微机模拟蛋白质纯化实验报告

微机模拟蛋白质纯化实验

一、实验目的：

1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。

2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。

二、实验原理：

“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。

“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。

在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排层层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。

“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。

本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。

1 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶）

3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）。

分离纯化步骤:

1 热变性：水浴温度61℃，水浴时间60min

2 离子交换：

然后进行PAGE和SDS-PAGE检测

结果分析：在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋白质的含有两个亚基。

PI大概为5.6。左右

2碱性条件下的稳定的蛋白（Windows 5号酶）

1热变性发

2离子交换

3电泳结果

4：page和sds-page检测

结果分析：PI大约为7.0。检测结果发现两条提纯结果不是很理想白色条。

2 碱性条件下稳定的蛋白（Windows 30号酶）

30号酶在52℃以下稳定，稳定pH范围5.5～10.1（碱性条件）。

分离纯化步骤:

1 热变性：水浴温度51℃，水浴时间60min

2 硫铵沉淀：初始百分饱和度20％，终末百分饱和度65％(质量分数)，收集沉淀组分

3 离子交换层析：

填料DEAE－Sephadex A-50，柱长：10cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate （2.2－8.0），pH 6.4，流速：0.3ml/min，离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。

收集从77—100管的样品进行二维电泳分析：

因杂质蛋白与目标蛋白Mr相差较大，可用凝胶层析进行进一步分离

D）凝胶层析：

填料Sephadex G-75，柱长：100cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate （2.2－8.0）pH 6.4，浓度0.02mol/L，流速：0.3ml/min，

收集后进行如下检测：

检测纯化结果：

A）二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

已达到一个点的要求。

B）PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0

用PAGE检验，已达到一个点的要求，作为对比再用SDS－PAGE检验。

C)SDS-PAGE：分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），

SDS－PAGE检验结果显示，有一条带。：

实验结果分析：

提纯效果比上两个好，只有一条白条。此蛋白质的PI约为6.8。