构造。 2.显微镜使用要点：（1）先用低倍物镜对光(明亮光圈)。（2）把标本放在通光孔中心。（3）眼看物镜,把镜筒降到最低。（4）眼看目镜，调节粗准焦螺旋，（5）慢慢抬升镜筒，直到看到清晰的图像为止。三、利用显微镜观察草履虫 1.教师把制作好的玻片标本放在载物台。 2讲解实验记录单的使用方法。

流式检测细胞周期要点

1.收集细胞；～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀；％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h； 4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）； 5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h；目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%. 2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？ A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？ A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

酵母菌培养基的培养技术

酵母菌的培养技术一.酵母菌的培养基的配方 1.麦芽汁培养基的配制培养基成分:新鲜麦芽汁一般为10-15波林。配制方法:(1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全) (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6.4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 2.马铃薯葡萄糖培养基的配制培养基成分:马铃薯20g 葡萄糖2 g 琼脂1.5-2g 水100ml 自然pH 配制方法:(1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。（2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 3.豆芽汁葡萄糖培养基的配制

细胞周期同步化

细胞周期同步化在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成

实验报告

＆1 走进生物实验室【实验目的】：识别本校生物实验室器具，结合各种器具辨认并说明其用途。【课前准备】放大镜、解剖针、载玻片、盖玻片、显微镜、烧杯、试管夹、培养皿、刀片、滴管、三脚架和石棉网等。【实验步骤】*认识材料和用具引导学生观察 (一)图1中是生物实验室常用的实验器具，你能把它们按各自的用途进行归类吗? (1)属于观察器具的是____；(2)属于解剖器具的是____； (3)属于加热器具的是____；(4)属于通用器具的是____。图1 实验室常用的实验器具（二）1．认识显微镜的主要结构，写出显微镜主要部分的名称。 ⑴______⑵______⑶______⑷ ______⑸_____（6）_ ⑺______⑻_______⑼_______⑽ _______⑾______⑿_______⒀ _______⒁_______ 【教学反思】这是学生第一次走进实验室，第一次接触生物实验，所以必要的实验规则是要强调的，实验秩序虽然有些乱，但学生在实验中体验到了生物学科的奥妙，对生物学稀罕生了浓厚的兴趣。

＆2 练习使用显微镜【实验目的】：正确说明显微镜的结构与功能,能独立、规范地使用显微镜，能观察到清晰的物像；在认识、使用显微镜的过程中发现问题，并尝试解决问题；【课前准备】准备显微镜，并逐个检查（准备两个不同倍数的目镜）；三种标本（写有“上”字的玻片；写有数字的透明纸；写有数字的不透明纸；），擦镜纸，纱布，显课前每班培训几名学生，以便课上帮助教师辅导其他学生。【实验步骤】 *认识材料和用具引导学生观察实验桌上显微镜、玻片标本、擦镜纸、纱布等。 *取镜和安放右手握，左手托；略偏左，安目镜。指导学生看书37页：取镜和安放。强调安放目镜时，手指不要触摸镜头，对学生进行爱护显微镜的教育。 *显微镜的构造学生两人一组，看书对照实物认识显微镜各部分名称，之后回答教师指示部分的名称。（教师利用课件，点击即显示各部分名称） *显微镜的使用教师对学生的回答进行鼓励，引出显微镜的使用。介绍三种观察标本：（1）写有“上”字的玻片；（2）印有数字的透明纸；（3）写有数字的不透明纸。对光要求学生先看书，然后指导学生动手观察。按照先看到一个白亮的视野→放入标本→-看到清晰像的顺序（建议先观察2号标本）。（1）低倍物镜对准通光孔。（2）左眼看，右眼睁。（3）转动反光镜，看到明亮视野。观察学生边看书自学边操作显微镜进行观察。（1）标本放在载物台上，压住，正对通光孔。（2）镜筒先下降，直到接近标本。（3）左眼注视目镜，使镜筒缓缓上升，直到看清物像。强调：⑴用低倍物镜（10×或8×，即短的物镜）对准通光孔。⑵转动转换器的手法要正确，对学生进行爱护显微镜的教育。⑶镜茼先下降后上升，镜筒下降时，眼睛一定要看着物镜，以免压碎标本。 ⑷左眼看目镜，右眼睁开是为了画图。引导学生继续观察。【教学反思】上好本节课的关键是组织好学生进行探究和操作，教师最好课前培训几位学生作助手，这样看似麻烦，实际在上课时解决了不少问题，以后的学习中还会用到显微镜，所以在开始就要强调规范操作，帮助学生养成良好习惯。＆3 练习测量

细胞增殖细胞周期的测定方法

苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 1 “细胞增殖”相关知识的建构（2 课时）一、减数分裂与基因的分离、自由组合定律请画出能体现基因自由组合现象的细胞分裂图像例1、（08 江苏）某种昆虫长翅（A）对残翅（a）为显性，直翅（B）对弯翅（b）为显性，有刺刚毛（D）对无刺刚毛（d）为显性，控制这3 对性状的基因均位于常染色体上。现有这种昆虫一个体基因型如下图所示，请回答下列问题。（1）长翅与残翅、直翅与弯翅两对相对性状的遗传是否遵循基因自由组合定律，并说明理由。。（2）该昆虫一个初级精母细胞产生的精细胞的基因型为____________。（3）该昆虫细胞有丝分裂后期，移向细胞同一极的基因有。（4）该昆虫细胞分裂中复制形成的两个D 基因发生分离的时期有______ 。（5）为验证基因自由组合定律，可用来与该昆虫进行交配的异性个体的基因型分别是 _______________________________________________ ____________________________ 。二、细胞分裂与可遗传变异请画出可遗传变异种类的概念图苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 2 1、基因重组（非同源染色体的自由组合、交叉互换）例2、（07 广东）在减数分裂中每对同源染色体配对形成四分体，四分体中的非姐妹染色单体之间经常发生交换。实验表明，交换也可以发生在某些生物体的有丝分裂中，这种现

象称为有丝分裂交换。图39—1 是某高等动物一个表皮细胞发生有丝分裂交换的示意图，其中D 和d，E 和e，F 和 f 表示某对同源染色体上的三对等位基因。图39—1 交换过程示意图（左：交换前的染色体；右：交换后的染色体）（1）请问该细胞在发生有丝分裂交换后，产生几种基因型的子代表皮细胞？并分别写出基因型 _______________________________________________ __________________。（2）如果不考虑该生物产生配子时发生的交换，那么该生物产生的配子有几种基因型？并写出基因型 _______________________________________________ _____________。（3）如果图39—1 是该生物的精原细胞在产生精细胞时发生减数分裂交换后的结果，请问由它产生的配子类型有几种？并写出基因型 ______________________________。（4）如果细胞在减数分裂和有丝分裂中都发生交换，你认为哪一种分裂方式对于遗传多样性的贡献更大？为什么？ _______________________________________________。 2、染色体变异（染色体结构变异、染色体数目变异）例 3、（10 苏州高二期末）右下图表示某生物体的细胞进行减数分裂过程中，其中联会的两对染色体之间出现异常的

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼脂15g/L PH自然

（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。

草履虫伸缩泡观察实验报告

草履虫伸缩泡观察实验报告摘要：伸缩泡是草履虫体内水分调节细胞器，是一种规律性伸缩的液泡。在草履虫的内质与外质之间有2个伸缩泡，一前一后。每个伸缩泡向周围细胞质伸出放射排列的收集管。在电镜下，这些收集管端部与内质网的小管相通联。在伸缩泡及收集管上有由一束微管组成的收缩丝。由于收缩丝的收缩使内质网收集的水分（其中也有代谢废物）排入收集管，注入伸缩泡，经由表膜小孔（排泄孔）排出体外。前后两个伸缩泡交替收缩，不断排出体内过多的水分，以调节体内渗透压平衡。本周动物生物学实验课上我们小组进行了草履虫伸缩泡的观察实验，我们采用分组的方式进行研究，设置了浓度梯度（生理盐水% 、 % 、 % 、 % 、% 、蒸馏水）记录不同浓度下一分钟内草履虫伸缩泡的收缩次数，研究外界环境浓度对草履虫伸缩泡收缩运动的影响。我们收集到的数据是蒸馏水状态下伸缩泡平均每分钟收缩5次，原液中伸缩泡平均每分钟收缩2次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩3次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩1次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩2次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩1次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩0次。大致可以看出草履虫所处外界环境浓度越高时收缩次数越少，在浓度过高时伸缩泡不再收缩。通过这次实验，我们了解了草履虫的基本特征，探究了其伸缩泡的活动机理，进一步掌握观察了微小活动目标的技巧。关键词：草履虫，伸缩泡，收缩次数，不同浓度正文一、实验材料准备采集的原生动物培养液、秒表、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、镜头纸、棉纤维、牙签、不同浓度生理盐水（%、%、%、%、%）、蒸馏水、纱布。二、实验方法 1.分组安排本实验组组共六人，分别负责观察并记录在蒸馏水，浓度为%，%，%，%，%的生理盐水中草履虫伸缩泡的收缩次数，最后大家观察原液状态下草履虫伸缩泡伸缩情况，每人选取5个观察对象（样本），每个样本计数 3 个计时单位，以一分钟为一个计时单位。最后求平均值，计算出每个时间单位（一分钟）内草履虫伸缩泡的收缩次数。 2.实验操作（1）临时玻片制作 ①在载玻片上滴一滴生理盐水（或蒸馏水）。 ②用牙签挑取培养缸边或稻草杆上的膜状粘腻物，蘸入生理盐水（或蒸馏水）水滴中。 ③将小片棉纤维撕得很薄，轻轻覆盖在生理盐水（或蒸馏水）水滴上。* ④盖上盖玻片（用镊子夹取，45o角盖盖玻片）。 ⑤轻压盖玻片，同时用吸水纸在盖玻片四周边缘处轻轻吸去多余水分。当虫体被压，运动困难，略有变形时伸缩泡运动较易观察。（2）观察临时玻片 ①把玻片放在载物台上，转动光圈调亮视野，将物镜转换到4×，转动粗准焦螺旋直至视野清晰，将草履虫聚集的部分移至视野正中央。 ②转换到10×的物镜，转动粗准焦螺旋使视野清晰，可观察到草履虫大致形态，寻找运动不剧烈的草履虫（以困在棉纤维中的草履虫为宜）作为样本，将其移至视野中央。 ③转换至40×的物镜，转动光圈将视野稍稍调暗（便于观察草履虫伸缩泡的收缩），转动细准焦螺

流式检测细胞周期和凋亡实验步骤

流式细胞技术检测细胞周期分布 1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀； 2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。重复此步骤2次，以除去胰酶； 3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜； 4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇； 5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。 6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。 2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平 1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常 2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内； 3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育15min； 4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育；空白：Annexin V—FITC结合液200ul 双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI 单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC 190ul结合液+10PI 5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

动物学草履虫实验报告doc

动物学草履虫实验报告篇一：草履虫的系列实验草履虫的系列实验纪星宇（XX4）一、目的与内容 1.学习原生动物的采集、单克隆培养和鉴种 2.探究原生动物的应激性，理解原生动物应激性的原始性 3.观察原生动物的无性生殖过程和规律 4.观察草履虫食物泡的变化，研究食物泡中的PH变化 5.比较原生动物和后生动物组织细胞对刺激反应的异同 6.学习常用试剂的配制和使用 *7.了解原生动物有性生殖的方式和决定因素，研究接合生殖前后大核系的变化内容：草履虫的采集与鉴种草履虫横二分裂的观察草履虫食物泡的观察草履虫趋性的实质后生动物激素对原生动物的影响常用生物学试剂对原生动物的作用草履虫相对接合型的鉴定光线对接合生殖的影响草履虫接合生殖前后接合型的变化二、材料与用品新鲜稻草、烧杯、滤纸、酒精灯、玻璃棒、过滤漏斗、玻璃导管、广口瓶、标签纸、台灯、表面皿、

微吸管、试管、PH试纸、镜台尺、载玻片、盖玻片、培养皿、离心机、棉球、恒温箱、托盘天平、量筒、温度计、中性红纯乙醇溶液、2%秋水仙素溶液、1%乙醚溶液、0.02%詹纳斯绿B染液、20%丙酮溶液、碳酸氢钠、蒸馏水、0.01%肾上腺素、0.01%胰岛素、碘液三、操作与观察（一）草履虫的采集与鉴种 1.配制稻草培养液取新鲜稻草（注意清洗以除去肥料和农药）10g和碳酸氢钠1g，加入1L 清水于烧杯中煮沸10~15min，直至液体成为清亮的黄褐色。趁热过滤后煮沸10min，在烧杯上蒙上双层洁净纱布，保温在20~30℃，培养3d 直至液面出现灰白色薄膜。通入充足空气备用。 2.采集自然水体中的草履虫在水流缓慢，有机质丰富的水体中取带有微小白色浮渣的自然水。取池塘、下水道、水田、湖沼各一处，分别采水250ml（注意水样不要混入泥沙渣滓，运输时不要封口）。依次编号为A、B、C、D。水面上20cm处施加垂直光照24h。 3.草履虫的单克隆培养在表面皿中放适量蒸馏水，在体视显微镜下吸取单个草履虫（可利用其趋电性分离以

细胞活性测定

细胞活性测定方法细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。