生物工程下游技术练习题及答案

练习题及答案

填空题

1.超声波破碎细胞的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关。

3在生物工程下游技术领域，色谱和电泳是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。

5无论是什么类型的液相或气相色谱,其色谱装置均应包括: 流动相供给、进样、色谱柱、检测器等四大部分。

7径向色谱填料主要有：离子交换树脂和亲和色谱填料两种。

9请列举任意四种破碎细胞的方法：

高压匀浆法，高速珠磨法，超声破碎，酶溶法。

11请列举二种测量蛋白质含量的方法：双缩脲法，考马斯蓝法。

13无机HPLC填料最常见的是以多孔大硅胶为基本材料的填料；含14硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃经过热处理引起相分离，生成可溶于酸的相及不溶于酸的高硅相。将酸可溶相浸析出来后剩下的另一相就制成了可控孔径玻璃，可控孔径玻璃的主要化学成份就是SiO2。(每空1分)

17羟基磷灰石在原理上一般被认为是一种无机基质高效色谱。

19．指出蛋白质复性的三种方法：稀释法，透析法，液色色谱法等

21．膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜

23．色谱的峰宽可以用半峰宽、峰底宽、标准偏差表示。

26．Shepadex G25是一种凝胶排阻色谱，主要用于脱盐。

32．目前径向色谱柱使用的填料主要有离子交换树脂和亲和色谱两种;

34．细胞破碎法包括：机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括：液体剪切力和固体剪切力方法，液体剪切力包括：高压匀浆法和超声破碎法；固体剪切力包括：高速珠磨法和压榨法。

26．高压匀浆法的破碎率决定于：匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数。

2目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种: 微孔过滤(微滤)、超滤、反渗透。

4在生物物质分离中，可以依据一次进样量多少，将色谱分为：分析色谱、半制备色谱（中等规模制备色谱）、制备色谱和工业生产规模色谱4大类。

6在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法：一种是维持流动相热力学参数不变的等梯度洗脱法，另一种叫梯度洗脱法。

8评价HPLC色谱填料性能的主要表征指标包括：

保留值，选择性，柱效率，填充柱的总空隙度和穿透性，分离度。

10在HPLC领域内经常可以遇到的吸附等温线可以有以下5种（形状）:凸形、凹形、S形、H形、阶梯形

12常见的无机色谱填料主要包括：多孔硅胶、可控孔径玻璃、氧化铝、氧化钛、羟基磷灰石以及碳和石墨等基质。

15不同分子量的蛋白质在电场中的迁移速度与其所带的净电荷数成正比，与它本身的半径及溶液的黏度成反比。

18．指出三种交联葡聚糖的微载体：Cytodex1微载体；Cytodex 2微载体；Cytodex 3微载体

20．固液分离的主要方式包括：离心法，微孔膜过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。

22 色谱的保留值可以用保留时间也可以用保留体积来表示。

24．指出下列情况下色谱系统对容质的柱效和分配系统差的关系：

①柱效较高，△K (分配系数)较大,完全分离；

②△K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；

③柱效较低，，△K 较大,但分离的不好；

④△K 小，柱效低，分离效果更差。

25．线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形。从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、S形的色谱图是波浪形的。

27．Shephadex G100是一种凝胶排阻色谱，主要用于蛋白质的纯化。28．DEAE-Shaphdex A25是一种离子交换层析介质。

29．CM-纤维素是一种弱阳离子交换介质。

30．离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。

31．QAE-葡聚糖是强碱阴离子交换剂，SP—是强酸阳离子交换剂。

33．蛋白质含量和纯度测定方法。含量测定:克氏定氮法，TCA比浊度法、双缩脲法、福林-酚法和紫外线法，考马斯兰法（Bradford法）。

纯度衡量:电泳法，层析法，质谱法等。一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。

35．高压匀浆法的主要困难包括：温控和堵塞问题

34．蛋白质的分子量测定：超离心法、光散射方法、凝胶过滤法、SDS-PAG、电泳法。

判断对错题

1.微波加热法破碎细胞特别适合于对热不稳定的的产物的提取。×

2.利用液相色谱方法对包含体蛋白质进行复性比稀释复性法优越.∨

3.浓差极化是一个可逆的过程。∨

4.层析系统中,有效柱长>最短柱长是使最难分离的一对溶质将达到完全的基线分离的必要条件. ∨

5.层析过程中,有效柱长是随层析条件的变化而变化的. ∨

6.分析色谱是线性色谱；∨

7.只要样品进样量足够大，色谱过程就是一种非线性色谱。∨

8.生化用离子交换树脂的电荷密度越大，其分离效果越好。×

9.样品中蛋白质的纯度为99%，说明该样品中目标蛋白质的含量为样品总量的99%。×

10.所有的蛋白质电泳都是利用不同蛋白质带的电荷的差异而达到分离不同蛋白质目的的。×

11.葡聚糖凝胶排阻色谱中，上样量越大，分辨率越高。×

12.凝胶排阻色谱的层析柱越长越好。×

13.HPLC填料的颗粒分散范围越窄越好。∨

14.非线性色谱的样品的保留值是可变的。∨

15.为了减小样品在洗脱过程的轴向扩散，可采取增大进样浓度减少进样量的方式。∨

16.作为动物细胞培养的优良微载体应该是刚性的。×

17.高速珠磨法比高压匀浆法破碎细胞的效果好。×

18.色谱过程中试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础。∨

19单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。∨

20.色谱柱效高说明该色谱对物质的分离度高。

1.凝胶过滤操作中，通常上样量越小，分辨率越高。×

2.一旦液料开始与膜接触，膜污染就开始发生。∨

3.膜污染是一个可逆的过程。×

4.层析系统中,当实际柱长<最短柱长, 则该分离过程不能达到物质的有效分离. ∨

5.层析过程中,可以通过改变洗脱剂的浓度变化梯度改变有效柱长和最短柱长. ∨

6.制备型色谱是非线性色谱。∨

7.非线性色谱的保留值是可变的，峰形是不对称的，峰高与样品量不成正比关系。∨

8.HPLC填料的颗粒粒度的分布应该是越小越好的，最好是能实现颗粒的单分散。∨

9.实验室可以使用SDS-PAGE电泳测量蛋白质的分子量。∨

10.硅胶在pH1~14的范围内都很稳定，因此适合于在极端pH条件下的离子交换色谱。

11.同一蛋白质在不同种类的缓冲液中，只要缓冲液的pH值相同，则蛋白质所带的电荷数量也相同。×

12.细胞破碎过程应尽量彻底，使细胞碎片尽可能越小越好。×

13.利用聚赖氨酸/海藻酸系统进行的细胞微囊化培养，所形成的微囊外膜的孔径的大小主要是由聚赖氨酸的分子量所决定的。∨

14.非线性色谱的层析峰形一般来说是高斯正态分布的对称峰。×

15.动物细胞培养一定要采用贴壁培养的方式。×

16.动物细胞培养微戴体的密度应略大于培养基。×

17.一般讲，亲水性膜及膜材料电荷与溶质相同的膜较耐污染。∨

18色谱过程一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢。∨

19.用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。∨

20.分离度是由色谱柱的柱效所决定的。×

名词解释

1.连续培养反应器

2.得率系数

3.蛋白质的复性

4.膜污染

5.分配色谱

6.吸附等温线

7.包含体

8.双水相萃取

9.分配系数10.亲和色谱1.菌体比生长速率（μ）2.贴壁培养3.浓差极化4.排阻色谱5.有效柱长（有效迁移距离，Leff）6.切向流过滤7.蛋白质的复性8.反渗透9.保留时

间（tR）10.离子交换色谱

完成图表

细胞破碎的方法分类

破碎方法

机械法非机械法

固体剪液体剪干燥液胞作用

切作用切作用处理

珠磨法压榨高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法问答题

细胞浓度及其测量

细胞浓度通常以质量浓度g/l来表示，表示单位体积培养液中菌体的干重，kg/m3

测量方法：

直接测量法：

⑴细胞干重法：把一定体积的培养液离心、收集细胞、洗涤、干燥、称重。此方法测的是所有细胞的浓度，合适用于含有其他不溶性物质的培养液。

⑵显微技术法：利用显微镜和血球计数器测定单位体积培养液中的细胞个数。这种方法不适用于多细胞或丝状生物体的计数，也不能区分死细胞和活细胞。

⑶平板计数法：将微生物培养液样品用无菌生理盐水进行一系列的稀释，取一定量的稀释液均匀的涂布于培养皿中的固体平板培养基上，经一段时间的培养，从平板上长出的菌落数、涂布的稀释液体积以及稀释倍数可以算出培养液中的微生物浓度。

⑷浊度法：培养液的浊度或光密度与细胞的浓度成正比，因而可通过比色测定培养液中的细胞浓度。

2. 间接测量法：培养基中存在较多不溶性物质时，可以通过测定结构细胞的大分子物质（如蛋白质、RNA、DNA等）来确定细胞的浓度。采用这种方法时要确保测定组分在细胞中的含量基本保持不变。

名词解释答案

连续培养反应器：不断地往反应器中加入营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。在良好的控制下，罐内菌体的增殖速度可以与采出速度相同而达到稳态。

菌体比生长速率（μ）：单位浓度菌体在一定条件下引起的反应速率, 其值反映了培养菌体增长的能力, 受菌株及各种物理化学环境的影响. 表示为μ=dx/x.dt

得率系数：两种物质得失之间的计量比。Yx/s,Yp/s

贴壁培养: 贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.

蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。

浓差极化：指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。溶剂向膜面流动引起溶质向膜面的流动，这种流动如果与浓度梯度所驱动的溶质向本体溶液扩散的速度平衡时，在膜面附近就形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域就称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化。浓差极化是一个可逆的过程；

膜污染：物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。

排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。

分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。

有效柱长（有效迁移距离，Leff）：(不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的线性流速时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献，溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献，而当其迁移速度等于流动相速度时，溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。)溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称为有效迁移距离，也称为有效柱长。

吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。（实际是维持了Ｒc).目前几乎所有的膜固液分离都采用切向流方式

包含体（包涵体，inclusion bodies):存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，这些产物在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物学活性。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。

蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。（重复）

切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体

移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。（重复）

双水相萃取：利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、ＰＥＧ／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。

反渗透：在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中的大分子、小分子有机物及无机盐全被截留。理想的反渗透膜应被认为是无孔的，它分离的原理是溶解扩散（或毛细孔流学说）。

分配系数：组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示

色谱曲线基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。

保留值：

保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。

死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。

调整保留时间（tR ＇）：tR＇= tR－tM

容量因子k：平衡时，组分在各相中总的质量比

离子交换色谱：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。

排阻色谱：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。（重复）

亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。

若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。

非线性色谱:Cm与Cs不存在线性关系的色谱.

吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。（重复）

全交换容量:每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量.是一个定值.

工作容量:每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量.是一个变值.

疏水性色谱:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用.高浓度的盐条件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降.当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱.

采用径向流技术的色谱,即样品和流动相沿径向流动,可以从色谱柱的周围流向圆心,也可以从圆心流向柱的周围.通常采用从柱的周围流向圆心的方式.

泳动度(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度

即:U=V/E=(d/t)/(V/L)

变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进生

非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂

高压均浆法：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。