氮蓝四唑NBT法测超氧化物歧化酶的具体步骤

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力

一、原理

超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料；水稻或小麦叶片

（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂

1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）：

A液: 称取17.9g Na2HPO4?12H2O于容量瓶中定容至1L；

B液: 称取7.8g NaH2PO4?2H2O于容量瓶中定容至1L；

取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH 7.8 0.05M的磷酸缓冲液。

2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；

3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；

4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素（维生素B2）用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

三、实验步骤

1. 酶液提取：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液

0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素

0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。

四、结果计算

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)

上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；

比活力单位以酶单位／mg蛋白表示；

Ack照光对照管的吸光度；

AE样品管的吸光度；

V样品液总体积（ml）；

Vt测定时样品用量（ml）；

W样鲜重（g）。

蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。