脱细胞骨软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞修复羊骨软骨缺损的研究

软骨修复

软骨再生修复材料 刘可远 3090102976 所有查阅文献中都提及，软骨损伤的修复是一个医学难题。我也想起今 年暑假，我的朋友不慎造成了半月板损伤，至今仍在恢复期。 为何软骨组织难以自身修复？综合多篇文献主要有以下三个原因： ①软骨组织内无血运，软骨细胞缺乏迁徙能力； ②软骨细胞增殖能力差，软骨细胞仅占软骨的0.01~0.1%,在正常情况下只 有0.03%的软骨细胞可以进行有丝分裂； ③软骨内无滋养血管，而关滑液中营养缺乏。 而在软骨支架材料出现之前，人们也想了诸多办法，但效果欠佳。自体软 骨来源有限，且容易造成供区缺损；异体软骨被广泛应用，但可引起免疫排 斥反应，或引起交叉感染；骨膜移植则存在效果不稳定的缺陷。 在市场需求方面，关节软骨是唯一的自我修复能力有限的组织，软骨损伤 又很常见，每年大约有100万患者接受治疗，25万人接受关节成形术。 综合上述原因，天然或人工合成的软骨再生修复材料应运而生。 高老师向我们介绍过组织工程的三要素，即细胞，支架，以及组织工程技术。之前说了软骨细胞的有丝分裂概率很低，增值慢，因此人们找到了一种 细胞名为间充质干细胞（MSCs），几乎所有的成人组织类型都发现了MSCs， 作为对关节软骨缺损的响应，内源性的SMSCs 细胞具有向软骨缺损部位迁移、聚集和软骨修复的潜在能力。这样，问题就只剩下支架材料本身了。 软骨再生修复材料不仅提供软骨细胞生长依附的空间架构、力学需求和几 何形状，更重要的是它作为细胞外基质之一，可以协调生物活性因子和细胞 之间的相互作用，潜在地影响细胞表面因子受体的表达和细胞的分化。理想 的支架材料应具有以下特点： ①有良好的组织相容性，无毒，无致畸性； ②有三维立体结构； ③生物可降解性； ④良好的细胞界面； ⑤具有可塑性和一定的机械强度。 目前正在研究的软骨再生修复材料按其来源可以分为天然生物材料和人工合 成材料，下面分两个方面分别进行介绍： 天然生物材料： 主要包括胶原、明胶，纤维蛋白、壳聚糖、琼脂、糖胺多糖、藻酸盐、 蚕丝蛋白、几丁质、松质骨骨基质、脱细胞基质等。天然生物支架材料来源 于生物体本身，具有组织相容性较好，毒性较小，易降解，且降解产物易被

研究方向干细胞成骨、成软骨、成肌腱定向分化调控;

研究方向：1. 干细胞成骨、成软骨、成肌腱定向分化调控； 2．骨关节退变机制及干预策略； 3．骨关节再生修复治疗。 个人简介：张晓玲，女，博士，研究员，博士生导师。2003 年于北京大学医学部获运动医学博士学位。现为国际华人骨 研学会（ICMRS）理事及女性委员会（Women’s Committee） 主席，该学会是目前国际上最大的华人肌骨骼研究学术组织。并担任中华医学会骨科分会基础学组委员、中国医师协会骨科医师分会委员、Journal of Orthopaedic Translation国际编委会委员、Chinese Journal of Clinicians 编委、中国组织工程研究与临床康复杂志编委、中华关节外科杂志通信编委；Molecular Therapy等多种国内外专业杂志审稿人。研究结果多次在国际会议上做口头报告并获奖励，包括国际运动医学大会最优秀青年学者论文奖（2006年）；第三届国际COA国际学术大会优秀论文二等奖（2008年）；?明治乳业生命科学奖（2010）；上海市研究生优秀成果（2011导师）；第七届COA国际学术大会优秀论文一等奖（2012年）。入选多个人才计划：上海交通大学医学院百人计划（2007年），上海市科技启明星人才计划（2007年）；上海市教委曙光人才计划（2010年）；上海市科委启明星人才跟踪计划（2011年）。上海交通大学晨星A计划（2012年）。研究发现C/EBPα信号在MSCs向成骨细胞或脂肪细胞的分化选择中起关键作用，发现miR-146a在软骨细胞中通过smad4调控VEGF表达，从而调控软骨的退变与血管化；是极有潜力的关节炎治疗靶标。建立并获得了干细胞基因输送生物学示踪专利与知识产权，实现了基因转染的生物学过程可视化。并研发了新型非病毒基因输送体系PEI-Bu，将IL-1Ra治疗基因有效地转移入膝关节，有效缓解骨关节炎进程。在国家干细胞先导专项的支持下，为富集干细胞技术的临床应用提供可靠的细胞分化生物学、免疫学检测及分析技术平台，与临床医生合作应用富集干细胞技术临床治疗骨缺损、软骨缺损病例，实现临床治疗骨缺损、软骨缺损病例超过100例，已进入临床验证。目前已独立承担、完成了国家自然科学青年、面上及国际合作等21项科研项目，共发表SCI论文56篇，其中第一作者和通讯作者26篇，包括JBMR，Biomaterials，Cell Death Dis，J Control Release等领域权威期刊，论文他引908次，以第一申请人申请国家发明专利8项。H-Index 16。

骨髓间充质干细胞研究进展(一)

骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一

间充质干细胞分离与培养

文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提　要:目的　摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法　采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果　以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论　建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective　T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods　C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults　The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion　The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1　材料与方法 1.1　骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2　不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3　不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4　比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5　培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第　三　军　医　大　学　学　报 ACT A　AC ADE MI AE　ME DICI NAE　MI LIT ARIS　TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001

关于干细胞关节腔内注射修复软骨损伤的研究与进展

关于干细胞关节腔内注射修复软骨损伤的研究与进展 发表时间：2014-07-14T15:31:35.843Z 来源：《中外健康文摘》2014年第6期供稿作者：李治1 毕平2 刘伟1 赵伟1 杨立枫1 [导读] 在再生医学领域中，骨和软骨组织损伤残疾修复以及治疗则是研究的重点。 李治1 毕平2 刘伟1 赵伟1 杨立枫1 (1沈阳医学院附属中心医院 110024;2沈阳医学院附属第二医院 110023) 【摘要】在人体中，关节软骨则是覆盖在关节表面上，其能够承受一定的压力，并减少摩擦，有效地维持关节的正常功能和运动[1]。对于成熟的关节软骨来说，其抵御疾病和损伤的能力较差，并且在发生关节软骨损伤之后则难以进行有效的修复，进而引起一系列的紊乱情况发生，使得患者受损的面积不断增加。如果不对患者进行及时的治疗，则会导致患者发展为骨关节炎(OA)[2]。OA给患者的生活带来极大的影响，并且还会给社会和家庭等带来一定的负担。对于膝关节OA症状来说，患者早期受损的组织为关节软骨，然而当患者发生软骨损伤时则会加速患者OA的发展。因此，在临床上对OA患者治疗主要是对患者进行关节软骨保护和修复。临床上，对软骨损伤患者采用干细胞关节腔内注射修复治疗，具有非常好的治疗效果。详细如下综述。 【关键词】干细胞关节腔内注射软骨损伤修复研究 【中图分类号】R683 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）06-0276-02 在再生医学领域中，骨和软骨组织损伤残疾修复以及治疗则是研究的重点。采用间充质干细胞，其具有软骨和向骨等间质组织来源细胞分化能力，同时还具有非常好的免疫调节效果[1]。所以临床上采用间充质干细胞用于软骨修复等具有十分高的临床应用价值。然而软骨损伤则是一种常见性的关节内损伤症状，目前可以采用手术方式治疗，但是则可能会导致患者发生关节软骨发生退行性病变等。近年来，采用间充质干细胞注射修复软骨损伤，同时对患者损伤小，并且能有效地促进患者软骨细胞的再生，现如下综述。 1 软骨损伤现状 关节软骨的细胞外基质(ECM)主要由水及胶原和蛋白多糖聚合体形成的大分子支架组成[2]。胶原形成组织形态及张力强度，水和蛋白多糖聚合体相互作用形成抗压强度、弹性，可能还有韧性[3]。关节表面的负荷引起关节软骨内ECM中的液体流动，从而吸收和分散软骨下骨负荷。当负荷逐渐增加时，液体流动使软骨变形而减少基质中大分子支架的负荷[4]。若负荷增加太快，液体不能及时流动使软骨变形，大分子支架将承受较大负荷，如关节表面的突然碰撞和研磨。当负荷足够大，超出软骨吸收和分散负荷的能力时，就会引起基质大分子支架碎裂，细胞受损[5]。在活体上，有意识或无意识的，缓慢或突然的运动传达到关节表面的力是不同的。缓慢运动时，肌肉收缩吸收了大部分能量并使关节稳定;突然的无意识的运动则使肌肉来不及收缩吸收能量并使关节稳定，关节表面会承受较大的力[6]。 在临床骨科中，因关节疾病和创伤而引起患者发生全层关节软骨缺损是一种常见性的疾病[7]。关节软骨主要是一种高分化组织，同时软骨细胞是其唯一细胞成分[8]。在临床上，软骨损伤修复则是一个十分困难的问题。因干细胞具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，组织相容性好，表型稳定等优点，将干细胞进行关节腔内注射，修复软骨损伤成为目前的研究热点。 2 关节腔内注射干细胞种类 干细胞可分为三种类型。一类是全能干细胞，来源于胚胎内细胞团细胞或早期胚胎原始生殖的胚胎生殖细胞。如胚胎干细胞[9-10]，可分化形成机体所有细胞类型。第二类是多能干细胞，可以产生两种以上不同类型的分化细胞。比如人胎盘来源间充质干细胞、人脐带间充质干细胞以及人羊膜间充质干细胞等，由于其取材简单，方便，不涉及伦理问题，是目前的研究热点，如徐友高研究发现，BMSCs关节腔内移植能有效治疗骨关节炎，可修复软骨损伤。第三类是专能干细胞，只能分化为单一类型的分化细胞，存在于成年组织中，如神经干细胞、肌肉干细胞、表皮干细胞和软骨细胞等。近年来，许多报道认为成体干细胞可以分化为不相关的细胞类型，提出成体干细胞的分化具有可塑性。 3 关节腔内注射干细胞结果 临床和基础科学研究表明人工基质、生长因子、软骨膜、骨膜、软骨细胞、间叶干细胞移植能刺激软骨、骨软骨缺损的关节软骨组织形成。而且大量研究表明，间充质干细胞直接注射到关节腔内后，可以迁移至损伤部位，直接参与组织修复，并且通过旁分泌途径诱导宿主的修补反应，替换损伤组织。但是，干细胞归巢的具体机制目前尚未完全明了，可能是由于损伤的软骨处会产生某些趋化因子，可促进干细胞的定向移动，如基质细胞衍生因子1、白细胞介素α、血小板转化生长因子、转化生长因子β和单核细胞趋化蛋白1等。目前间充质干细胞治疗软骨损伤的数据主要来源于动物实验，临床上间充质干细胞治疗软骨损伤仍处于临床实验阶段，方法是在注射间充质干细胞后一周及两周时再注射血小板溶解产物及地塞米松。实验前后MRI结果比较显示半月板的体积增大，患者主述疼痛减轻，膝关节活动范围增大。该试验证明了关节腔内注射间充质干细胞的治疗方法可能也使用于人类，然而间充质干细胞治疗人软骨损伤仍处于早期临床试验阶段，确切的治疗效果需要大规模随机临床实验的开展和更深入的研究。 4 展望 干细胞注射具有营养、抗炎及免疫抑制等作用。许多动物模型研究和临床研究显示，将干细胞直接注射至关节腔内治疗OA可明显修复关节软骨，并延缓OA进展。经基因修饰的干细胞注射入关节腔内可起到抗炎和抗基质降解作用，转导的干细胞在关节腔内可释放治疗蛋白并作用于软骨损失部位，为晚期OA治疗提供可能。然而，上述实验研究和临床应用研究中遇到的问题，尚需进一步研究解决。利用干细胞技术可能成为新的治疗膝关节软骨损伤方法，优点在于干细胞容易获取，来源广泛，自体干细胞不引起免疫排斥，并且可以定向移植于所需部位。如果此研究在人膝关节软骨损伤获得成功，将为软骨损伤的治疗提供一条新的思路。 鉴于干细胞修复关节软骨动物在体实验的成功，国外有学者进行了MSCs人体移植的实验。例如应用经皮移植来自于患者髂嵴的自体MSCs治疗退行性膝关节病变患者，患者接受治疗24周后，MRI检测到软骨和半月板生长，而且关节运动幅度增加，改进的VAS疼痛评分降低。另有研究将自体骨髓培养的MSCs体外扩增后，混合胶原凝胶，移植入膝关节软骨缺损处，并且自体骨膜覆盖，42周后在移植组创面为透明质酸软骨样组织覆盖。关节镜检查和组织学评分均优于对照组。对软骨损伤患者采用干细胞关节腔内注射修复治疗，有效地改善患者的症状，减轻患者的痛苦，有效地缓解患者的疼痛，并且发生的不良反应少，值得在临床上进行推广和应用。 综上所述，由于干细胞具有高增殖性以及多向分化潜能，容易取材，表型稳定，免疫源性低等优点，近期还发现有抗炎、营养、抗免疫的特性，使其成为治疗软骨损伤的研究热点。但如果将其广泛应用于临床仍还有许多问题亟待解决。比如种子细胞的选择和保存；新生

人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析

经验交流 文章编号１００６－８１４７（２０11）０4-0458-03 人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析 刘长乐1，李广平1，郑心田1，孟恒星2，邱录贵2，娄建石3 （1.天津医科大学第二医院心脏科，天津300211；2.中国协和医科大学血液病学研究所，天津300020；3.天津医科大学药理学教研室，天津300070） 关键词骨髓间充质干细胞；流式细胞术；培养模型中图分类号 Q813 文献标识码 B 骨髓（bone marrow ，BM ） 中包含有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)。MSCs 属混杂细胞群，其表面抗原标志尚未完全确定。MSCs 作为多能干细胞具有可塑性，有报道显示在细胞因子作用下可以在体外诱导分化为骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞和血管内皮细胞，并且参与体内组织新生、损伤修复 和重建[1]。本实验应用改进的密度梯度离心法、差异 贴壁法和酶消化法建立MSCs 的体外培养扩增模型，寻找高度特异性的表面抗原，以利于干细胞移植的广泛应用。1材料与方法 1.1材料（1）BM ：39岁男性健康志愿者5mL 。（2）仪器：FACScar 流式细胞仪（Beckman -Coulter ），倒置相差显微镜（OLYMPUS ），荧光显微镜（OLYM －PUS ） ，恒温培养箱（Forma Scientific ），高速低温离心胞系MHCC97-H 的增殖。骨髓间充质干细胞旁分泌物质或许通过分泌细胞因子影响肝癌细胞某一信号通路促进细胞增殖的。 AFP 是CBRH-7919肝癌细胞分泌的一种蛋白，本研究发现随着骨髓间充质干细胞旁分泌物质浓度的升高，AFP 也逐渐升高，表明骨髓间充质干细胞旁分泌物质也增强了7919肝癌细胞分泌AFP 的功能。 骨髓间充质干细胞促进肝癌细胞增殖的具体机制目前尚未明确，目前有以下几种学说：免疫抑制影响肿瘤基因的表达，分泌细胞因子以及参与肿瘤血管形成等[4-7]。邵志红等[5]发现大鼠骨髓间充质干细胞能通过影响Walker-256肝癌细胞VEGF 和nm23的表达,促进肝癌细胞的增殖。Li 等[6]发现人骨髓间充质干细胞是通过分泌细胞因子进而影响TGFβ信号通路促进肝癌细胞增殖的。尽管骨髓间充质干细胞对肝癌增殖的确切机制尚未明确，但有效地抑制骨髓间充质干细胞的促增殖作用具有重要的意义，其有可能成为新的抗癌靶点。笔者将继续研究骨髓间充质干细胞旁分泌物质促进肝癌细胞增殖的内在机制，为肝癌治疗带来新的希望。 参考文献： ［1］Lu YR,Yuan Y,Wang XJ,et al.The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo[J].Can-cer Biol Ther,2008,7(2):245 ［2］乔玲，赵铁军，山长亮，等.人间充质干细胞抑制肝癌细胞增殖 的作用及其基因表达谱分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2007，23(12):1037 ［3］陈双庆，王培军，李铭华，等.磁标记骨髓间充质干细胞对肝细 胞癌的抑制作用[J].临床放射学杂志，2009，28(10):1454 ［4］Djouad F,Plence P,Bony C,et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J].Blood，2003,102(10):3837 ［5］邵志红，王培军，李铭华，等.大鼠骨髓间充质干细胞移植对 Walker-256肝癌生长影响的实验研究[J].中华医学杂志，2009，89(7):491 ［6］Li GC,Ye QH,Xue YH,et al.Human mesenchymal stem cells in-hibit metastasis of a hepatocel lular carcinoma model using the MHCC97-H cell line [J].Cancer Sci,2010,101(12):2546 ［7］Zhu W,Xu W,Jiang R,et al.Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo [J].Exp Mol Pathol,2006,80(3):267 ［8］Zheng JF,Liang LJ.Transplanted bone marrow stromal cells are not cellular origin of hepatocellular carcinomas in a mouse model of carcinogenesis[J].World J Gastroenterol,2008,14(19):3015 ［9］Leek RD,Harris AL,Lewis CE.Cytokine networks in solid human tumors:regulation of angiogenesis[J].J Leukoc Biol,1994,56(4):423 ［10］Budhu A,Wang XW.The role of cytokines in hepatocellular carci-noma[J].J Leukoc Biol,2006,80(6):1197 （2011-04-27收稿） 作者简介刘长乐（1979-），男，主治医师，硕士，研究方向：冠心病、心律失常；通信作者：李广平，Email ：tjcardiol@https://www.360docs.net/doc/5010633663.html, 。 Ｖｏｌ．１7熏Ｎｏ．4Dec.２０11 天津医科大学学报 Journal of Tianjin Medical University 第１7卷4期２０11年12月 458

完整word版,关节软骨损伤组织工程修复

关节软骨损伤组织工程修复进展 关节软骨的损伤和病变是临床常见疾病，可以发生于任何年龄和性别。由于关节软骨没有血管、神经及淋巴组织，本身不含祖细胞，所以自身修复能力十分有限，一旦发生损伤，会导致关节肿胀和疼痛，加速骨关节炎的进展，必须进行修复或置换，如何有效地修复关节软骨损伤始终是医学界尚待解决的难题之一1。1987 年, 美国国家科学基金会(NSF)在加福利亚举行的专家讨论会上提出了“组织工程”的概念：运用工程科学和生命科学的原理和方法, 从根本上了解正常和病理的哺乳动物的组织结构与功能的关系, 并研究生物学替代物以恢复、维持和改进组织功能。Hunziker将其描述为是一种从结构和功能上重建哺乳动物组织的艺术。内容主要包括：(1) 细胞外基质替代物开发；(2) 种子细胞性质研究；(3) 组织工程化组织对各种病损组织的替代。软骨组织工程技术是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上构建组织工程软骨，然后植入到组织缺损部位，完成组织的修复和重建。软骨组织工程的最终目的就是得到高质量的修复组织和长期有效的功能，为病人最终解决痛苦。从这种意义上看，组织工程方法是目前治疗关节软骨损伤最有希望的方法，是目前软骨损伤修复研究的主要方面。组织工程软骨的发展大致经历了三个阶段： 1.第一代组织工程软骨技术：骨膜覆盖自体软骨细胞移植。首先通过软骨活检取材后体外分离培养受体自己的软骨细胞，单层培养扩增，将扩增后的细胞再植回到软骨缺损部位。通常取胫骨内侧近端的骨膜，切成与缺损吻合的片状，缝合在缺损边缘，将骨膜移植覆盖缺损处表面以防止软骨细胞露出，自从瑞典的

干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及检测

三个方向诱导分化

诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化 一、诱导方法 将细胞悬液置于 50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质) 转化生长因子β1 10ng/ml, （左旋）维生素 C 50 mg/L(也有0.1mmol/L) 地塞米松 0.1nmol/L （也有10 nmol/L）

ITS 50mg/ml 丙酮酸钠 1mmol/L 亚油酸 5.35ug/mg 牛血清白蛋白 1.25ng/ml。 倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。细胞长成单层后进行传代。 细胞培养3周。去除培养液,晾干, ①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作； ②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min , 麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干， 显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。 或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的： MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测： 培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液， 10％甲醛固定lh， 自来水冲洗15min， 双蒸水冲洗1次， 滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h， 加人95％乙醇，洗去多余的染液， 烘干，中性树胶封片。

诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化 成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为 0.1 的新生牛血清、 0.1 μmol/L 地塞米松、 50 μmol/L 抗坏血酸、 10 mmol/L β- 甘油磷酸钠 的高糖 DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测: ①碱性磷酸酶组织化学染色: 取成骨诱导 14 d 的细胞 , 40 g/L 中性甲醛固定 15 min, Gomori改良钙钴法染色。取 5 块玻片, 每片随机取 2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。 : 取第 3 代细胞, 以 1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导 3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。 ③钙结节染色: Von Kossa’s矿化结节染色法 原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。 Van kossa银染色法 试剂：

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。

_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用

第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸