浮游菌测试操作规程

主题内容和适用范围

本规程规定了公司洁净室（区）中浮游菌的测试条件，测试方法及控制标准。本规程适用于公司洁净室（区）浮游菌的测定和洁净度等级的验证。相关文件

《药品生产质量管理规范》 2010年版《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》 GB/T16293—2010 术语

洁净室（区）

对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。其建筑结构、装备及其使用，均具有减少对该区域内污染源的介入、产生和滞留的功能。洁净工作台

一种工作台或者与之类似的一个封闭围挡工作区。其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，如垂直层流洁净工作台、水平层流洁净工作台、自净器等。菌落

细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU 。通常用个数表示。浮游菌

用本规程提及的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。浮游菌浓度

单位体积空气中含浮游菌菌落的多少，以计数浓度表示，单位是个/m 3或个/L 。静态测试

洁净室（区）净化空气调节系统已处于正常运行状态，工艺设备已安装，洁净室（区）内没有生产人员的情况下进行的测试。动态测试

洁净室(区)已处于正常生产壮态下进行的测试。职责

中心化验室微生物限度检查室人员负责浮游菌的定期检测工作。质量标准

环境菌落监测标准区域内容 D 级洁净区万级洁净区百级洁净区标准cfu/平皿 ≤200 平均≤100 平均≤1 警戒限度cfu/平皿 160 2 --------- 测定频次

1次/季

1次/日

1次/班

QCA/QC-SOP05-003

山东良福制药有限公司

起草人日期浮游菌测试操作规程

审核人日期批准人日期第05版

实施日期

总页数

共6页

材料与设备

设备

浮游菌采样器、净化工作台、恒温培养箱、烘箱、高压蒸汽灭菌器、放大镜、显微镜、电冰箱、

菌落计数器。

用具

培养皿（平皿）：?90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。钢精锅：10000ml。三角瓶：300ml。天平、称样纸、勺。此外还需要棉塞、牛皮纸、线绳、微波炉、玻璃棒、海棉擦、毛刷等用具。

空白培养皿的准备

包扎

取洁净、干燥的培养皿用牛皮纸或专用包皮布包严扎紧待灭。

灭菌

灭菌采用湿热灭菌法。条件：、121℃，20min。灭菌时要注意按照操作规程操作高压蒸汽灭菌器。

传输

将灭菌并用余热烘干后的平皿，传至准备间，并用紫外线照射备用。空白平皿一般在注皿前24小时内灭菌，传入。

质量要求

已备好待用的平皿应确保无损、无污、无菌、干燥。

培养基的准备及灭菌

大豆酪蛋白琼脂培养基制备。

取大豆酪蛋白琼脂培养基约34g，加蒸镏水1000ml加热溶解即得。

溶解与分装

培养基配制好后，分装入洁净干燥的300ml三角瓶内，约200ml/瓶，并塞好棉塞，扎上牛皮纸帽，待灭。培养基的灭菌

采用湿热灭菌法。除另有规定外，条件，121℃，20分钟。注意：灭菌结束后自然降压，以防培养基在突然降压后沸腾。

注皿

无菌室应整洁、有序，各用具处于定置状态。

注皿前对无菌室作适当消毒和清洁，并开紫外线照射30分钟。

把准备好的空白平皿去掉牛皮纸，放在工作台上，按每若干个为一组摞齐摆好。

灭菌的培养基，加热溶化传入无菌室，用75%酒精擦试瓶体后，放在工作台上，打开紫外线照射，待其冷至45℃左右时，开始注皿。

注皿操作

操作员消毒手，做房间和工作台环境皿。

操作员在符合100级空气洁净度条件的层流净化工作台上将培养基注入培养皿。

注入量：?90mm培养皿15ml。注皿时，三角瓶倾斜，把皿盖微微打开（不超过45O角），将培养基注入皿中，动作尽量快、稳、轻。

将注好的平皿，每若干个为一摞排放整齐，用浸有75%酒精的绸布盖上，打开紫外灯照射待凝。

凝固后，平板倒过来，收入筐内，包好，放培养箱中预培养，30～35℃，48小时，看培养基本身是否染菌。

质量要求：制备好的培养皿（基），经48小时培养后，无菌生长方可进入待用状态。若长菌培养皿大于该全部培养皿的10%，视为该批培养基不合格。应倒掉重新配制。

用具的洗涤

用后培养皿的清洗

使用后，先用海棉擦沾水和洗衣粉擦去皿盖上的记号，然后铲出培养基，用海棉擦或毛刷蘸洗涤剂在温水中洗干净，用自来水冲四、五次，再用蒸镏水冲洗2～3次，烘干，备用。

用后三角瓶和钢精锅的清洗。

使用后，先用热水烫洗1～2次，然后用毛刷蘸洗涤剂刷洗干净，用自来水冲四、五次，再用蒸镏水冲洗2～3次，晾干，备用。

测试方法

本测试方法通过带浮游微生物空气高速通过微孔，被均匀撞击在培养皿内的琼脂表面；这些活体微生物在琼脂表面获得均匀和充分，在培养过程中，快速发生动态再水化过程，高速生长，从而更快得出结果。在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。

培养皿选用?90mm 型

采样点的布置

培养皿应布置在具有代表性且气流扰动极小的地方。

采样点位置的详细规则见附件一

洁净室（区）采样点布置宜力求均匀，避免采样点在局部区域过于稀疏。下列多点采样的采样点布置图示可作参考。（见图）

图平面采样点布置图

100级单向流区域，洁净工作台或局部空气净化设施的采样点宜布置在正对气流方向的工作面上，气流形式可参考以下图、图。

图水平单向流气流形式

图垂直单向流气流形式

最少采样点数目参见采样点一般在工作面上高度的平面上均匀布置。最少采样点数目浮游菌的最少采样点数目可按表一确定。

表一最少采样点数目

表二最小采样量

培养皿在用于检测时，为避免培养面在运输过程中造成的影响，宜同时进行阴性对照试验，每次或每个区域取一个对照皿，与采样皿同法操作单不需要暴露采样，然后与采样后的培养皿一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。

采样方法

环境皿

对环境进行静态测试，测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服，室内测试人员不得多于二人，将已制备好的培养皿按要求放置，打开皿盖约2/3，皿盖搭在皿底沿上，不得过大或过小，使培养基表面暴露小时后，将皿盖合上。

人员手皿

在进入洁净区前或操作过程中对人员做手皿，操作者手拿制作好的培养皿，

左手在下，右手在上，右手拿皿底，左手拿盖始终向上，打开后，被检者伸开手掌，手心向上，手指轻轻触碰培养基，培养基上应有指纹，然后迅速合上盖子。

无菌衣的做皿

对灭菌后的无菌衣做皿时，取中间部分，右手拿皿底，左手拿皿盖和物品，将物品轻轻和培养基接触，合上盖子。

工艺用水和消毒剂的做皿

用管道输送的工艺用水和消毒剂做皿时，在取样处，打开龙头，流量不要太大，打开平皿，令皿底侧竖起来，迅速用工艺用水或消毒剂冲刷一下，然后迅速合上盖子。

培养

培养温度：30～35℃；培养时间：48小时。

每批培养基选定几只培养皿作空白对照培养，以检验培养基本身是否受到污染。

菌落计数

用肉眼直接计数，必要时用5—10倍放大镜检查有否遗漏，并记录。

若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。

结果计算

菌落数

平均菌落数M——= -——————————

采样量

如发现某处连续染菌，则应用显微镜分析菌型，并进行原因分析。

结果判定

以浮游菌判断洁净室（或洁净区）的洁净度是否合格，依据按照中的标准。

测试报告中应记录房间温度、相对湿度、压差及测试状态。

注意事项

测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性，正确性。

采取一切措施防止人为对样本的污染。

对培养基，培养条件及其他参数作详细的记录。

由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。

采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质，破损或污染的应剔除。

洁净室（区）在静态条件下检测的浮游菌数应符合规定。

使用测试仪器时应严格按照仪器说明书操作。

采样管的长度应根据测点的高度定，尽量减少弯曲。采样管严禁渗漏，内壁应光滑。