大肠杆菌操作步骤
大肠杆菌分离操作步骤
1操作前超净工作台紫外线灭菌20分钟以上
2 打开工作台，用酒精棉球将禽肝脏上表面仔细擦拭一遍，（肝脏上有包膜的先把包膜处理掉）放置晾干2分钟；选取小许酒精棉球，点燃后在肝脏表面撩一遍，随后将接种环放置酒精灯外焰进行消毒片刻，离开火焰使接种环适度降温
3 接接种环插入肝脏内部，蘸取少量肝脏在麦康凯固体培养基上划线接种，在麦康凯培养基上进行“之”字型划线接种每划线结束一次后在酒精灯火焰上烧灼接种环，待降温后在上次划线的末端接着划“三”字型，重复划线2-3次，结束后将麦康凯平板置37℃温箱中培养18-36h后，标记为F1代，观察生长情况。大肠杆菌呈现典型的红色圆形菌落。
水中大肠杆菌的检测方法
水中大肠杆菌的检测方法 一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在351 ℃、483小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰(一)水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。(二)检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备(一)量筒：100至1000 mL之量筒。(二)吸管：有 0、1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。(三)试管：大小约15015 mm之试管或有盖螺旋试管。(四)发酵管（fermentation tube）：大小约229 mm 之玻璃管。(五)稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六)锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。(七)采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。(八)冰箱：温度能保持在42℃者。(九)天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0、01 g；待测物重量不大于2 g
时，须能精秤至0、001 g。()培养箱：温度能保持在351℃者。 (一)高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2 或1、 1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。(二)高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。(三)接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。(四)pH计：精确度达0、1 pH单位。 五、试剂(一)试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。(二)培养基，应使用市售商品化培养基。１、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose） 20、0g乳糖（Lactose） 5、0g氯化钠（NaCl） 5、0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 2、75g磷酸二氢钾（KH2PO4） 2、75g硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate） 0、1g试剂水 1L 配成2倍浓度（取 71、2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，
最新大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生： 比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养： 在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度： 葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。 常用的控制方法主要有： 恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度 大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
水中大肠杆菌地检测方法
附件 水肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所 产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
更衣验证方案
粉针剂车间洁净区更衣程序 验证方案 2011年07月
验证方案的起草与审批 验证小组成员 部门人员职责 粉针剂车间李海龙负责验证方案的组织与实施 粉针剂车间黄仁春负责验证方案的拟定、验证报告的起草设备部霍育生负责验证所需仪器、设备的正常运行QA部宋新莉负责验证过程中的监控和取样 QC 部张华负责验证过程中环境和样品的检测 方案起草 部门起草人日期 方案审核 审核签名日期 验证委员会 进行审阅会 签 方案批准 批准人批准日期 方案实施日期： 目录 1 验证概述 (4)
2 验证目的 (4) 3 风险评估 (4) 4 验证标准 (5) 5 验证范围 (5) 6 验证周期 (6) 7 验证职责 (6) 8 验证实施的前提条件 (6) 9 验证方案的起草与审批 (7) 10 验证时间安排 (7) 11. 验证 (7) 12 偏差处理 (11) 13 风险的接收与评审 (11) 14 验证结果评审和结论 (11) 15 方案修改记录 (11) 16.附件 (13)
1 验证概述 人员进入无菌区既不能灭菌、除菌，也不能消毒，以致成为污染洁净室环境的主要威胁,进入 （文件编号为SOP-02-SC-014/01）洁净区的工作人员均应按相应的《人员进出生产车间管理规程》 更衣和洗手，以尽可能减少对洁净区的污染或将污染物带入洁净区，从而保证药品的质量。 2 验证目的 ①对C级更衣程序的验证，其目的是证明人员按照现行批准的更衣程序进入C级洁净区，更衣效果符合要求，且不影响洁净区的环境，保证药品的质量。并对C级人员更衣进行确认。 ②对A/B级更衣程序的验证，其目的是保证进入A/B级洁净区的所有人员能按《人员进出生产车间管理规程》进行更衣，且所有人员更衣操作具有重现性，不会因不同人员理解不一致而在更衣操作中有何不同，造成个体差异，确保更衣程序及更衣效果符合要求，且不影响洁净区的环境，保证药品的质量。 3 风险评估 按照《质量风险管理规程》，并从进入A/B级、C级洁净区的人员更衣程序的综合因素出发，发现直接或间接影响产品质量的因素来确定风险识别。 3.1 经验证小组人员共同对更衣程序验证进行风险评估，对存在的质量风险提出了预防和纠正措施建议，具体见下表1：
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA 片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素 ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107
痢疾杆菌、大肠杆菌、肠道感染
黄连素的功效： 黄连素在临床中一直作为非处方药用于治疗腹泻，但是现代药理学研究证实黄连素具有显著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低胆固醇、抗制血管平滑肌增殖、改善胰岛素抵抗、抗血小板、抗炎等作用，因而在心血管系统和神经系统疾病方面将可能有广泛、重要的应用前景，日益受到重视。黄连素是一种重要的生物碱，是我国应用很久的中药。可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。它具有显著的抑菌作用。常用的盐酸黄连素又叫盐酸小檗碱，其化学结构如图所示。黄连素能对抗病原微生物，对多种细菌如痢疾杆菌、结核杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌及白喉杆菌等都有抑制作用，其中对痢疾杆菌作用最强，常用来治疗细菌性胃肠炎、痢疾等消化道疾病。临床主要用于治疗细菌性痢疾和肠胃炎，它无抗药性和副作用。用中医学解释，此类药物性凉，能清除邪热或虚热，清除有害毒物，自古以来就是中医手中的一味清热解毒良药。通常每次口服0.1~0.5克，每日三次。 黄连素的作用： 对痢疾杆菌、大肠杆菌、金葡菌等引起的肠道感染（包括菌痢）、眼结膜炎、化脓性中耳炎等有效。本品对幽门螺旋杆菌也有作用，而能使胃炎、胃及十二指肠溃疡减轻。近来还发现本品有阻断α-受体、抗心律失常作用。 简介： 黄连素是众多治疗腹泻药物中最为大家熟知、价格便宜、服用简单、携带方便的药物之一。所以，几乎家家户户备有此药，无论出差还是旅游，黄连素更是人们的必备药物之一。许多人在腹泻时第一时间就会想起它。应当说，它是一种物美价廉的好药。不过，要用好它，还是有许多诀窍的。在两年多前，国家药监局曾公布了一批停用的药品，其中包括复方黄连素片和复方黄连素注射液，有媒体误报黄连素已停用，引起了很大的误会。所谓的“复方黄连素”，是按照地方标准生产的药物，此次停用是因为“质量不可控”，该药与我们常说的黄连素是完全不同的药物。黄连素仍收录于国家基本药品目录，使用非常安全。 虽然黄连素是良药，但不可乱用，应正确选用。首先，对于全身性感染疾病，不适宜选择黄连素，因为它口服吸收极差，几乎停留在胃肠道，不易透过胃肠道进入血液，所以只适合胃肠消化道炎症性疾病。 其次，腹泻的原因很多，总体可分感染性腹泻，多呈急性腹泻；非感染性腹泻，多呈慢性腹泻。由上面对黄连素药理作用的介绍可知，黄连素只适用于感染性腹泻。胃肠感染表现可轻可重，轻者仅腹痛、腹泻，重者会有恶心、呕吐、发热寒战、食欲不振，严重时导致脱水、酸中毒、休克。一般而言，对轻型炎症可以选用黄连素，对于重型则必须合用抗感染作用强的抗生素。而慢性非感染性腹泻的病因复杂，肠易激综合征、溃疡性结肠炎、营养不良、内分泌疾病、肝硬化、尿毒症、过敏性疾病、癌症等，都可以导致慢性腹泻。对非感染性的
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
大肠杆菌在发酵乳中生长繁殖浅谈+-+LQ
大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长繁殖浅谈 摘要：本文以发酵乳作为基础，其中添加一定浓度的以大肠杆菌为典型菌的大肠菌群，用以研究大肠杆菌在发酵乳中的生长情况。 关键词：大肠杆菌发酵型酸牛奶生长情况 一引言： 发酵型酸牛奶大致可以分为三个品类：第一类是满足营养需求的基础酸奶；第二类是满足美味休闲的大果粒、谷物酸奶；第三类是健康功能酸奶，如通畅、免疫、儿童成长等。其中基础酸奶的市场规模占60%以上，果粒（谷物）酸奶和功能性酸奶的市场规模相对较低。 因大肠杆菌对产品存在着污染隐患，现阶段没有相关文献说明大肠杆菌在发酵型酸牛奶中生长繁殖情况，为此，本文就大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长情况进行了评述。 二术语和定义： 1.大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.发酵乳fermented milk：以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH 值降低的产品。 3.大肠杆菌：广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在4 4.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP实验、柠檬酸盐）生化实验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 三设备及试剂： 1.温箱:36±1度 2.冰箱:2-5度 3.恒温水浴:46±1℃ 4.天平：感量0.01g 5.均质器 6.振荡器 7.无菌培养皿:直径为90mm 8.无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度) 9.无菌锥形瓶:容量为500ml 10.移液器：20-200ul 培养基和试剂: 1.结晶紫中性红胆盐琼脂 2.煌绿乳糖胆盐肉汤 3.无菌生理盐水 4.无菌1mol/lNaOH和1mol/lHCL 四实验方法 1 收集发酵型酸牛奶，以大肠杆菌作为大肠菌群的典型菌落，其中添加10ml的复溶大肠杆菌(菌种编号为CCTCC AB91112)于样品中；
无菌培养基灌装试验验证方案及报告
无菌培养基灌装试验 验证方案 编号：VMP-XZGY-YZFA-001 ****药业有限公司
目录 1 概述 (1) 2 验证目的 (1) 3 验证范围及要求 (1) 4 验证小组成员及职责 (2) 4.1 验证小组成员 (2) 4.2 相关职责 (2) 5 验证前提条件 (2) 5.1 厂房和空调系统验证情况检查 (2) 5.2 设备和公用系统确认情况检查 (2) 5.3人员和物料情况检查 (3) 5.4检验仪器确认情况检查 (3) 5.5环境监测结果检查 (3) 6 验证标准 (3) 7 培养基适用性检查 (4) 7.1无菌性检查 (4) 7.2灵敏度检查 (4) 8 验证内容 (4) 8.1 取样及检测 (4) 8.2 验证程序 (7) 9 验证偏差和变更 (8) 10 再确认周期 (8) 11 确认结果评定及结论 (8)
共9页第1页 名称：无菌培养基灌装试验 验证方案 编号VMP-XZGY-YZFA-001版本号00 替代版本号—— 制定人审核人批准人 制定日期审核日期批准日期 制定部门生产部印数1份执行日期 颁发部门质量部存档部门质量部 分发部门生产部、质量部 变更记载： 版本号批准日期执行日期 变更历史及原因： 1、概述： 无菌培养基灌装试验是指由掌握了无菌操作的人员在一个有控制的环境中将培养基按工艺配制，并经除菌过滤后灌装于灭菌的容器中，并在适当条件下培养，确认没有菌生长，以证明无菌生产工艺的可靠性的过程。本试验是在与无菌灌装生产过程有关的其他验证合格后，且操作人员熟练掌握了岗位操作规程后进行的。培养基灌装作为无菌灌装的模拟实验，可以直观、方便、准确地反映出无菌灌装过程的污染情况及问题。 2 、验证目的 通过无菌培养基灌装试验证明灌装用的安瓿瓶、过滤器、灌注器等的染菌率是否达到规定的合格标准，确认小容量注射剂车间的洁净环境及进行无菌灌装过程中所采用的各种防止微生物污染的方法和规程的可行性，从而为保证所生产产品的无菌性提供依据。 3、验证范围及要求 本验证方案适用于新建或生产工艺进行过重大更改后的非最终灭菌小容量注射液的无菌灌装过程的验证。必须经连续三批合格的培养基灌装试验后方可证明被验证工艺的可靠性。不同批次的模拟灌装应在同一条生产线不同的工作日内进行。如实际生产中有不同的班次，则应对实际生产操作的每个班次进行培养基灌装试验，每班次连续进行3次合格试验。
大肠杆菌感受态
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。本实验室一般用TSS 法制备感受态。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外
无菌工艺验证指导原则
无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂） （征求意见稿） 国家食品药品监督管理总局 食品药品审核查验中心
二〇一六年十月 目录 1.目的 (1) 2.定义 (1) 3.范围 (1) 4.原则 (2) 5.无菌制剂生产工艺及模拟范围 (2) 6.模拟试验方案的设计及实施过程要求 (3) 6.1. 无菌工艺模拟试验的前提条件 (3) 6.2.基于风险的方案设计 (4) 6.3.模拟介质的选择与评价 (4) 6.4.灌装数量及模拟持续时间 (8) 6.5.容器装量 (9) 6.6. 模拟试验方法的选择 (9) 6.7. 最差条件的选择 (10) 6.8.干预 (12) 6.9.容器规格 (13) 6.10.培养与观察 (14) 6.11. 计数与数量平衡 (15) 6.12. 环境（包括人员）监控 (15) 6.13. 人员因素 (16) 6.14. 不同剂型应考虑的特殊因素 (16) 6.15. 方案的实施 (19) 7.可接受标准与结果评价 (20)
8.污染调查及纠正措施 (21) 9.模拟试验的周期与再验证 (21) 10.无菌工艺模拟试验的局限性 (212) 11.术语 (23) 12. 参考文献 (24)
无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂） 1.目的 为指导和规范无菌制剂生产企业开展无菌工艺模拟试验，充分评价无菌制剂产品生产过程的无菌保障水平，确保无菌制剂的安全性，依据《药品生产质量管理规范》（2010版）及附录，制定本指南。 2.定义 本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或其他介质，模拟制剂生产中无菌操作的全过程，评价该工艺无菌保障水平的一系列活动。 3.范围 3.1.本指南涵盖了无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的相应要求、试验的基本流程等内容，适用于无菌制剂的无菌工艺验证。 3.2.本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相 关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，进一步提高无菌制剂的无菌保障水平。 4.原则 在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，
大肠杆菌的发病原因
大肠杆菌的发病原因 鸡大肠杆菌病是由某些致病性血清型大肠埃希氏杆菌引起的鸡的不同类型疾病的总称。发病原因有以下几点: 1、抗菌药物正的不确使用 用户往往把使用药物当作控制大肠杆菌的主要手段，但药敏试验普及率低用药盲目性大，且在实际生产中有时用药不合理，如随意加大剂量或低剂量长时间使用，投药途径不当，不注意轮换用药造成大肠杆菌产生耐药性，导致药效下降甚至无效，药物控制难度增大。另外药物的滥用造成机体内微生物菌群的失调，也是大肠杆菌病一个常见的诱发因素。 2、免疫抑制性疾病影响 我国家禽免疫抑制性疾病感染非常普遍，免疫抑制性疾病会造成机体整个防御系统体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫、局部免疫受损，导致免疫抑制或低下增加了对大肠杆菌的易感性。 3、种鸡群的净化水平低 导致鸡传染性贫血病毒亚群禽骨髓性白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒和呼肠孤病毒免疫抑制性疾病，经种蛋垂直传播给雏鸡。
4、传染性法氏囊病病毒 感染或使用毒力偏强的传染性法氏囊病疫苗，造成法氏囊的损伤淋巴细胞减少，分化成熟受阻，导致免疫抑制。 5、使用由非SPF鸡胚生产的活疫苗 也可能导致马立克氏病毒、鸡传染性贫血病毒，亚群禽骨髓性白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒和呼肠孤病毒等免疫抑制性疾病的感染。 6、我国除三黄鸡以外的肉鸡群。 均不使用马立克疫苗，使我国大多数肉鸡群都存在由强毒马立克病毒感染造成的免疫抑制。 7、血清型众多，不同地区存在不同的优势血清群 大肠杆菌抗原结构复杂，由菌体抗原、荚膜抗原和鞭毛抗原三部分组成。目前已知抗原有种，而这些抗原可组合成大量抗原性不同的血清型。造成国内不同地区都有其独立的优势血清群，使在同一地区不同养殖场血清型相差也较大甚至在同一鸡场同一鸡群也可以存在多个血清型。 由于不同血清型之间的抗原交叉保护力较弱，所以不可能制备一种能够覆盖所有血清型的超广谱疫苗。而且大肠杆菌的免疫原性不强，因此即使是菌苗质量良好，血清型对应的灭活菌苗在生产中实际应用时，免疫效果也并不十分理想。
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，p H偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当
更衣程序确认方案
验证项目申请表
验证项目计划书
验证方案审批表
个人更衣程序检验验证方案 目录 1 引言 1.1 验证小组成员及责任 1.2 概述 1.3 验证目的 1.4 相关文件 2 验证内容 2.1 原理 2.2 执行的清洁程序 2.3 确认取样位置 2.4 取样条件 2.6 取样方法 2.7 有效期确认 3 异常情况处理程序 4 验证结果评定与结论 5 附件 6 再验证
1.引言 1.1验证小组成员及责任； 验证小组成员 责任 验证小组组长-负责验证方案起草，验证方案实施全过程的组织和写出验证报告。 验证小组组员-负责验证方案实施过程的具体工作，并填写验证记录。 1.2概述 根据GMP要求，在人员进入洁净区前，应对人员进行微生物和更衣程序的培训以及监测，为正确评估更衣程序的效果，需定期对直接接触药品的人员进行更衣程序的检测。 1.3验证目的 更衣程序的人员验证是指采用化学试验等手段来证明人员按规定的更衣程序更衣后，洁服上无可见残留物，微生物限度符合规定的限度标准要求，消除了生产产品受更衣过程中人员所带来污染的风险，从而给患者提供安全、有效的药品。 为达到上述验证目的，特制定本验证方案，人员更衣后进行更衣程序
验证。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书（附件1），报验证委员会批准。 1.4相关文件： 相关文件 2.验证内容 2.1原理：试验物料：接触碟 该验证方法选择人员更衣后，用接触碟法洁服表面取样，对取样接触碟样品进行微生物检验，将所得结果与可接受限度比较，如微生物限度符合规定的限度标准要求，则可证实更衣程序的有效性和稳定性，也可证实人员通过了更衣程序的培训。 2.2执行清洁程序：执行《进入洁净区人员更衣程序操作规程》，《棉球擦拭法标准操作规程》 2.3取样位置： 每次挑战性实验用Rodac直接接触法取样，取样点如下： ——每个手套（5只手指）； ——胸口处（在拉链中心至少有1点）； ——口罩： ——帽兜额头处；
大肠杆菌电转化
大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法 实验步骤： 1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37℃下过夜培养。 2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。 3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。 4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。 5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。 6、细胞在4℃5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存一两天）。 7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。 9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。 10、离心，弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。 11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。 12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80℃保存。 转化方法: 1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。
2、添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。 3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。 4、加载P1000，准备好300μl LB 或2xYT 。 5、对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。 6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。 7、37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。 8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。
培养基模拟灌装无菌生产工艺验证方案
培养基模拟灌装无菌生产工艺验证方案 培养基模拟灌装无菌生产工艺验证方案 目录 1 概述 2 验证目的 3 适用范围验证小组成员与职责4 文件资料及培训确认5 编制依据6 验证计划7 风险评估分析8 9 验证内容 10验证结果的分析与评价 11验证周期 页 28共页 1 第 培养基模拟灌装无菌生产工艺验证方案
页 28共页 2 第 培养基模拟灌装无菌生产工艺验证方案
页 28共页 3 第 培养基模拟灌装无菌生产工艺验证方案 1、概述 1.1我公司小容量注射剂车间2号生产线，按GMP2010版及其附录要求进行设计，是专用于小容量注射剂非最终灭菌产品生产使用。维生素C注射液（5ml:0.5g）因无法进行F≥0-6，但处方可以通过微生物滞留过滤器过滤，故采用除≤108分钟湿热灭菌，以达到SAL菌过滤和无菌工艺相结合的灭菌方法。 1.2培养基灌装验证是用和实际生产工艺相同的条件与操作方法（包括生产环境），向安瓿内灌装经除菌过滤的培养基，然后将此模拟制品在适当条件下培养，以确认工艺过程的可靠性。对设备、环境以及人员操作的一种系统验证，是判断无菌保证水平的关键手段。在正式生产前必须按维生素C注射液（5ml:0.5g）生产工艺进行培养基模拟灌装验证。 1.3验证次数 按2010版GMP附录1要求,因该生产线为新建设施，本次为规格为5ml培养基模拟灌装试验首次验证，故需进行连续三个批次的验证活动。 2、验证目的 2.1证明无菌生产区的设计及其设备布局，环境及卫生状态、人员无菌操作等各方面因素均能保证产品的无菌性。 2.2确定生产最差条件下仍能保证产品的无菌性。 2.3通过培养基模拟灌装试验确保生产符合现行GMP法规要求。 3、验证范围 本验证方案适用于小容量注射剂车间无菌灌装生产线（二线）正式投入使用前培养基模拟灌装试验的验证。 4、验证小组成员与职责 页 28共页 4 第 培养基模拟灌装无菌生产工
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6个月 。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法 ，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5× 106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高 100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素