miRNA194-5p的克隆及其功能分析实验报告

microRNA-X的克隆及其功能分析

摘要：微小核糖核酸（Has-miR-194-5p）是一类长20-22个核苷酸的小分子非编码RNA，它通过与靶基因3'端非编码序列结合促进靶基因降解或抑制翻译过程，从而抑制靶基因表达。

本实验通过具体操作对特定基因克隆并研究其功能，从而理解并掌握基因工程的基本思路和分子生物学、细胞生物学的核心技术。

关键词：质粒DNA，MTT，RNA抽提纯化，逆转录PCR

引言：miRNA参与生物体的生长、发育和凋亡的调控，并在疾病发生和发展过程中起着重要作用。基于miRNA所产生的多种多样的生物学功能，近年来对miRNA 的研究成为科学研究的热点之一。克隆获得特定的miRNA是研究其功能的前提。重组质粒经测序验证后经过质粒抽提，进行转染真核细胞，质粒pSuper带有EGFP 标记，可以在荧光显微镜下观察转染效率，通过MTT实验检测miRNA过表达对细胞活力的影响；通过RT-PCR检测miRNA对其特定靶基因的表达调控；在蛋白水平通过Western blot进行验证。

一、实验内容

1.对特定microRNA-X的生物信息分析；

2.人工合成shRNA与pSuper载体的体外连接与转化；

3.质粒DNA的抽提与鉴定；重组质粒DNA序列测定；

4.转染真核细胞；MTT法检测对细胞活力的影响；

5. RNA的抽提纯化及逆转录PCR扩增目的基因；

6.Western blot 对特定蛋白表达的检测。

二、实验目的

（一）实验部分：

1.掌握基本的分子生物学实验技术DNA重组、质粒抽提、RNA抽提、RT-PCR、Western blot

2.掌握基本的细胞生物学实验技术细胞培养、MTT、转染

（二）理论部分：生物信息预测分析

1.掌握基因克隆的策略（目的DNA获得、体外连接方式、重组克隆的筛选与鉴定）

2.掌握基因分析的基本策略（细胞活力、mRNA水平、蛋白水平等进行分析）

3.掌握基本的生物大分子相关的数据库的使用及相关生物信息分析软件的使用（NCBI数据库、Targetscan、Pictar、mirbase等）

实验一对特定miRNA-X的生物信息分析

目的：掌握对特定microRNA的生物信息学分析

1 mirbase使用

2 特定miRNA序列的获得（成熟和前体序列）

3 特定miRNA target预测分析

实验二人工合成shRNA分子与pSuper载体体外连接与转化

目的：1 利用shRNA设计的基本原理，掌握microRNA的设计；

2 掌握DNA酶切与连接的基本技术；

3 掌握质粒转化的基本技术。

实验三质粒DNA的提取、纯化与鉴定

目的: 1 掌握质粒抽提的目的；

2 了解质粒抽提原理；

3 熟悉质粒抽提方法。

实验四转染真核细胞及MTT法检测对细胞活力的影响

目的：1 掌握外源基因导入真核细胞的方法（磷酸钙沉淀法和脂质体法）；

2 掌握外源基因导入真核细胞的目的；

3 掌握MTT检测细胞活力的原理；

4 了解磷酸钙沉淀法的条件优化思路和方法。

实验五RNA的抽提及RT-PCR扩增目的基因

RNA抽提目的：1.掌握RNA操作注意事项

2.了解RNA抽提原理

3.熟悉RNA抽提方法

4.了解鉴定RNA含量和质量的方法

实验六Western blot对特定蛋白表达的检测

目的：1 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白的原理

2 掌握Western blot主要操作步骤及应用

三、实验原理

实验二人工合成shRNA分子与pSuper载体体外连接与转化

1 shRNA的设计

2 DNA（shRNA/质粒）的酶切

3 DNA（shRNA/质粒）的连接

4 大肠杆菌感受态的制备

5 质粒的转化

实验三质粒DNA的提取、纯化与鉴定

理论基础：宿主染色体DNA与质粒DNA的区别

细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNA，独立于

细菌染色体之外，能够进行自我复制。质粒作为

载体广泛应用于目的基因的克隆、测序、表达等工作。

实验原理：SDS-碱裂解法

三个基本步骤

1 细菌培养

2 裂解细菌以及质粒的初步分离

3 质粒DNA的纯化

实验四转染真核细胞及MTT法检测对细胞活力的影响1.外源基因导入真核细胞即细胞转染

转染（transfection）：将外源DNA片段导入真核细胞的过程

用途：研究研究蛋白质的结构和生化特性

研究基因表达的调控机理

2. MTT法检测细胞活力

实验五RNA的抽提及RT-PCR扩增目的基因

1.理论基础：核生物结构基因有内含子

基因在转录水平的表达

2.实验原理：酸性酚法；四步骤

（1）组织或细胞匀浆

（2）分离总RNA

（3）纯化RNA

（4）检测RNA的纯度及完整性

四、实验材料和方法

材料

细胞株

人视网膜色素上皮细胞

质粒和菌株

pSuper载体和E.coli DH5α

分子克隆及转染试剂

限制性内切核酸酶、连接酶试剂盒、LB固体/液体培养基、质粒抽提试剂盒、Lipofectanmin2000、MTT、DMSO、Biowit钙转试剂盒

细胞培养试剂

DMEM-HG、小牛血清、胰酶、EDTA、100*双抗

RT-PCR实验试剂

无RNA 酶水、Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无水乙醇、甲醛变性电泳缓冲液、RNA电泳用加样缓冲液、逆转录反应试剂盒、dNTP mix、RNase Inhibitor、PCR kit试剂盒、oligo Dt、电泳缓冲液5×TBE

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-印记法试剂

PMSF(苯甲基磺酰氟)、SDS（十二烷基磺酸钠）、丙烯酰胺、N,N,-亚甲基甲叉双丙烯酰胺、TEMED(N,N,N,N-四甲基乙烯二胺)、溴酚蓝（BPB）、碱性磷酸酶标记羊抗鼠、β-Actin、PVDF 膜、分子量标准蛋白、BCA 蛋白测定试剂盒

步骤

实验二人工合成shRNA分子与pSuper载体体外连接与转化

感受态细胞制备→→shRNA的体外退火→→载体与shRNA的连接→→转化

1.shRNA的退火

1）干粉oligo离心

2）加无菌水稀释至100umol/ul

3）退火反应

反应体系(50ul)

10*PCR缓冲液5ul

正向oligo 5ul

反向oligo 5ul

ddH2O 35ul

反应条件

混匀后置95oC保温10min

2.shRNA与pSuper的载体连接

1）酶切质粒电泳

2）酶切质粒与退火的shRNA混合

3）连接反应

反应体系(10ul)

shRNA 4ul

酶切质粒(50ng) 1ul

SolutionⅠ(含T4 ligase和ligation buffer) 5ul

反应条件

16oC保温0.5小时,-20oC冷冻保存

3.重建载体的转化

1）实验组:100ul感受态菌液与10ul连接产物混合

阳性对照组: 100ul感受态菌液与10ulpSuper混合

阴性对照组: 100ul感受态菌液与10ul连接液

2）休克反应

3）加入kana-LB液体培养基200ul

4）37oC复苏45,min

5）全部细菌涂布于抗性平板，37oC培养16h

反应条件

置42oC水浴热休克90sec，迅速取出，置于水浴中冷却

实验三质粒DNA的提取、纯化与鉴定

1.培养细菌

2.裂解细菌以及质粒的初步分离：SDS-碱裂解法

3.吸附层析法纯化质粒DNA

4.质粒琼脂糖凝胶电泳检测

实验四转染真核细胞及MTT法检测对细胞活力的影响

Ⅰ细胞转染

1.铺细胞（for MTT）

1）吸去培液，用PBS溶液洗一遍

2）加入胰蛋白酶-EDTA溶液消化，于CO2培养箱放置3-5min

3）用手掌轻敲培养瓶侧面，若细胞呈均匀的细沙粉状表明已消化完全（否则再消化片刻）

4）加入适量细胞培液终止消化

5）反复吹打将细胞吹成单细胞

6）计数，按每60mm培养皿0.6－1.0 ×106个细胞铺2个皿

2.转染

1）配制转染混合物：

A：DMEM+DNA，混匀；B：DMEM+脂质体

2）将等体积B液逐滴加入A液，同时轻弹管壁

3）将此脂质体－DNA混悬液转移至单层细胞上的培养液中

4）轻轻摇动培养皿混匀（注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀）

5）置于37℃、5％CO2培养箱中培养

6）转染后3-6小时，可换液

3.换液

1）转染后6-8小时，弃去培养皿中含有沉淀的细胞培养液

2）加入新鲜培养液继续培养

4.收获细胞

1）继续培养36-48小时后收获细胞

2）用Q-PCR,Western Blot的方法检测转染成功与否以及转染效率

ⅡMTT实验

1. 接种细胞：

1）细胞用胰酶消化成单细胞；

2）计数；

3）用培养液配成单细胞悬液，以每孔2x104-4x104个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，每组6个孔。

2. 培养细胞：细胞培养1天（根据实验目的和要求决定培养时间）。

3. 转染：处理时间48h。

4. 呈色：换液后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul。

5.终止培养：

1）孵育1小时后，小心吸弃孔内培养上清液；

2）每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

6. 比色：

1）选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值；

2）记录结果，以处理组为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞活力柱状图

实验五RNA的抽提及RT-PCR扩增目的基因

ⅠRNA抽提

1.倒出HEK293细胞培养液，1×PBS 清洗3次。

2.每10 cm 2 （或107）培养细胞中加入1 ml的Trizol，水平放置10min，并不时晃动培养皿充分裂解（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞）。

3.将裂解液转移至离心管中。室温静置5 分钟。

4.加入氯仿0.2ml，剧烈振荡，室温放置10min。12000rpm，15min，取上清。（离心后溶液分为三相，即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小

心吸取上层相，绝不能有中层蛋白混入。）

5. 加入异丙醇0.5ml ，振荡混匀，室温放置10min ，12000rpm,10min ，弃上清。（加入50％的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当）

6. 1ml 75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm,5min ，重复一次。

7. 空气干燥沉淀，溶解于20μl DEPC-H2O 。留样2μl ，其余－70℃保存备用

ⅡRNA 质和量的鉴定

1.制备琼脂糖凝胶：首先将0.5g 琼脂糖溶化于32ml 水，冷却至60℃。加入5×甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml ，37％甲醛水溶液9ml ，混合均匀并灌制胶板。

2.取1μl RNA 溶液，加入甲酰胺-上样缓冲液9μl ，95℃变性5分钟，迅速冰浴冷却，点样。

3 .150V 电泳30分钟，紫外灯下观察电泳结果

Ⅲ逆转录聚合酶链式反应(RT)-PCR

1 取消毒的0.2ml 离心管，加入下列成分：

总RNA 1-5μg

（根据浓度计算RNA 模板要用量）

Oligo(dT)引物 1μl （0.5μg/20μl ）

dNTP Mix (10mM) 1μl(偏高)

加入无RNA 酶的ddH2O 至总体积15μl ，混匀。

2 置65℃保温5分钟，放于冰上。再加入下列成分：

5×first-Strand Buffer 4μl

MMLV(逆转录酶) 1μl

3 混匀，42℃保温1小时。70℃保温15分钟

ⅣPCR

1.取消毒的0.2ml 微量离心管，加入下列成分

10×PCR Buffer 2.5 μl

dNTPs(2.5mM each) 2 μl

逆转录产物 1μl

引物混合物(10μM each) 1μl

Taq DNA polymerase 1μl

ddH2O 17.5 μl

2.混匀，离心4000转1分钟。

3.扩增程序：

94℃变性30s

55℃复性30s

72℃延伸1min

mix 体系：

2×mix: 12.5μl

逆转录产物: 1 μl

引物 (10μM each): 1μl

ddH2O : 5.5μl

实验六 Western blot 对特定蛋白表达的检测

一、蛋白质样品制备

1.裂解：100mm培养皿/450μl裂解液；组织样品1：5-10;

4℃，15000g离心1小时取上清

2. 蛋白定量（Bradford法）

3. 根据样品蛋白浓度加入Laemmli 样品缓冲液，100℃加热

3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清。

二、电泳及转印

1.制胶

1）将12％的分离胶（10毫升）加入玻璃板之间，缓慢加入蒸馏水密封，待胶

反应完成(约30min)

2.上样与电泳

1）小心取出样品梳

2）10ul蛋白样品，100℃加热3-5分钟，缓慢加入点样孔中

电泳条件：80V 30min——120V 1-2h

3）卸开电泳槽，撬开玻璃板，

小心取出凝胶，剥离分离胶

3.转膜

1）装好“三文治”夹板（在转膜缓冲液内操作，不要有气泡！）

次序: 负极-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-正极

2）装好转膜设备和内置冰袋

3）300mA恒流2h转印

4.总蛋白丽春红染色鉴定转膜成功与否

1）转印结束后取出印迹膜置于丽春红染色液中，并在室温下搅动3-5min 2）将膜放入PBS洗数次，每次1-2min，并且更换PBS

3）根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记,剪膜。

三、膜的封闭与抗体杂交

1.封闭：阻断非特异性结合；

2.孵育一抗：4℃孵育过夜

TBST洗膜：10min 3次；

3.孵育二抗：RT 2h；

TBST洗膜：10min 3次

四、抗体检测

1.ECL发光：底物luminol

2.生色底物显色：DAB

1）工作液配制：1ml 水加显色剂A，B，C各一滴，混匀

2）显色：将混匀的工作液平铺在二抗杂交后的膜上，RT观察至出现明显棕色条带；

3）水洗终止反应

五、结果和讨论

1、mir194转染的结果：sequence存在于转染的感受态细胞DNA序列中。

2、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果

下边第三条和第四条为我们组的结果，基本没有开环DNA，结果较好，测定DNA 浓度为179ng/μL

3、MTT法检测

（1）荧光检测

转染人视网膜上皮细胞的结果

本组DNA-磷酸钙沉淀介导的转染法转染人视网膜上皮细胞的结果，绿色细胞为表达增强型绿色荧光蛋白的细胞，转染结果观察不明显，较为失败（2）解离曲线

由解离曲线可看出，除某一组中可能出现了引物二聚体及其他杂物外，其余

各组峰值在纵轴上较吻合，实验比较成功。

（3）Ct值（循环阈值）

小组实验结果：

GAPDH：18.0811、18.1273、18.0333

循环数越高说明cDNA的浓度越低，起始浓度越大Ct值越小

相对定量法通常以表达恒定的管家基因作参考，来获得管家基因的表达参数。实验组与正常对照组的基因表达指数的比值就代表基因的相对表达量，反映实验组基因表达的变化情况。

由上述结果可分析得：目的基因的表达受到了抑制，导致逆转录产物的拷贝数降低。

4、RNA凝胶电泳结果

5、RT-PCR

（1）扩增曲线

扩增曲线在基线以上部分符合试验结果要求，说明结果比较成功。

6、western blot

（1）蛋白质定量

（2）Western blot检测蛋白质的结果

左图为GFP检测结果，右图为GAPDH检测结果,左下为GFP+GAPDH的检测结果

GFP中的条带分子量大小大约为35KDa,GAPDH中约为40KDa，GAP+GAPDH中在35KDa和40KDa条带除均有印记，在转染成功，质粒DNA 得到表达。六、实验讨论

内源性miR-200过量表达可通过直接定位靶基因ZEB1/2 mRNA特异序列3’非翻译区(3'UTRs)抑制它们的翻译而使其降解，同时这个抑制过程也伴随靶基因mRNA水平的降低。同时ZEB1也能抑制miR-200的表达，敲除ZEB1基因可增加所有miR-200家族的表达，miR-200家族的所有成员都是ZEB1和ZEB2转录因子的抑制目标。ZEB蛋白和miR-200家族成员不仅功能上相反，而且它们彼此之间相互调节着各自的表达。在ZEB蛋白和miR-200家族成员之间存在着一个负向反馈环即ZEB/mir-200反馈环，它决定着细胞向上皮和间质细胞之间的转化。这是本次试验得以进行的基础。

1．miRNA是一类长20~22个核苷酸的小分子非编码RNA，它通过与靶基因3’端非翻译序列结合促进靶基因降解或抑制翻译过程，从而抑制靶基因表达。其中mir200b-5p和ZEB1构成一对作用基因与靶蛋白。ZEB蛋白能够调控各种EMT和肿瘤相关基因的表达，如能够抑制维持细胞上皮表型基因编码蛋白E．钙粘蛋白、Plakophilin和ZO3的表达，激活促侵袭转。

a．移表型基因MMP2的表达。miRNA广泛存在与生物个体中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，本身不具有开放阅读框架。

b．通常长度为20-24个碱基，但在3，端可有1-2个碱基变化。

c．成熟的miRNA5，端为磷酸基团，3，端为羟基。

除此之外，多数miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性。

2．成熟的miRNA存在着与靶mRNA3，非翻译区互补配对的位点，两者相结合是翻译无法进行，从而抑制基因表达。

3．mir194转染细胞后，成功导致了细胞活力下降，细胞蛋白质表达量降低。由western blot染色结果可以看出miR194转染后的预期功能因因管家基因稳定表达受到抑制，蛋白质翻译量受到影响。

综上，可以得出mir194-5p过表达下调ZEB1表达的结论。

参考文献

1.张弛宇，徐顺高，黄新祥；《一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方

法的建立》；

2.叶茂。陈跃磊，名镇寰；《miRNA(microRNA)家族的研究进展》；生物化学

与生物物理进展

3.李伟，金由辛；《miRNA的生物合成过程》；生物化学与生物物理进展

软琼脂克隆形成实验步骤完整版

软琼脂克隆形成实验步骤完整版集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10 （4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和 0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2 ×1640+2×PS）+2ml0.7%Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO ，37℃，培养2－3 2周。 8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数× 960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。

实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066 班级：11级生技02班

前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器 1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21； 2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定： 1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸 DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T 4 lisase。 2)实验步骤：质粒的提取与鉴定

《分子生物学大(综合)实验》课程介绍(精)

《分子生物学大（综合）实验》课程介绍课程代码（学校统一编制）课程名称分子生物学大（综合）实验英文名称MolecularBiologyBigExperiment 学分：3修读期：第七学期授课对象：生物科学、生物技术课程主任：姓名、职称、学位关洪斌，副教授，博士课程简介 21世记是生命科学的世记,而分子生物学是带动生命科学的前沿科学。分子生物学是在生物大分子水平上研究细胞的结构、功能及调控的学科,在现代生物学学科发展中的重要性与不容置疑的带头作用是众所周知的。许多重大的理论和技术问题都将依赖于分子生物学的突破。随着分子生物学研究工作的不断深入,相关实验技术方法和技术日新月异的发展。为了适应分子生物学研究工作日益发展的需要,满足培养从事现代生物学研究,尤其是进行分子生物学研究的人才的需要,特设置分子生物学大（综合）实验课程。本课程的教学目标和基本要求是使学习者基本掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法,教学内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。通过本实验可提高学生的动手能力和创造性思维能力,较好地掌握分子生物学实验操作和技能，为今后独立进行科研工作打下坚实基础。实践教学环节（如果有）实验内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。课程考核实验报告指定教材自编参考书目 1.分子生物学实验指导高等教育出版社施普林格出版社，1999 2.彭秀玲,袁汉英等.基因工程实验技术.湖南科学技术出版社,1997 3.吴乃虎.基因工程原理(上下册).科学出版社,1998 4.F.奥斯伯等著:颜子颖,王海林译.分子克隆实验指南(第二版).科学出版社,1998 5.J.萨姆布鲁克等著:金冬雁,黎孟枫等译.精编分子生物学实验指南.科学出版社,1993

软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。 8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。

基因克隆、假病毒操作步骤

实验名称：基因克隆实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；

质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体

植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤

植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means

based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。（一）植物基因的启动子启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。（二）植物基因的增强子序列

细胞克隆形成实验

机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。第 1 页共 1 页细胞克隆形成实验一、当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。[晶莱生物] 二、实验方法平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。三、注意事项 (a)琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； (b)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c)软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； (d)接种时细胞密度适度，不可过高。细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。四、周期 1-2个月

整个基因克隆实验流程(完整)

一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则一、植物基因克隆实验课的目标根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科研基础。二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

人教版八年级下册生物实验指导

八年级下册（人教版）实验教学目录第七单元生物圈中生命的延续和发展第一章生物的生殖和发育第一节植物的生殖探究实验十四扦插材料的处理 (89) 第四节昆虫的生殖和发育课外探究家蚕的生殖与发育 (91) 第四节鸟的生殖探究实验十五探究鸟卵的结构 (92) 第二章生物的遗传和变异第五节生物的变异探究实验十六花生果实大小的变异 (94) 第三章生物的进化第三节生物进化的原因模拟探究模拟保护色的形成过程 (97) 第八单元健康地生活第三章动物在生物圈中的作用第二节动物与人类生活的关系探究实验十七酒精或烟草浸出液对水蚤心率的影响 (100)

探究实验十四扦插材料的处理 ■实验预习 1．下列不属于无性生殖方式的是（） A.试管婴儿 B.克隆 C. 组织培养 D.出芽生殖 2．下列不属于无性生殖的优点的是（） A.保持亲本的优良性状 B.繁殖速度快 C.培育新品种 D.以上都是3．有性生殖有生物个体生命起点是（） A.生殖细胞 B.受精卵 C.卵细胞 D.幼体出生 4．某同学在橙树枝上做了多次嫁接柑桔枝条，就是没有成功。可能的原因是（） A.形成层对齐 B.温度不适宜 C.水分适宜 D.接穗和砧木属同科植物5．下列哪项为无性生殖和有性生殖的最大区别? （） A．是否产生生殖细胞B．是否需要两性生殖细胞结合 C．后代是否有性别之分D．亲代是否有性别之分 6．克隆羊“多莉”，是将白面绵羊的乳腺细胞核移植到黑面绵羊的去核卵细胞中后，经一系列培育而成。试根据遗传学原理，分析“多莉”的面部毛色应是（） A．黑色B．白色C．黑白相间D．不能确定 ■实验指导 1．材料选取：用茎繁殖成活率高的植物，如柳枝、玫瑰枝、葡萄枝、枳壳枝等一年生新枝。 2．对枝条的处理：（1）上下两端至少各有一个芽。上芽利于长茎叶；下芽利于长根。（2）上端切口角度是45度，而下端切口是斜向的 3．扦插的要求：茎插入角度为45度，保证上端切口与地面呈90度角。 ■实验报告目的要求： 1．进一步掌握对照实验的设计 2．运用生物知识解决实际问题材料用具：

细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2?3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10?30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

RNA提取,RT-PCR实验报告

RNA制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴定的基本方法。实验原理细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。本实验中几个重要试剂的作用： Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。3、抑制内源和外源RNase。氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量要比乙醇少。异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。 75%乙醇：应用无水乙醇+DEPC水制备。用乙醇洗涤沉淀，可去除所有残留的蛋白质和无机盐.RNA样品中如果含有无机盐,有可能对后续实验操作中的一些酶促反应产生抑制作用。实验步骤按规定的操作步骤进行操作，特别注意创造一个无RNA酶的环境。实验结果经RNA琼脂糖电泳后，紫外灯下观察RNA分离情况如下图：

实验六基因克隆及序列分析

实验六、基因克隆及序列分析 1.目的片段回收取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 μl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 μl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 μl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。 2 片段连接反应采用pGEM? -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。取1.5 μl PCR产物，加入0.5 μl T4 DNA ligase，0.5μl T Easy Vector，2.5 μl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4?C冰箱过夜。 3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。取2 μl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约5 min）小心吸取30-50 μl转入到离心管中，冰上静置20 min。42℃水浴中热激90 s（不要摇动）。迅速放回冰上2 min，然后加入LB培养基（室温）400 μl，37℃摇床培养1.5 h（150 r/min）。

目的基因的克隆转化及重组子筛选

实验报告题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选指导老师:丛佩清日期:2013/10/24-2013/10/26 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。

(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。三．实验材料：大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1μl pMD19-T Vector、5μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅱ、350μlSolution Ⅲ、HiBind ? Mini Columns (I)、500 μlBuffer HB、1400 μlDNA Wash Buffer等四．实验步骤、现象、结果及分析： Ⅰ10月24号 (1)cDNA电泳及胶回收 1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2μl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。表一：cDNA琼脂糖凝胶重量空管2管3管重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。 9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。表二：cDNA吸光度测定 2组3组

肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验

Soft Agar Colony Formation Assay Darren Carpizo, M.D. Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye. 1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water) and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS 2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase 3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of one plate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 5 4)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layer solution is made separately. 5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to the following formula: Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 ml FBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml 100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml 1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25ml pour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top **Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be 12.5ml) Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml 1X Iscove's 4 X n = 20ml FBS 1 X n = 5ml 100X glutamine 0.08 x n = .4 ml Noble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour) 6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 ml to each of 8 plates, place in 37° C incubator 7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1X Iscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculate

miRNA194-5p的克隆及其功能分析实验报告

软琼脂克隆形成实验步骤完整版

实验绿色荧光蛋白

《分子生物学大(综合)实验》课程介绍(精)

软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)

基因克隆、假病毒操作步骤

质粒DNA的提取和纯化实验报告

植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤

细胞克隆形成实验

整个基因克隆实验流程(完整)

植物基因克隆实验指导

人教版八年级下册生物实验指导

细胞克隆形成实验

RNA提取,RT-PCR实验报告

最新soft agar assay protocol软琼脂克隆形成实验教学内容

实验六 基因克隆及序列分析

目的基因的克隆转化及重组子筛选

肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验

实验六基因克隆及序列分析