以组胺受体3为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立

以组胺受体3为靶点的高通量药物筛选1

细胞模型的建立

尹琪1，3，张以琳2，蒋亚琴3，刘红茹3

（1. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海南 儋洲,(571737)；

2.北京基因组研究所，北京,(101300)；

3.上海华大天源生物科技有限公司，上海,(201203)）

E-mail：yinyinqiqi@https://www.360docs.net/doc/4e14834930.html,

摘要：目的建立稳定表达组胺受体3（hH3R445）和Gα15蛋白的高通量药物筛选细胞模型，通过FlexStation工作平台，可应用该细胞模型筛选治疗失眠、精神分裂和老年痴呆症等中枢神经系统性疾病的药物先导化合物。方法用分子生物学的方法，亚克隆得到组胺受体3基因和Gα15基因。将体外培养的HEK-293细胞株用Gα15基因重组质粒进行稳定转染，得到稳定表达Gα15蛋白的母细胞系，然后在母细胞系中稳定转染组胺受体3基因重组质粒，筛选得到稳定表达组胺受体3和Gα15蛋白的细胞模型，并对所建立的筛选细胞模型进行功能性检测。结果建立了稳定、高效的高通量药物筛选细胞模型。结论建立的细胞模型可以应用于以组胺受体3为靶点的高通量药物筛选。

关键词：组胺受体3，细胞模型，高通量药物筛选

1. 引言

GPCR受体是一类重要的细胞表面膜蛋白，很多激素、神经递质等都是通过GPCR受体对细胞起作用[1]。目前，以GPCR受体为靶点的药物已经被广泛的应用于心脑血管疾病、胃肠系统疾病、癌症、免疫系统疾病、过敏反应和中枢神经系统疾病的治疗。据统计，世界销售额排名前200位的药物中，以GPCR受体为靶点的药物约占25％[2]，如Loratadine、Olanzapine 和Lasartan等。组胺受体3是GPCR受体组胺家族中的一员。

组胺受体3主要分布在中枢神经系统[3],对很多神经递质的合成与释放有调节作用[4]。组胺受体的激动剂可以应用于失眠、心肌缺血性心率失常、炎症、哮喘、偏头痛等疾病的治疗。已有报导组胺受体3的激动剂N-α-甲基组胺可以有效缓解偏头痛患者的病情[5]。另外，组胺受体3的拮抗剂可以应用于过敏性鼻炎、肥胖、嗜眠发作、认知失常、精神分裂和老年痴呆症等疾病的治疗[6]。目前，很多国际性的制药公司和研究机构都致力于组胺受体3配体的成药研究，希望建立一种高效、稳定的高通量筛选平台从而能够筛选得到生理活性高，靶点特异性强的组胺受体3的配体，为进一步的实验研究提供先导化合物。

由于新一代对钙离子敏感的荧光指示剂fluo－3的发明，以及自动化的检测平台1国家自然科学基金资助项目（项目编号30572335）。

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FlexSstation和FLIPR的出现，使检测细胞内的钙离子浓度变化成为一种适用范围广泛、操作简便、灵敏度高的高通量筛选方法。由于信号传导途径的限制，一般只有Gq类的GPCR可以采用这种筛选方法。但是，伴随着Gα15和Gα16这两种Gq类G蛋白的发现[7]，现在检测胞内钙离子浓度的高通量筛选方法已经打破了原有的信号传导途径的限制，可以广泛的应用于以GPCR 为靶点的高通量药物筛选工作。

2. 细胞模型的建立

本文在前人工作的基础上,用重组载体将Gα15稳定转染到HEK-293细胞系中，建立了可以广泛应用于GPCR受体高通量药物筛选的母细胞系HKE－293－Gα15。然后在建好的母细胞系中，稳定转染组胺受体3，通过抗生素筛选得到以组胺受体3为靶点的高通量药物筛选细胞模型。通过组胺受体3天然激动剂组胺的量效关系实验、拮抗剂clobenpropit的量效关系实验、以及不同类型组胺受体的激动剂和拮抗剂的量效关系实验证明建立的组胺受体3高通量药物筛选细胞模型信号稳定，与特异的受体激动剂或者拮抗剂结合能够引起细胞内钙离子浓度的变化。可以应用于以组胺受体3为靶点的高通量药物筛选。

2.1 材料与方法

2.1.1 药品与试剂

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶（NEB公司）；小提质粒试剂盒（Mo Bio公司和QIAGEN 公司）；pcDNA3.1（+）和pIREShyg2真核细胞表达载体、lipofectamine2000（Invitrogen 公司）；DMEM高糖培养基（GIBCO公司）；胎牛血清FBS（Hyclone公司）；EDTA、HEPES、DMSO、L-Glutamine（Sigma）；抗生素Hygromycin、G418（Calbiochem公司）； HBSS成分如下：CaCl22.26mM、MgCl2 0.49mM、MgSO4 0.41mM、KCl 5.33mM、KH2PO4 0.44mM、NaCl 137.93mM、Na2HPO4 0.34mM、D-Glucose 8.34mM（PH值7.24）；reddye6X成分如下：Tartrazine 9mM、Acid Red1 24mM、PEG 24％；人胚肾细胞系HEK-293（中国医学科学院基础所细胞中心）。

2.1.2仪器

PCR仪(MJ Research, Inc, PTC-200, 美国)，读板机FlexStation II384 plate reader (Molecular Devices，美国)，CO2培养箱 (Thermo Forma, 3111, 美国)，荧光显微镜(Olympus Co., IX70, 日本)及荧光激发照相系统(Omega Co., C5060系统, 日本)等。

2.1.3质粒构建及鉴定

Gα15基因和组胺受体3基因均为谈学海老师馈赠，分别通过PCR的方法和酶切的方法将Gα15基因和组胺受体3基因亚克隆到所需要的真核细胞表达载体上，具体构建和鉴定方法如下：

用PCR的方法将Gα15基因从pBSG15质粒亚克隆到pIREShyg2载体上，根据Gene Bank Accession Number: M80632的序列信息和pIREShyg2载体MCS位点信息，将Gα15基因克隆到BamHI位点处。引物设计如下：正向链5’?CGC GGATCC ACC ATG GCC CGG TCC CTG ACT ?3’,反向链5’?CGC GGATCC TCA CAG CAG GTT GAT CTC GTC C ?3’。 用BamHI限制性内切酶

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酶切PCR产物和pIREShyg2载体，胶回收相应片断连接后转化，挑克隆，经过酶切鉴定后，由上海鼎安生物科技有限公司测序。

将pcDNA3.1/hyg载体上的组胺受体3基因亚克隆到pcDNA3.1（+）载体上，使用Hind Ⅲ和Xbal双酶切系统酶切外源基因和载体，胶回收连接后转化，挑克隆，做酶切鉴定正确，送上海鼎安生物科技有限公司测序。

2.1.4细胞转染及挑克隆

6孔板每个孔铺3x105 HEK-293细胞，24小时后用lipofectamine2000转染质粒pIREShyg2－Gα15，阴性对照为空的HEK-293细胞系。48小时后分别以1：4和1：10的比例传代到60mm小皿中，加100ug/ml抗生素Hygromycin筛选，10d左右挑克隆到96孔板培养，扩大培养到24孔板后，进行瞬时转染并用FlexStation检测。

用挑到的HEK-293－Gα15母细胞铺6孔板，每孔3x105个细胞，24小时后用lipofectamine2000转染质粒pcDNA3.1（+）－H3，阴性对照为HEK-293- Gα15母细胞，48小时后分别以1：4和1：10的比例传代到60mm小皿中，加入600ug/ml的抗生素G418筛选，10d左右挑克隆到96孔板培养，扩大培养到24孔板后,用FlexStation检测。

2.1.5 FlexStation检测

将建好的细胞模型铺3 x104个细胞每孔到96孔黑壁透明底检测板中（Metrigel包被），24小时后检测。加入含有fluo－3，AM(4uM)、probenecid（1mM）和reddye1X的检测试剂（溶于HBSS）。37℃孵育1小时。用FlexStation读板机加入刺激剂并检测，根据检测数据挑选出钙流信号信噪比高而且稳定的克隆，继续扩大培养，并冻存备用。

2.2结果

2.2.1质粒的构建及提取

Gα15基因长1128bp，经BamHI限制性内切酶酶切后得到重组质粒pIREShyg2－Gα15，测序结果与Gene Bank Accession Number: M80632的序列信息比较一致。将带有该质粒的大肠杆菌菌株扩增培养，用小提质粒试剂盒（Mo Bio）抽提。紫外分光光度计检测，读数A260/A280位于1.8到2.0之间可以用于转染。

组胺受体3基因长1338bp，经HindⅢ和Xbal双酶切后得到重组质粒pcDNA3.1（+）－H3,测序结果与Gene Bank Accession Number:NM007232的序列信息比较一致。将带有该重组质粒的大肠杆菌菌株扩增培养，用小抽质粒试剂盒（QIAGEN）抽提。紫外分光光度计检测，读数A260/A280位于1.9到2.0之间可以用于转染。

2.2.2检测结果

抗生素G418筛选后挑16个HEK-293-H3R-Gα15克隆到96孔板中，扩大培养到24孔板后用FlexStation读板机检测。检测得到6个信号较好的克隆，用FlexStation检测比较这6个克隆的信噪比，挑出信噪比最高的一个作为筛选用的细胞模型，扩大培养后，分批冻存，用于以后的实验。

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2.2.2.1比较母细胞HEK-293-G α15与HEK-293-H 3R-G α15对组胺刺激的反应

在HEK-293-G α15和HEK-293-H 3R-G 15细胞系中，分别加入1x10－6mol· L －1

的组胺，用FlexStation检测。

检测结果如图1所示，HEK-293-G α15母细胞系在组胺刺激下没有钙流信号产生，而母细胞系中稳定转染组胺受体3后，即HEK-293-H 3R-G α15细胞系能够在组胺的刺激下产生明显的钙流信号。结果表明，在母细胞系HEK-293-G α15中没有可检测到的组胺受体3的组成性表达，同时表明我们建立的细胞模型可以通过FlexStation检测对组胺受体3特异性的配体表现出生物学活性。

3+G α15HEK-G α15

Figure 1 Compare G α15-coexpressing HEK cells with G α15-transfected HEK cells through functional detection using FlexStation. G α15-transfected HEK cells and H 3- and G α15-coexpressing

HEK cells were treated with 1uM histamine at the 20-s time point.

2.2.2.2检测不同浓度的组胺刺激下细胞模型中钙流信号的变化

用组胺受体3的天然激动剂组胺刺激HEK-293-H 3R-G α15细胞系，组胺的浓度分别为0、

1x10－9、1x10－8、1x10－7、1x10－6、1x10－7、1x10－8

mol· L －1

。FlexStation检测结果如图2。 从图2可以看出HEK-293-H 3R-G α15细胞系对组胺受体3的天然激动剂组胺表现出剂量依赖效应，EC 50值为

50nM，与文献报道相近[8]。

Figure 2 Histamine dose response curve was determined using FlexStation in the

H 3-and G α15-coexpressing HEK cell line . At each concentration, the dots are duplicate data from a representative experiment. The concentration at which histamine gave 50% of the maximal response(EC 50) was calculated to be 50 nM.

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2.2.2.3检测不同浓度的clobenpropit刺激下细胞模型中钙流信号的变化

用HEK-293-H3R-Gα15细胞模型检测组胺受体3的拮抗剂clobenpropit对激动剂组胺的拮抗作用，clobenpropit的浓度分别为0、1x10－9、1x10－8、1x10－7、1x10－6、1x10－7、1x10－8mol· L －1，组胺刺激的终浓度为1x10－6 mol· L－1。 FlexStation检测结果如图3。

从图3可以看出HEK-293-H3R-Gα15细胞系对组胺受体3的拮抗剂clobenpropit也表现出剂量依赖效应，IC50值为0.5uM。

Figure 3 clobenpropit dose response curve was determined using FlexStation in the H3-and Gα15-coexpressing HEK cell line. At each concentration, the dots are duplicate data from a representative experiment. The concentration at which clobenpropit gave 50% of the maximal inhibitor response(IC50) was calculated to be 500nM.

2.2.2.4检测不同类型组胺受体的激动剂刺激下细胞模型中钙流信号的变化

组胺受体家族，除H3R外还有H1R、H2R和H4R三种不同的组胺受体[9]。组胺（histamine）是四种组胺受体的天然配体，但是除了组胺这一天然激动剂外，每种组胺受体还分别有自己特异的激动剂，如H1R的特异激动剂pyridine；H2R的特异激动剂dimaprit和H3R的特异激动剂imetit等。由于H4R发现不久，所以还没有很广泛应用的特异性的激动剂，但是有文献报道说4－甲基组胺是一种特异性的H4R的激动剂[8]。

分别使用不同浓度的H1R、H2R和H3R特异性激动剂，以及天然的组胺受体激动剂组胺刺激HEK-293-H3R-Gα15细胞模型，用FlexStation检测结果如图4。

我们建立的细胞模型对组胺以及H3R特异性的激动剂imetit都表现出剂量依赖效应，但是对H1R的特异激动剂pyridine和H2R的特异激动剂dimaprit则没有量效关系。从数据分析证明，组胺受体3特异性的激动剂可以引起细胞内的钙离子浓度变化，并表现出量效关系。

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Figure 4 H3-and Gα15-coexpressing HEK cell line was treated with different concentration of histamine, imetit, pyridine or dimaprit. The data shown were the average of one independent

experiment performed in duplicate

2.2.2.5检测不同类型组胺受体的拮抗剂刺激下细胞模型中钙流信号的变化

与激动剂相同，四种不同的组胺受体也存在各自特异性的拮抗剂，如Mepyramine是H1R 的特异性拮抗剂；Cimetidine是H2R的特异性拮抗剂；Clobenpropit是H3R的特异性拮抗剂；而JNJ7777120则是H4R的特异性拮抗剂。

我们分别使用不同浓度的H1R、H2R、H3R和H4R特异性拮抗剂刺激HEK-293-H3R-Gα15细胞模型，组胺刺激的终浓度为1x10－6 mol· L－1。FlexStation检测结果如图5。

HEK-293-H3R-Gα15细胞模型对H3R的特异性拮抗剂Clobenpropit表现出剂量依赖效应，但是对其他组胺受体的特异性拮抗剂则没有剂量依赖性关系，实验结果表明其他组胺受体的特异性拮抗剂无法拮抗组胺在HEK-293-H3R-Gα15细胞模型中引起的细胞内钙流信号，但是Clobenpropit则可以有效的拮抗组胺引起的细胞内钙流信号，并表现出量效关系。

Figure5 H3-and Gα15-coexpressing HEK cell line was treated with different concentration of mepyramine，cimetidine，clobenpropit or JNJ7777120. The datas shown were the average of one

independent experiment performed in duplicate

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3. 讨论

组胺受体3可以调节许多不同的生理生化过程，如觉醒、认知、遗传性过敏和食欲等[10][11][12]。以组胺受体3为靶体的药物先导化合物很有可能成为治疗多种中枢神经系统性疾病的有效药物。本细胞模型的建立为针对组胺受体3这一药物靶点进行高通量药物先导化合物筛选提供了良好的筛选模型。同时，利用检测钙离子浓度的方法进行的高通量筛选具有既可以筛选激动剂，又可以筛选拮抗剂的优点。另外，随着FLIPR和FlexStation等仪器的出现，全自动化的测钙高通量筛选平台已经成熟[13]。利用本细胞模型可以实现全自动的高通量药物先导化合物筛选，因此本细胞模型有很好的应用前景。

相对于其他的高通量筛选方法，本细胞模型采用的高通量筛选方法具有自动化程度高、系统均一性好、节省时间等优点。同时本筛选系统也存在一定的缺陷，如在粗筛时，如果筛选的化合物库成分比较复杂，则出现假阳性的比率较高(约为70%左右，数据未显示)，高纯度的单体化合物库和大规模的高通量筛选可以有效的克服这一缺点。同时，HEK-293-H3R-Gα15细胞模型的建立，为不同信号传导途径的GPCR受体的高通量药物筛选以及GPCR孤儿受体的去孤儿化提供了一种新的研究途径。

参考文献

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[13]Chambers,C. et al.Measuring intracellular calcium fluxes in high throughput mode. Combinatorial chemistry and HTS,2003,6:355-362.

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Establishment of high-throughput drug screening model targeting human histamine receptor 3 in cell

YIN Qi1,3，ZHANG Yilin2，JIANG Yaqin3，LIU Hongru3（1.Chinese Academy of Tropical Agricultural Science, Rubber Cultivation Research

Institute, Danzhou571737,China，

2.Beijing Genomic Institute, Beijing101300, China，

3.Shanghai HD Biosciences Co.,Ltd, Shanghai 201203，China）

Abstract

Aim To screen new drug for the treatment of insomnia, schizophrenia, Alzheimer’s disease and other central nerve system’s disorder, high-throughput drug screening cell model which were transfected with human histamine receptor 3 gene（hH3R445）a nd Gα15 gene, and were detected by FlexStation have been established. Methods we obtained histamine receptor 3 gene and Gα15 gene by subclone. We transfected HEK-293 cell with Gα15 gene, gained HEK-293- Gα15 parental cell line which stable expressing Gα15 protein, and subsequently parental cell line was stable transfected with human histamine receptor 3 gene. Cell clones expressing of histamine receptor 3 gene（hH3R445）a nd Gα15 gene were selected by antibiotics screening. Then we made different ligands dose response curves on the cell model. Results A high throughput screening cell model with stable, good reproducibility has been established. Conclusion This drug screening cell model can be used for histamine receptor 3 target high-throughput drug screening.

Keywords: histamine receptor 3,cell model, high-throughput screening

作者简介：

尹琪，中国热带农业科学院橡胶研究所在读研究生；

张以琳，北京基因组研究所在读博士；蒋亚琴，刘红茹，上海华大天源生物科技有限公司员工。

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