分子生物

1.基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽

2.基因诊断依据：

①DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；

②基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。

3.基因诊断的特点：高特异性、高灵敏性、早期诊断性、

应用广泛性

4.基因诊断中常用的分子生物学技术：

?核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）

?聚合酶链式反应(PCR)

?单链构象多态性（SSCP）：DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链

后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来

?限制性片段长度多态性（RFLP）：由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位

点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。

?DNA序列测定（DNA sequencing）

?生物芯片（biochips）

?Western免疫印迹（Western blotting）

?免疫组织化学诊断

5.核酸分子杂交

概念：以DNA的变性、复性为理论基础，指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程

原理：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)

6.核酸分子杂交分类：Southern 印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交、反向斑点杂交、原位分子杂交、固相夹心杂交法

7.基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。

8.基因治疗的策略：

（一）基因置换：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。

基因同源重组技术又称为基因打靶:基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。

基因打靶原理:首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能

（二）基因添加：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

（三）基因干预:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而

使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

（四）自杀基因治疗：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的

药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞

的目的。

（五）基因免疫治疗: 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿

瘤微环境中的抗癌免疫反应。

9.基因治疗的技术应用：

(一)遗传病基因治疗

(二)恶性肿瘤基因治疗研究: 基因干预技术、自杀基因治疗

、肿瘤的免疫基因治疗、提高化疗效果的辅助基因治疗：

药物增敏基因治疗；耐药基因治疗

（三）病毒性疾病的基因治疗研究：调节机体免疫应答、

抗病毒复制

10.基因表达分析分为：

封闭性系统研究方法:例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法，其应用范围

仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。

开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。

11.检测mRNA常用的实验方法及原理：

（一）基于杂交原理的方法可检测mRNA表达水平

1．Northern印迹：既可分析mRNA表达又可验证cDNA新序列，是一种基于RNA-DNA 杂交原理建立的一种RNA分析技术

2.核糖核酸酶保护实验：可用于mRNA定量和RNA剪接分析，是一种基于杂交原理分析

mRNA的方法，既可对mRNA进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏度和特异性都很高。

3.原位杂交：①可对mRNA进行区域定位②是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技

术，可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同时也可作为定量分析的补充。

③通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够

特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。④虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。

（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法

1．反转录PCR（RT-PCR）：可用于mRNA的半定量分析。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析

2．实时定量PCR(RQ-PCR):常用于mRNA的定量分析是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。

12.通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征实验方法与原理：

（一）采用特异抗体经Western印迹可直接测定基因编码多肽：Western印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记

物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋

白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对

细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。

（二）酶联免疫吸附分析：是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。

该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同——顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一

抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底

物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。

（三）免疫组化实验可对组织/细胞表达的蛋白质进行原位检测：免疫组织化学（immunohistochemistry）与免疫细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，

都是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位

检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光

标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。

（四）流式细胞术用于分析表达特异蛋白质的阳性细胞：流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗

体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定

蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。

13.高通量检测技术

高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采用微板作为分子载体，制作集成“芯片”，以自动化操作系统进行分子杂交的试验过程

14.高通量检测技术成为基因表达研究的有力工具

（一）基因芯片和高通量测序技术可在基因水平高通量地分析基因表达

1.基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法

基因芯片（gene chip）又称DNA微阵列(DNA microarray)、DNA芯片（DNA chip）, 是将大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、microRNA等) 集

成在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细

胞或组织的基因信息。

2. 高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法

（二）蛋白质芯片和双向电泳可在蛋白质水平高通量地分析基因表达

1．蛋白质芯片；是一种对蛋白质的表达和功能进行高通量分析的技术。

是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用。

根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为

1. 蛋白质检测芯片

2. 蛋白质功能芯片两大类

蛋白质检测芯片包括:

1.抗体芯片

2.抗原芯片

3.配体芯片

4.碳水化合物芯片等

2．双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定

原理: 根据蛋白质分子的两个属性——等电点和分子质量——将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。

15.利用生物信息学方法进行基因功能注释

(一）通过序列比对预测基因功能

（二）利用生物信息学方法分析基因芯片数据

（三）通过生物信息学方法分析蛋白质结构来预测蛋白质功能

16.利用生物网络全面系统地了解基因的功能

（一）利用生物网络研究基因调控

（二）利用生物网络研究信号转导

（三）利用生物网络研究代谢途径

（四）利用生物网络研究蛋白质相互作用

17.基因的生物学功能鉴定技术

一、采用功能获得策略鉴定基因的功能

基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。常用的方法有转基因和基因敲入技术等。

（一）用转基因技术获得基因功能

转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，再将受精卵或胚胎干细胞植入受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代

（二）基因敲入可以实现基因的定向插入

基因敲入( gene knock-in)是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因, 或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基因敲入，可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。

二、采用功能失活策略鉴定基因的功能

基因功能研究的功能失活策略是通过观察，细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。常用的方法主要有基因敲除、基因沉默。

（一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失

基因敲除技术是利用细胞染色体DNA可以与导入的外源DNA在相同序列的区域发生同源重组的现象，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯和个体。

（二）基因沉默可以使基因的功能部分缺失

基因沉默(gene silencing)是指由外源基因导入引起的生物体内的特定基因不表达或表达受抑制的现象。

目前最常用的基因沉默技术包括：

1.RNA干涉（RNA interference，RNAi）

2.反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON）

RNAi是指双链RNA介导同源序列的mRNA特异性降解，导致的转录后基因沉默

反义寡核苷酸是指能与mRNA互补配对的RNA分子，长度一般为20nt左右

三、随机突变筛选策略

18.基因打靶的原理和基本步骤

1.首先, 从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞, 然后利用细胞内的染色体DNA可以

与导入细胞的外源DNA，在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负筛选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施“打靶”；

2.之后将“中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚( 受精卵分裂至8个细胞左右即为囊

胚, 此时受精卵只分裂不分化) , 移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层, 与囊胚一起分化发育成相应的组织和器官；

3. 最后诞生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶的胚胎干细胞保持分化的全能

性, 因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞, 使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传。

19.细胞在转导信号过程中所采用的基本方式

①改变细胞内各种信号转导分子的构象

②改变信号转导分子的细胞内定位

③促进各种信号转导分子复合物的形成或解聚

④改变小分子信使的细胞内浓度或分布等

20.受体：(receptor)是信息分子的接收分子，化学本质是细胞表面或细胞内的蛋白质分子。

?受体的作用：

?识别外源信号分子，即配体（ligand）；

?转换配体信号，使之成为细胞内分子可识别的信号，并传递至其他分子引起细胞应答。

21.受体按照其在细胞内的位置分为:

细胞表面受体：接收的是不能进入细胞的水溶性化学信号分子和其他细胞表面的信号分子，如生长因子、细胞因子、水溶性激素分子、黏附分子等。

细胞内受体：接收的信号是可以直接通过脂双层胞膜进入细胞的脂溶性化学信号分子，如类固醇激素、甲状腺素、维甲酸等

22.细胞膜表面受体主要有三大类：

离子通道型膜受体

G-蛋白偶联的七跨膜受体

酶依赖的单跨膜受体

23.G蛋白

?鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide binding protein，G protein）简称G蛋白，亦称GTP结合蛋白，是一类信号转导分子，在各种细胞信号转导途径中转导信号给不同的效应蛋白。

?G蛋白结合的核苷酸为GTP时为活化形式，作用于下游分子使相应信号途径开放；

当结合的GTP水解为GDP时则回到非活化状态，使信号途径关闭。

?G蛋白主要有两大类：

异源三聚体G蛋白：与7次跨膜受体结合，以α亚基（Gα）和β、γ亚基(Gβγ)三聚体的形式存在于细胞质膜内侧

?低分子量G蛋白（21kD）

24.小分子细胞内信使的特点

①在完整细胞中，该分子的浓度或分布在外源信号的作用下发生迅速改变；

②该分子类似物可模拟外源信号的作用；

③阻断该分子的变化可阻断细胞对外源信号的反应；

④在细胞内有确定的靶分子；

⑤可作为别位效应剂作用于靶分子；

⑥不应位于能量代谢途径的中心。

25. 生物利用蛋白质复合物系统完成信号转导功能的优势是

①复合体中信号转导分子之间直接接触，可有效、迅速传递信号；

②多个蛋白质形成的复合物可产生放大效应；

③可以根据细胞外信号强弱形成有差别的信号复合体，输出多种信号，产生多方面的协同效果；

④信号转导复合体增加了信号转导反应的复杂性、多样性和调控层次，使调节更精细、更准确

26.细胞信号转导的规律和特征

?在细胞信号转导过程中，信号迅速发生并迅速终止，反应过程具有级联放大效应。

?细胞内的信号转导系统具有通用性；细胞内一些信号转导分子和信号转导通路需要为不同的受体所共用，但是各种细胞又有其特殊的方式严格控制信号转导的特异性流向。

?影响细胞可以对外源信息做出特异性反应的因素包括：细胞间信息分子的浓度、相应受体的分布与含量、细胞内信号转导分子的种类和含量等。

?不同组织可以以不同的方式使用同一信号转导分子，但是相互作用的分子可以不同，蛋白激酶的底物也可能不一样，从而导致输出信号的差别。

27.细胞内存在复杂的控制基因表达的信号转导网络

（一）信号转导通路在转录水平调控基因表达

（二）信号转导网络在转录后水平调控基因表达

（三）细胞内有几种（形式）连接信号转导通路与基因表达的重要开关

（四）生物大分子相互作用是信号转导网络控制基因表达的物质基础

28.蛋白相互作用结构域有如下特点

①一个信号分子可以含有两种以上的蛋白质相互作用结构域，因此可以同时与两种以上的其他信号分子结合；

②同一类蛋白质相互作用结构域可存在于多种不同的分子中。这些结合结构域的一级结构不同，因此对所结合的信号分子具有选择性，这是信号分子相互作用特异性的基础；

③这些结构域本身均为非催化结构域。

29.核受体：细胞内的受体蛋白有的位于细胞核内，有的位于细胞质中，但是大多为DNA结合蛋白，具有转录因子活性，直接调节细胞的基因表达，因此被称为核受体（nuclear receptors，NR）30.配体类型或结构域是核受体超家族分类的依据

31.细胞膜受体依据结构和信号转导机制的差异可以分为3种类型

?离子通道受体

?G-蛋白偶联受体

?单次跨膜受体

32.三种膜受体的特点

33. G蛋白偶联受体（GPCR）得名于这类受体的细胞内部分总是与异源三聚体G蛋白结合，受体信号转导的第一步反应都是活化G蛋白。

34.G蛋白的活化启动信号转导

信号转导途径的基本模式

①配体与受体结合；

②受体活G蛋白；

③ G蛋白激活或抑制效应分子；

④效应分子改变第二信使的含量与分布；

⑤第二信使作用于相应的靶分子，使之构象改变，从而改变细胞的代谢过程及基因表达等。GPCR受体信号转导的第一步反应都是活化G蛋白

35．单跨膜（酶偶联）受体介导信号的终效应分子许多是转录调节因子

?酶偶联受体指那些自身具有酶活性，或者自身没有酶活性，但与酶分子结合存在的一类受体。

?这些受体大多为只有1个跨膜区段的糖蛋白，亦称为单跨膜受体。

?酶偶联受体种类繁多，但是以具有PTK活性和与PTK偶联的受体居多。

?酶偶联受体大部分是生长因子和细胞因子的受体，它们所介导的信号转导通路主要是那些调节蛋白质的功能和表达水平、调节细胞增殖和分化

36.常见的酶偶联受体

◆受体型蛋白酪氨酸激酶

（receptors tyrosine kinases，RTKs）

◆蛋白酪氨酸激酶偶联受体

（tyrosine kinase-coupled receptors，TKCRs）

◆受体型蛋白酪氨酸磷酸酶

（receptors tyrosine phosphatases，RTPs）

◆受体型蛋白丝/苏氨酸激酶

（receptors serine/threonine kinase，RSTK）

◆受体型鸟苷酸环化酶

（receptors guanylate cyclases，RGCs）

37PTK偶联受体介导的信号转导途径的基本模式

①结合配体后受体形成二聚体或寡聚体；

②第一个蛋白激酶被激活。对于具有蛋白激酶活性的受体来说，此步骤是激活受体胞内结构域的蛋白激酶活性；对于没有蛋白激酶活性的受体来说，此步骤是受体通过蛋白质-蛋白质相互作用激活与它紧密偶联的蛋白激酶；

③通过蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白激酶的磷酸化修饰激活下游信号转导分子，通常是继续活化下游的一些蛋白激酶；

④蛋白激酶通过磷酸化修饰激活代谢途径中的关键酶、反式作用因子等，影响代谢途径、基因表达、细胞运动、细胞增殖等。

?38.启动子（promoter）：是一段能被蛋白质识别的、参与特定基因转录调控的DNA序列。

?共有序列和启动子所处的位置是研究启动子的重要线索

39.启动子的结构分析

?利用PCR技术克隆启动子

?利用核酸-蛋白质相互作用方法研究启动子：足迹法（酶足迹法，化学足迹法）、电泳迁移率变动实验（EMSA）、染色体免疫沉淀（ChIP）

?生物信息学预测启动子

40.启动子的结构特征

典型启动子

核心启动子：一般在TSS上游-35区域以内

近端启动子：一般涉及TSS上游几百个碱基

远端启动子：一般涉及TSS上游几千个碱基

含有增强子或沉默子

41.报告基因

是研究者们为了制造一种可在细胞培养条件下或动植物体内作为筛选标志的易检测信号，通过分子生物学操作将发光蛋白或酶的编码基因附加到一个感兴趣基因上或插入基因调控序列下游，从而监测感兴趣基因的表达或分析基因调控序列的活性

42.报告基因的应用

?监测基因的转染效率

报告基因与目的基因分别插入各自启动子下游，实现报告基因的组成性表达模式

?监控目的基因的表达

报告基因与目的基因融合共同受控于一个启动子，报告基因的表达即代表目的基因的表达?研究启动子的活性

报告基因插入被研究启动子下游，通过观察报告基因的表达情况推测启动子活性

43.mRNA的选择性剪接 (alternative splicing)：

?是指基因外显子转录产物RNA以不同方式进行切割再连接的过程

?经剪接所产生的mRNA可以翻译成不同的蛋白质，从而导致一个基因可以编码一个以上蛋白质

44.PCR在基因诊断中的应用

?RT-PCR

?荧光定量PCR

?多重-PCR

?PCR-ASO

?AS-PCR

?PCR-SSCP

?PCR-RFLP

45.反转录病毒载体的特点

①反转录病毒包膜上env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。

②反转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。

③前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达

④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组反转录病毒载体）以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。

46. 腺病毒的优点

基因导入效率高，对人类安全；

宿主范围广

基因转导与细胞分裂无关

重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；

腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因

47.脂质体介导的基因转移技术

利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。

48.受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。

49.基因直接注射法的优点

?制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；

?排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；

?导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；

?基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降

50.反义RNA的优点

（l）安全性高

（2）反义RNA设计和制备方便

（3）具有剂量调节效应

（4）能直接作用于一些RNA病毒

51.RNA干扰现象

RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达

52.RNA干扰的机制

（1）小干扰性RNA（siRNA）

(2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断

53.印迹技术

利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术

54.探针技术

用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

55.PCR体系基本组成成分

?模板DNA

?特异性引物

?耐热DNA聚合酶

?dNTPs

?Mg2+

56.PCR技术的主要用途

（一）PCR技术分析基因及其产物

（二）PCR技术可以进行实时、定量分析

（三）PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的DNA序列

57.DNA芯片

在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)；亦被称作DNA微阵列(DNA microarray) 58.蛋白质芯片

是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。

蛋白质芯片作用原理：蛋白质分子间的亲和反应

59.常用蛋白质相互作用的研究技术

?酵母双杂交

?各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）

?荧光共振能量转换效应分析

?噬菌体显示系统筛选

60. 酵母单杂交技术

由J. Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一

种方法；通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因

61.克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。

62.重组DNA技术

又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因克隆（gene cloning) 技术，是指在体外利用酶学方法将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。

克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。因此，重组DNA技术又称为基因工程技术。

63. 重组DNA技术中常用的工具酶

?限制性核酸内切酶：识别特异序列，切割DNA

?DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接

?碱性磷酸酶：切除末端磷酸基

?反转录酶：合成cDNA；替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析

?末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶）：在3′羟基末端进行同聚物加尾

?DNA聚合酶Ⅰ：合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；DNA序列分析；填补3′末端

?DNA聚合酶I大片段：又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5→'3'聚合、3→'5'外切活性，而无5→'3'外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3'末端标记等?Taq DNA聚合酶：常用于PCR；产物的3′末端带有A，可用于T-A克隆

?多核苷酸激酶：催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针

64.同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端

65.同工异源酶：能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶

66.PCR的过程

?变性(Denaturing): 经加热使模板DNA 从 dsDNA 变成ssDNA

?退火(Annealing): 引物与模板DNA杂交

?延伸(Extension): DNA 合成

67.载体（vector）是为携带感兴趣的外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子

?按功能分：①克隆载体为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体②表达载体为使插入的外源DNA序列可转录和翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。

?按基本元件的来源不同：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体载体等

68.克隆载体特点：至少有一个复制起点（origin of replication, ori）、至少有一个选择性标志（selection marker）、有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）、应有较高的拷贝数

69常用克隆载体：

?质粒：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状

?噬菌体

?穿梭载体：人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增

70. 目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种

●Lac启动子（乳糖启动子）

●Trp启动子（色氨酸启动子）

●Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子）

●PL和PR启动子（λ噬菌体的左向和右向启动子）

●T7启动子

71.一个理想的病毒表达载体，通常应具备以下条件

①使用安全，对宿主细胞无毒副效应；

②能容纳较大的外源DNA片段且转染效率高；

③所产生的病毒效价高；

④外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达

⑤病毒的靶向性强；

⑥外源基因的表达具有可控性。

72.黏粒（cosmid）：又称粘性质粒或装配型质粒，是由λ DNA的cos区与质粒重新构建而成

的杂合双链环状DNA载体。

?黏粒的特点：

①含有质粒的抗性标记基因及复制起点和多克隆位点，可按质粒的方式在宿主菌中进行自主复

制；

②带有λ噬菌体DNA的cos序列，可进行体外包装；

③黏粒本身较小，但能容纳高达50 kb的外源DNA片段；

④非重组体黏粒很小，故不能在体外进行包装，所以有利于后续阳性克隆的筛选；

⑤黏粒因缺乏全部λ基因，不会产生噬斑，但在选择培养基平板上形成菌落，这一点也与质粒

载体一致

73.细菌的感受态

细菌易于接纳外源物质的一种天然状态，在细菌的对数生长前期，为了分裂增殖的需要，细菌胞膜上会表达一些特殊的蛋白质，利于外源物质穿透胞膜，帮助细菌吸收外源营养物质。基因工程操作中，通过物理化学的方法也可使细菌处于感受态。处于该状态的细菌被称为感受态细胞。

74. 外源基因在原核表达体系中表达的必要条件：正常的转录与翻译

（1）将外源基因置于强启动子和SD顺序（核糖体结合位点）控制下

（2）删除内含子和5′非编码区

（3）维持正确开放阅读框架（ORF）

（4）mRNA稳定且可被有效翻译和折叠，形成的蛋白质不被降解

75. 影响原核表达体系有效表达外源基因的因素

? 1. 目的基因的组成序列是决定外源基因表达的关键因素

? 2. 表达载体是决定外源基因表达的另一关键因素

? 3. 受体菌能明显影响目的基因的表达

? 4. 目的蛋白的存在形式也能明显影响目的基因的表达效率

76. 提高原核表达水平及目的蛋白溶解性的策略

①更换启动子

②改变诱导条件

③使用偏嗜性密码子

④使用蛋白酶缺陷的宿主菌

⑤进行分泌表达

⑥采用融合表达

⑦与分子伴侣或折叠酶共表达

⑧调整SD序列与起始密码子之间的距离，使mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子正

好进入核糖体的P位

77.原核表达体系有以下优势：

①宿主菌遗传背景和生理特性清楚，有多种工程菌株可供选择

②原核细胞繁殖能力强，操作简便、省时

③大规模发酵成本低，生产潜力大

④表达水平一般较真核系统高，且下游工艺简单、易于控制

78.原核表达系统的主要缺点：

①原核细胞缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统（如糖基化、磷酸化等），因此，针对这些需经修饰的蛋白，无法用原核表达体系获得有活性的产物

②目的基因不能是含有内含子的DNA

③细菌本身产生的内毒素等热原不易去除干净，为产品纯化增加了难度

④蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性较困难，容易出现肽链的错误折叠等问题

79. 包涵体及其特点

?包涵体（inclusion body）：存在大肠杆菌胞浆中的由不溶性蛋白质聚集折叠形成的晶状结构物

?包涵体的特点;

?大小0.5~1.0μm

?比重在1.2左右

?内含复杂成分：错误折叠的表达蛋白质， RNA聚合酶的四个亚基，外膜蛋白，16sRNA，质粒DNA，脂类，糖类等

?不溶于水，加入强的蛋白质变性剂方可溶解，例如6~8mol/L盐酸胍，9~10mol/L尿素80. 与原核表达体系相比，真核表达体系（特别是以哺乳类细胞作为宿主细胞的表达体系）有如下优点

①目的基因既可是基因组DNA，也可是cDNA，转录后能进行加工

②目的基因的表达可受到更严格地调控，能对所表达的蛋白质进行加工修饰，确保二硫

键的精确形成，能正确进行糖基化、磷酸化、寡聚体的形成等加工

③可使蛋白进行分泌表达，从而有利于蛋白的分离纯化

④所表达的目的蛋白不易被降解，且对宿主细胞的影响较小

81.与原核表达体系相比，真核表达体系也存在诸多不足：

①宿主细胞繁殖速度慢，培养条件要求高

②蛋白表达水平低

③整个操作过程复杂、费时、成本高