病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法
方法一超速离心沉淀法
1 仪器
超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管
2 方法步骤
(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。
(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。
(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。
(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。
(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。
(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的
液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80 °C冻存。
方法二PEG-8000浓缩法
⑴ 5X PEG8000+NaCI配制称取NaCI 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200ml
Milli-Q 纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4C。
(2)使用0.45卩m滤头过滤慢病毒上清液；
⑶ 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaC母液7.5 ml;
⑷ 每20?30min混合一次，共进行3-5次；
(5) 4 度放置过夜；
⑹ 4 度，4000 g，离心20min；
(7)吸弃上清，静置管子1?2 分钟，吸走残余液体；
(8)加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
(9)集中后的病毒悬液分装成50卩l每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 C
方法三慢病毒纯化浓缩试剂盒
1.每10ml过滤后的病毒初始液，加入Concen Solution 3ml,每20-30min 混合一次，共进行3-5 次。
2.2. 4C放置过夜。
3.4°C, 3000 g,离心45min。
4.去掉上清，静置管子1-2min ，吸走残余液体。
5.加入无血清DEM充分溶解慢病毒沉淀。
6.病毒悬液分装成200卩l每份，保存在离心管中，速冻后储存在-80 C。
（学习的目的是增长知识,提高能力,相信一分耕耘一分收获,努力就一定可以获得应有的回报）
噬菌斑测病毒滴度
杆状病毒滴度检测 实验概要 本实验介绍了检测病毒滴度的方法。 实验原理 根据噬菌斑数计算病毒滴度。 工具/原料 ? 1. 4% agarose gel：2g agrose 50ml 水，高压灭菌 ?2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen）0.07gNaHCO3 H2O，调PH6.1，定容至100ml，无菌过滤 ?supplemented Grace：1×Grace添加 3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，无菌过滤 ? 4. 高温灭活FBS ?主要设备 1. 6孔板 2. 12ml离心管 3. 100ml无菌玻璃瓶 4. 无菌吸管 5. 70℃水浴锅 ?实验材料 杆状病毒，SF9：5×105cells/ml 方法/步骤 1. 1
无菌条件下，2ml/孔细胞（5×105cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度； 2. 2 将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热； 3. 3 将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10-1~10-8。 4. 4 弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h。 5. 5 配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS）12.5ml 无菌水12.5ml 4% agarose gel，至预热的100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用； 6. 6 弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固； 7.7 将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天；
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
ARP病毒彻底清除方法
最近流行的ARP病毒彻底清除方法 1、删除”病毒(一种具有隐蔽性破坏性传染性的恶意代码)组件释放者”程序： “%windows%\System32\LOADHW.EXE”（window xp 系统目录为：“C:\WINDOWS\Syst em32\LOADHW.EXE”） 2、删除”发ARP欺骗包的驱动(驱动程序即添加到操作系统中的一小块代码，其中包含 有关硬件设备的信息)程序” (兼“病毒(一种具有隐蔽性破坏性传染性的恶意代码)守护程序”)： “%windows%\System32\drivers\n pf.sys”（window xp 系统目录为：“C:\WINDOWS\Syste m32\drivers\npf.sys”） 2、npf.sys病毒手工清除方法 3、病毒的查杀有很多种方式，下面就让我们来介绍一下手工查杀的方法。 4、npf.sys(%system32/drivers/npf.sys)是该npf病毒主要文件，病毒修改注册表创建系统服务 NPF实现自启动，运行ARP欺骗，在病毒机器伪造MAC地址时，不停地向各个机器发送ARP包堵塞网络，使得传输数据越来越慢，并且通过伪掉线来使用户重新登陆游戏，这样它就可以截取局域所有用户登陆游戏时的信息数据。 5、该病毒往往造成网络堵塞，严重时造成机器蓝屏!!!!。开始杀毒: 6、1.首先删除%system32/drivers/下的npf.sys文件 7、2.进入注册表删除 8、HKEY_LOCAL_MACHINE/SYSTEM/CurrentControlSet/Services/Npf服务。 9、同时删除 10、HKEY_LOCAL_MACHINE/SYSTEM/ControlSet001/Enum/Root/LEGACY-NPF 11、HKEY_LOCAL_MACHINE/SYSTEM/ControlSet002/Enum/Root/LEGACY-NPF 12、 3.删这两键时，会提示无法删除，便右键，权限，设everyone控制，删除。 13、 14、 a. 在设备管理器中, 单击”查看”-->”显示隐藏的设备” b. 在设备树结构中,打开”非即插即用….” c. 找到“NetGroup Packet Filter Driver”或“NetGroup Packet Filter” ,若没找到,请先刷新设 备列表 d. 右键点击“NetGroup Packet Filter Driver”或“NetGr oup Packet Filter”菜单,并选择”卸 载” e. 重启windows系统 f. 删除“%windows%\System32\drivers\npf.sys”（window xp系统目录为：“C:WINDOWS\ System32\drivers\npf.sys”） 3、删除”命令驱动(驱动程序即添加到操作系统中的一小块代码，其中包含有关硬件设 备的信息)程序发ARP欺骗包的控制者”
病毒滴度测定完整版本
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。 第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ； 第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL； 第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ； 依次类推… 第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ； 第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ； 换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。 稀释计数法 滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。 第一天细胞准备 将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。 第二天加病毒 在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。 吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。 第三天追加培养液 在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。 第四天观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X 和Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。 定量PCR 法 病毒感染1 天前，取6 孔板接种HOS 细胞。每孔细胞为5×100 000 个。 接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。 弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5 μg/mL polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200 倍，也就是取1 μL 病毒加入到199 μL 的培养基中。在3 个培养孔中分别加入0.5 μL，5 μL 和50 μL 的稀释病毒。 感染开始后20 小时，除去培养上清，换为500 μL 含DNaseI 的新鲜培养基。在37℃消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2 mL 正常的培养基，继续培养48 小时。 用0.5 mL 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在37℃放置1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组DNA 。每个样品管中加入200 μL 洗脱液洗下DNA 。用DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA 可以稳定保存在-20℃至少两个月。 准备PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ： Forward primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n Reverse primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n Probe （100 pmol/mL)：0.1μL ×n 水：19.7 μL ×n n = number of reactions。例如：总反应数为40，将1 mL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，4 μL forward
手工清理病毒原来可以如此简单
手工清理病毒原来可以如此简单 2007-12-14来源: 进入论坛 编者按：当大家看到这个题目的时候一定会觉得手工杀毒真的很简单吗？笔者写这个文章的目的就是让所有菜鸟在面对病毒的时候能轻而易举的狙杀掉它，而不是重装系统，或者在重装N次系统以后无奈的选择格式化，结果却依然无法将讨厌的病毒驱逐出你可怜的电脑。今天我们以今年泛滥比较严重的病毒之一的“AV终结者”的手工清理方法来像大家讲述如何手工清理这类非感染exe文件类型的病毒（本次讲述的办法在清理完病毒源头以后借助专杀工具依然可以适用于清理感染exe类病毒）。 第一步：知己知彼，百战百胜 要战胜AV终结者，我们先要了解自己的处境和它的特性还有弱点。首先我们来了解下AV终结者的执行以后的特征： 1.在多个文件夹内生成随机文件名的文件 旧版本的AV终结者在任务管理器里可以查看2个随机名的进程，新的变种文件名格式发生变化，目前我遇到过2种。 一种是随机8个字母+数字.exe和随机8个字母+数字.dll；另一种是6个随机字母组成的exe文件和inf文件。不管变种多少它们保存的路径大概都是如下几个： C:\windows C:\windows\help C:\Windows\Temp C:\windows\system32 C:\Windows\System32\drivers C:\Program Files\ C:\Program Files\Common Files\microsoft shared\ C:\Program Files\Common Files\microsoft shared\MSInfo C:\Program Files\Internet Explorer 以及IE缓存等 这个是我个人总结出来的，随着病毒的变种。获取还有其他的。我这里只提供参考。 2.感染磁盘及U盘 当你的系统中了AV终结者，你会发现你的磁盘右键打开时将出现一个”Auto”也就是自动运行的意思，此时你的电脑已经中毒了，而且如果你这个时候企图插入移动硬盘、U盘，或者刻录光盘以保存重要资料，都将被感染。这也就为什么许多用户重装完系统甚至格式化磁盘以后病毒依然的原因。 当你重装完系统，必定会有双击打开硬盘寻找软件或者驱动的时候，这个时候寄生在你磁盘根目录内的Autorun.inf文件就起到让病毒起死回生的功能了。这绝对不是耸人听闻哦！ 3.破坏注册表导致无法显示隐藏文件 我们一起来看看磁盘里的Autorun.inf，因为此时你的系统已经无法显示隐藏文件了。这个也是AV终结者的一个特征，所以我们这里用到几条简单的dos命令。 开始菜单-运行-输入“cmd”来到cmd界面，输入“D:” 跳转到D盘根目录，因为AV是不感染C盘根目录的，再输入“dir /a”显示D盘根目录内的所有文件及文件夹。“/a”这个参数就是显示所有文件，包含隐藏文件。如图：
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),
滴度检测方法
慢病毒滴度检测方法 空斑测定法 空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。 1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。 2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。 稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。 注意：每次稀释时都必须换用新枪头。 3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。 4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。 5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。 结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。 50%组织培养感染剂量法 此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。 细胞准备： 1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。 2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。 3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。 5.8.3.2 准备稀释病毒液 1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。 2．上下吸打5次混匀。 3．换用新枪头。 4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。
常见木马病毒清除的方法
常见木马病毒清除的方法 来源：互联网 | 2009年09月23日 | [字体：小大] | 网站首页 由于很多新手对安全问题了解不多，所以并不知道自己的计算机中了“木马”该怎么样清除。虽然现在市面上有很多新版杀毒软件都可以自动清除“木马”，但它们并不能防范新出现的“木马”程序，因此最关键的还是要知道“木马”的工作原理，这样就会很容易发现“木马”。相信你看了这篇文章之后，就会成为一名查杀“木马”的高手了。 “木马”程序会想尽一切办法隐藏自己，主要途径有:在任务栏中隐藏自己，这是最基本的只要把Form的Visible属性设为False、ShowInTaskBar设为False，程序运行时就不会出现在任务栏中了。在任务管理器中隐形:将程序设为“系统服务”可以很轻松地伪装自己。当然它也会悄无声息地启动，你当然不会指望用户每次启动后点击“木马”图标来运行服务端，，“木马”会在每次用户启动时自动装载服务端，Windows系统启动时自动加载应用程序的方法，“木马”都会用上，如:启动组、win.ini、system.ini、注册表等等都是“木马”藏身的好地方。下面具体谈谈“木马”是怎样自动加载的。 在win.ini文件中，在[WINDOWS]下面，“run=”和“load=”是可能加载“木马”程序的途径，必须仔细留心它们。一般情况下，它们的等号后面什么都没有，如果发现后面跟有路径与文件名不是你熟悉的启动文件，你的计算机就可能中上“木马”了。当然你也得看清楚，因为好多“木马”，如“AOL Trojan 木马”，它把自身伪装成command.exe文件，如果不注意可能不会发现它不是真正的系统启动文件。 在system.ini文件中，在[BOOT]下面有个“shell=文件名”。正确的文件名应该是“explorer.exe”，如果不是“explorer.exe”，而是“shell= explorer.exe 程序名”，那么后面跟着的那个程序就是“木马”程序，就是说你已经中“木马”了。 在注册表中的情况最复杂，通过regedit命令打开注册表编辑器，在点击至:“HKEY-LOCAL-MACHINESoftwareMicrosoftWindowsCurrentVersionRun”目录下，查看键值中有没有自己不熟悉的自动启动文件，扩展名为EXE，这里切记:有的“木马”程序生成的文件很像系统自身文件，想通过伪装蒙混过关，如“Acid Battery v1.0木马”，它将注册表 “HKEY-LOCAL-MACHINESOFTWAREMicrosoftWindowsCurrentVersionRun”下的Explorer 键值改为Explorer=“C:WINDOWSexpiorer.exe”，“木马”程序与真正的Explorer之间只有“i”与“l”的差别。 当然在注册表中还有很多地方都可以隐藏“木马”程序， 如:“HKEY-CURRENT-USERSoftwareMicrosoftWindowsCurrentVersionRun”、“HKEY-USERS****SoftwareMicrosoftWindowsCurrentVersionRun”的目录下都有可能，最好的办法就是在
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下
恶意插件务必清除,介绍几种手工清除方法
20种恶意插件手工清除方法 如今，恶意软件及插件已经成为一种新的网络问题，恶意插件及软件的整体表现为清除困难，强制安装，甚至干拢安全软件的运行。下面的文章中就给大家讲一部份恶意插件的手工清除方法，恶意插件实在太多，无法做到一一讲解，希望下面的这些方法能为中了恶意插件的网友提供一定的帮助。 1、恶意插件Safobj 相关介绍： 捆绑安装,系统速度变慢,没有卸载项/无法卸载,强制安装,干扰其它软件正常运行, 清除方法： 重新注册IE项，修复IE注册。从开始->运行 输入命令 regsvr32 actxprxy.dll 确定 输入命令 regsvr32 shdocvw.dll 确定 重新启动，下载反间谍专家查有没有ADWARE，spyware，木马等并用其IE修复功能修复IE和注册表，用流氓软件杀手或微软恶意软件清除工具清除一些难卸载的网站插件。 到https://www.360docs.net/doc/507812096.html,下载KillBox.exe。在C:\Program Files\Internet Explorer\目录下，把LIB 目录或Supdate.log删除。 跳窗网页可能保留在HOSTS，一经上网就先触发该网址为默认，就会自动打开，检查HOSTS： 用记事本在C:\WINDOWS\system32\drivers\etc\目录下打开HOSTS 在里面检查有没有网址，有则删除。 或在前面加 127.0.0.1 保存后屏蔽掉。 如果是弹出的信使： 从开始->运行，输入命令： net stop msg net stop alert 即终止信使服务。 2、恶意插件MMSAssist 相关介绍： 这其实是一款非常简便易用的彩信发送工具，但它却属于流氓软件!并采用了类似于木马的Hook(钩子)技术，常规的方法也很难删除它，而且很占用系统的资源。 清除方法： 方法一：它安装目录里第一个文件夹有个.ini文件，它自动从 https://www.360docs.net/doc/507812096.html,/updmms/mmsass.cab下载插件包，包里有albus.dll文件，UPX 0.80 - 1.24的壳，脱掉用16位进制软件打开发现这个垃圾插件利用HOOK技术插入到explorer和iexplore中，开机就在后台自动运行。 安全模式下，右键点击我的电脑-管理-服务-禁用jmediaservice服务，删除C:\windows\system32下的Albus.DAT，删除C:\WINDOWS\SYSTEM32\DRIVERS下的Albus.SYS，删除彩信通的安装文件夹，开始-运行-regedit-查找所有MMSAssist并删除，如果怕注册表还有彩信通的垃圾存在，下载个超级兔子扫描下注册表再一一删除，你也可以试试超级兔子的超级卸载功能。 要阻止它再次安装，也很简单。彻底删除它之后，你在它原来的位置新建一个与它同名的文件夹，
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染 一、包装 1.包装细胞 ?（P11）; ? (P16) 2.病毒载体及包装质粒 病毒载体：组构建及中量提取； 包装质粒：商品化产品（?（P12）; ? (P17)）或中量提取（目前唯一使用来源）； 3.细胞转染 方法一： ?（P12）; ? (P17)； 方法二： 按照? & (.15338)进行，简要中文说明如下： a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10培养皿中，加入完全培养基至终体积10，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%； b. 293T细胞转染前2小时换上9新鲜的完全培养基； c. 用之前充分混匀，在管中加入15的混合物( ：：：的摩 尔比为1：1：1：1)，15的，用定容到500，标记为 1，温和混匀，室温孵育5分钟； d. 充分混匀，在管中加入45的和455的，标记为 2，
温和混匀； e. 将 1的溶液加到 2中，温和混匀，室温孵育5分钟； 1 ( ) 2 () 15 ( ：：：1:1:1:1)455 μl 15 μl 45 μl 500μl 500 μl 500 μl f. 将1 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100皿中，边加边摇匀。 g. 将细胞放入置于37 ℃、5 2 培养箱中培养，12小时后换 上新鲜的培养基继续培养。 h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10或利用0.45 μm 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒； 方法三： C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒（目前唯一使用方法） 4.病毒上清收集 转染后12h, 48h,72h分别收集一次； 二、纯化 方法一： (i) 病毒上清（接一、包装 4.病毒收集）. () 51 a 50% 6000 . () 21.7 a 4 M .
手工清除ms-dos。com病毒的方法
手工清除https://www.360docs.net/doc/507812096.html,病毒的方法 中毒现象：每隔30秒飞出一个飘动的图片，写着“your computer is being attacked”（您的计算机受到攻击），还不停地发出噔噔的声音。有时开机有一个进程借“regedit.exe"（注册表编辑器）发作，跳出一个象枫叶样的窗口在屏幕上晃来晃去。不能切换中英文输入，输入法失效和优盘文件夹丢失。查看各盘符根目录下有https://www.360docs.net/doc/507812096.html, 文件；查看进程有：Global.exe、keyboard、fonts.exe等进程，即可确定电脑已被此病毒感染。由于其他盘上还有病毒（如优盘上的220K病毒文件），即使格式化C盘，重装系统，稍不留意仍然会死灰复燃，前功尽弃。我单位最近因为此病毒大面积泛滥造成人人自危，由于没有专杀软件，防毒、杀毒苦不堪言，严重影响正常工作。 杀毒需要的文件： 一共有四个文件：sreng-2，冰刃IceSword122cn ，yereg-rd.bat ，yereg-rd.bat。 第一步运行“冰刃IceSword122cn”，中止该死的进程。 第二步运行“yereg-rd.bat”，删除所有病毒文件，建立免疫文件夹。
第三步运行“sreng-2”，修复注册表编辑器的关联。打开sreng-2（可能有已经过期的提示，不要紧，把系统日期修改成2007年照样可用），别的都不用做，只把“系统修复--文件关联”做一下就可以了。重复点几下，当发现 .reg 的关联变成“regedit.exe”就正常了（如果第一步没有中止进程，这里也不可能恢复）。 第四步运行“killms.reg”，导入注册表，清除注册表启动项和清除映像劫持项以及清除一些病毒残留。 总结一下几个关键点：必须先中止进程，否则根本没办法继续往下做第二步；然后是修复regedit注册表编辑器的关联，这是为做第四步创造前提条件。环环相扣，不能省略也不能提前做。 具体的杀毒方法和原理分析 关键字：global.exe、fonts.exe、keyboard.exe、https://www.360docs.net/doc/507812096.html,、tskmgr.exe、remoteabc.exe、autorun.inf、输入法丢失、找回输入法、220K文件夹、映像劫持、regedit 关联、病毒防御、病毒免疫。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
清理病毒的终极方法
清理病毒的终极方法 【摘要】计算机病毒的泛滥与层出不穷，往往使普通用户深受其害，有时候更是束手无策，也使学生如临深渊，教材中也缺少系统的解决方案。寻找反击病毒的通用方法，尽最大可能恢复系统的正常，使普通用户也能在危机的时候凭最基本的操作能自己处理此类问题，为病毒防杀软件提供纯净平台。 【关键词】病毒可疑进程 DOS 运行权 PE系统釜底抽薪备份忠告 你已经明显的感觉到你的系统出现了问题，比如打开程序缓慢，移动鼠标困难，浏览网页不顺畅，莫明其妙的跳出些窗口，正常的程序不能运行，硬盘上出现了一些你不清楚的文件与目录，但是你却束手无策，因为你的杀毒软件已经不能正常运行，你的各种流氓软件清理工具也已经失灵，甚至你想登录到一些病毒防杀治理的网站都不可能。这个时候的病毒已经一手遮天，对它产生“危害”的程序及操作它都要想方设法阻止，它在大模大样的狞笑，怎么办？去找“高人”吗，好象也可以，但恰巧“高人”有事去了，你却心急如焚；去重装系统吗，好像绝大部分人不想这么做，恐怕你也不想这么做。怎么办？自己办！ 一点预备知识。病毒本质上也是一个计算机程序，它再厉害还不能达到你对它不能进行任何操作的程度，脱离了系统环境，它的一切功能就将消失，随你来“修理”它。得不到系统的支持它没有任何威胁，只要我们不让它运行，就为我们来清理它创造了有利的条件。 病毒要挟持系统，无外乎是在杀毒软件及流氓软件清理工具掌管系统之前优先占领系统，在系统的制高点上来狙击对它自身产生“危害”的程序及操作，从而获得系统至高无上的权利，使自己随时处于保护与传播及破坏的状态。要想抢先运行，无外乎依赖系统提供的方式，都要在系统启动的时候加载自己，尽可能的利用系统存在的漏洞，既要保证系统工作又要使自己隐身其中，都要在内存及系统的关键位置留下蛛丝马迹，这就为我们消灭它提供了线索。摧毁其“政权”，支解它的体系，反其道而行之就是我们来发现它、战胜它的途径。下面我们就来见招拆招，练就清理病毒的终极方法。
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究 发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者） [导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品 李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者） （1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179） （2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015） 【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。 【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法 【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02 Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author) 1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 110179 2. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015 【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain. 【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay 狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。在疫苗生产的各项检测指标中，狂犬病毒毒力的测定是至关重要的，其直接关系到疫苗成品的效价和免疫效果。《中华人民共和国药典》三部（2015版）狂犬病毒滴度检测的方法推荐采用小鼠法。但是由于实验动物之间存在个体差异，实验人员操作的熟练程度等诸多因素均会影响实验结果的准确性。细胞法作为病毒滴度测定的一种替代方法，近年来广受国内外学者的青睐，其中蚀斑法、免疫荧光法等都是比较经典的实验方法。 1.材料和方法 1.1 病毒及细胞病毒株 狂犬病毒PV-2061株第18代，由辽宁成大生物股份有限公司提供，原始毒株来源于ATCC。细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）来源于中科院上海细胞库。 1.2 实验动物 昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。 1.3 主要试剂 FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体购自美国Novus Biologicals公司，浓度0.93mg/ml；新生牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。 1.4 蚀斑法 1.4.1制备单层细胞将BHK-21细胞浓度调整至1×105个/ml，接种6孔细胞培养板，长满单层备用。 1.4.2病毒滴度测定将狂犬病毒样品5倍稀释，然后进行10倍系列稀释，共6个稀释度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接种至已制备好的6孔细胞培养板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培养箱内吸附90min，每隔15min轻摇板一次，然后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，于培养箱中培养7d后，弃去覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温30min后弃去染色液，用自来水冲洗至流水无色，晾干，细胞培养板孔内蚀斑清晰可见。统计各孔蚀斑数，计算结果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。 PFU/ml=（每孔平均蚀斑数×病毒稀释倍数）/每孔接种病毒量 1.5 免疫荧光法 1.5.1制备单层细胞将Vero细胞调整浓度至1×105个/ml，接种96孔细胞培养板中，长满单层后备用。 1.5.2病毒滴度测定用细胞培养液将待测的狂犬病毒样品以10倍系列稀释，共6个稀释度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接种至制备好的96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度6孔，每块板上设正常细胞对照孔和病毒阳性对照孔，置5% CO2、37℃培养箱中培养2d后，用PBS洗板3次，室温干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后弃丙酮，置室温干燥，然后用100×稀释的荧光抗体进行染色，50μL/孔，置湿盒内37℃温育30min，洗板3次，甘油封闭，荧光显微镜下观察，计数病毒感染细胞的荧光灶数，细胞浆内有绿色特异性荧光颗粒者为阳性。正常细胞对照无特异性荧光，病毒对照阳性者为有效，以Reed-Muench法计算感染性滴度[2]。 1.6 小鼠LD50测定法 将病毒样品进行10倍系列稀释，脑内接种11～13g的小鼠，每个稀释度注射6只，0.03ml/只。连续观察14d，3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内，计算LD50。
常见病毒手动查杀
常见病毒手动查杀 计算机现在已经成为我们日常生活的不可或缺的一部分，但同时计算机病毒的泛滥也给我们的生活带来了不可估量的损失 和影响。如果计算机中了病毒，但没有联网或者杀毒软件失效时，我们该怎么应对呢，我们可以先尝试手动处理清除这些病毒，实在不行就只能重装系统了。这里我们简要介绍一下常见病毒的症状和清除方法。 本文主要介绍以下几种常见病毒的清除，其他的额可以举一反三：I－WORM/Badtrans.b病毒的清除、恶性蠕虫病毒 “I-Worm.Aliz”清除、Nimda.e病毒、I－WORM/Badtrans.b，病毒的清除、清除Sircam蠕虫病毒、清除“快乐时光”病毒、清除圣诞节病毒的方法、Win32/MTX.A.Worm病毒的清除方法、如何自行将MSIE.HTA（网路害虫）清除。 具体内容： 手工删除BackOrifice2000的方法： 首先用最新DOS版的杀毒软件开机杀毒，然后将邮箱中的带毒邮件一一删除，否则又会重复感染，该病毒传播能力极强，必须加强防范，为了预防该病毒在浏览该带毒信笺可以自动执行的特点，必须下载微软的补丁程序。 恶性蠕虫病毒“I-Worm.Aliz” 又出现Nimda.e病毒，再次更新详细解毒方案
清除方法： 1．使用干净DOS软盘启动机器。 2．执行vrvdos,查杀所有硬盘。 3．在SYSTEM.INI文件中将LOAD.EXE的文件改掉，如没有变，就不用改。正常的[boot]下的应该是shell=explorer.exe.必须修改该文件中的shell项目，否则清除病毒后，系统启动会提示有关load.exe的错误信息。 4．开启实时监测病毒防火墙。 5．为了预防该病毒在浏览该带毒信笺可以自动执行的特点，必须下载微软的补丁程序。 6．WINDOWS2000如果不需要可执行的CGI，可以删除可执行虚拟目录,例如/scripts等等。 7．如果确实需要可执行的虚拟目录，建议可执行虚拟目录单独在一个分区。 8．下载补丁。 9．病毒被清除后,在windows的system目录下的文件riched20.dll将被删除，请从WINDOWS的安装盘上或再无毒机中拷贝一份干净的无病毒的该文件，否则的话，写字板和OFFICE,WORD等程序将不能正常运行。在WINDOWS98系统下的该文件大小是：431376字节。或重装office。 Nimda病毒解决方案