抗菌抗病毒常用实验研究方法

抗菌抗病毒常用实验研究方法

细菌、病毒性疾病是目前国内外流行的主要传染病,尤其是近两年来,由冠状病毒引起的SARS及由流感病毒引起的禽流感给动物及人类带来的严重危害,是人所共知的"由于各种疫苗的不断出现,虽然一些细菌、病毒病已得到了有效的控制,但是其治疗尚无有效的解决方法因此研制高效、低毒的新型中药抗菌、抗病毒制剂已成为巫待解决的问题。

1、常用的抗菌方法

1、1稀释法

1、1、1试管稀释法

培养基内抗生素的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌，经孵育后，观察能引起抑菌作用最低抗生素浓度，称最低抑菌浓度(MIC)为该菌对药物的敏感度。稀释法所获得的结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。如以下黄贝贝等的青钱柳抗菌作用的实验研究和黄利权等的火绒草的抗菌活性研究的实验方法:

1、应用试管稀释法,测定青钱柳提取物对试验菌的抑菌效果,检验不同浓度下青钱柳提取物对细菌、霉菌的抗菌作用。结果:青钱柳提取物在体外对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用;而对大肠埃希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不明显;对黄曲霉、烟曲霉等霉菌的抗菌作用不明显[1]。

2、采用试管稀释法,分别测定了火绒草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇提石油醚部分、醇提乙酸乙酯部分、醇提正丁醇部分、醇提水溶部分等7种提取物对大肠杆菌C83882、大肠杆菌C8390

3、大肠杆菌C8391

4、沙门氏菌C79-20、金黄色葡萄球菌Newbould S-30

5、金黄色葡萄球菌临床分离株等6株病原菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。试验结果表明,火绒草醇提物及其石油醚部分和乙酸乙酯部分对两种金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,其MIC为0114 mg/ml生药浓度,MBC为0127 mg/ml生药浓度,而其它部分对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱。火绒草醇提正丁醇部分和水溶部分对3株大肠杆菌和1株沙门氏菌具有较强的抑制作用,其MIC为2170 mg/ml生药浓度,MBC为2170 mg/ml 生药浓度,显示了较强的抗菌活性[2]。

1、1、2肉汤稀释法

以水解酪蛋白(M-H)液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC)。

如刘菁菁的研究蓝玉簪龙胆对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA) 的体内外抗菌活性。蓝玉簪龙胆分别以乙醇、氯仿、正丁醇、蒸馏水提取，得到极性不同的4部分产物，利用肉汤稀释法测定其对 MRSA 和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌( MSSA) 的最低抑菌浓度( MIC) ; 体内实验部分: 采用腹腔注射 MRSA 法建立小鼠感染模型，分别给予蓝玉簪龙胆水提液高、中、低剂量，银黄胶囊治疗 15 d，并与模型对照组比较，观察存活率。结果：体外实验: 蓝玉簪龙胆各极性组分对 MRSA 和 MSSA 菌株均有不同程度的抑菌作用，其中正丁醇组分抑菌作用最强，其次为乙醇、水层组分; 体内试验: 除了蓝玉簪龙胆大剂量组，其余各治疗组存活率均高于模型对照组，而蓝玉簪龙胆中剂量组存活率最高。结论蓝玉簪龙胆对 MRSA 和 MSSA 均具有一定的抗菌作用，而且敏感性差异无显著性; 对MRSA 感染小鼠有一定治疗作用[3]。胡景玉等为了了解衡水地区大肠埃希菌的药

敏情况，采用肉汤稀释法18种抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）并计算其MIC

50

和

MIC

90

。结果亚胺培南、哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦显示良好的抗菌

作用，其MIC

50分别为0.5 μg/ml、1 μg/ ml、0.5 μg/ ml；MIC

90

均为2 μg/ml，

其他药物显示不同程度的耐药，且大肠埃希菌产ESBLs的检出率较高。结论检出的大肠埃希菌存在多重耐药，仅对亚胺培南、哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦普遍敏感[4]。Kianbakht S等通过肉汤稀释法研究刺蒺藜不同部位（果、茎叶、根）的甲醇提取物对金黄色葡萄球菌ATCC 29213、粪肠球菌ATCC 29212、肠埃希氏菌ATCC 25922、绿脓杆菌ATCC 27853四种细菌的抗菌能力，研究结果表明：果、茎叶对四种菌的MIC值均为2mg/ml；根的甲醇提取物对MIC值对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肠埃希氏菌均为4mg/ml，对绿脓杆菌的MIC值为2mg/ml[5]。

1、1、3琼脂平板稀释法

将不同浓度的抗菌药物，分别加入到定量的琼脂培养基中，混匀，制成固体含药平皿，使每一个平皿中所含抗菌药物的浓度相差2倍，用多点接种仪把待测细菌点种到含有抗菌药物的琼脂培养基的表面上，在特定温度下培养适当时间后，平皿上无菌落生长的最低药物浓度为抗菌药物对受试菌种的最低抑菌浓度。每一次实验都应用标准菌株做质控。琼脂平板稀释法本法的特点是可同时进行大量菌株的药敏测定。也适用于中草药和厌氧菌的药敏测定。

如汪黎虹等应用超微粉碎法将虎杖、石榴皮、马齿苋、苦楝皮、大黄等10种中药进行加工处理至粒径为5~10μm后，利用琼脂稀释法测定其实验室近年来收集的患病鳗鲡中分离得到的18 株常见致病菌的抑菌作用。结果表明: 上述10种中药单用对除B12 肺炎克雷伯菌以外的17株养殖鳗鲡主要致病菌均有一定的抑制作用，其平均抑菌浓度( MIC) 范围为0. 165~128 mg /mL，平均杀菌浓度(MBC) 范围为0. 210~128 mg /mL[6]。

1、1、4浓度梯度法

浓度梯度试验是一种定量的抗生素药敏测定技术，可用于非苛养革兰阳性和阴性需氧菌(如肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌和肠球菌)以及苛养菌(如厌氧菌、肺炎链球菌和嗜血杆菌)的药敏测定。该系统包含有一个预先制备好的抗生素浓度梯度，可用于在琼脂培养基判断某抗生素对微生物的最小抑菌浓度(MIC)。如刘芳等的武汉地区住院患儿感染肺炎链球菌的耐药状况。

如刘芳等的收集医院2009年1-12月住院患儿分离的肺炎链球菌1521株, 采用纸片扩散法及E-test法进行抗菌药物敏感试验;按CLSI 2008 年版判断结果；使用X2检验分析耐药性的变化。研究结论为武汉地区住院患儿分离的肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素及磺胺甲噁唑、甲氧苄啶的敏感率极低, 对左氧氟沙星及万古霉素均有极高的敏感率, 对青霉素仍保持较高的敏感率, 可作为治疗普通肺炎链球菌感染的首选药物[7]。

1、1、5 试管两倍稀释法

试管两倍稀释法取生长浊度达9×108mg/ml菌液，菌液用培养液稀释，接种于无菌试管中，然后加入不同浓度的抗菌药物或未知药物，37℃孵育。16～24 h，以无细菌生长的最低浓度为MIC。将无细菌生长的完全清晰液再移种于不含抗菌药物的血平板中，经37℃过夜培养，菌落数不超5个的平板的最低药物浓度即为该药物的MBC。一般以MIC来评价细菌对药物的敏感度。

马加庆等的采用试管两倍稀释法观测利胆止痛胶囊在体外对甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌及痢疾杆菌、大肠杆菌和沙门菌生长

的影响．研究结果表明：利胆止痛胶囊对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、痢疾杆菌和大肠杆菌的MIC 分别为25、50、50、25 和12.5 mg/mL，对沙门菌无明显抑菌作用[8]。

1、1、6微量肉汤稀释法

微量肉汤稀释法的原理：原理同肉汤稀释法。石功名等的对西他沙星与莫西沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌ATCC25923的活性进行体内外研究，采用微量肉汤稀释法检测药物的MIC，MBC及MPC，研究结果表明：在体外实验中，MIC，MBC，MPC及时间与浓度杀菌曲线实验表明西他沙星胞内外抑菌活性均强于莫西沙星[9]。

1、1、7微量稀释法

微量稀释法本法为改进的试管稀释法。取稀释菌液接种在96孔板中，然后加入待试抗菌药物，混匀后放置37℃孵育16～24 h，在衬有黑底板的光线下观察，细菌生长时小孔呈弥散状混浊或在孔底部有圆形或丝状的沉淀；无细菌生长时孔内所含最低抗菌药物浓度即为MIC。把无细菌生长孔内液体移种不含抗菌药物血平板中，菌落数少5个的平板的最低药物浓度即为MBC。

如宋晓晶等通过微量稀释法分别测定特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素对38株临床分离的口腔念珠菌的体外敏感性。研究结果表明：38株白念珠菌对氟康唑耐药4株, 敏感34株; 对伊曲康唑耐药5株, 敏感33株; 对特比奈芬耐药15株, 敏感23株; 制霉菌素均敏感[10]。

1、2纸片琼脂扩散法

琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。

如熊枫等的从西太平洋近赤道区采集到的18个深海沉积物样品中分离到83株海洋真菌,采用滤纸片琼脂扩散法和MTT法分别对其发酵液乙酸乙酯抽提物的抗菌、抗肿瘤活性进行筛选.结果显示,有37株菌株对至少一种指示菌有抑制作用;有29株菌株对KB或Raji肿瘤细胞具有显著的抑制活性,分别占总供测菌株的44.6%和34.9%.在抗肿瘤活性菌株中,WP-M-1、DY-G-2、DY-C-2、WP-K-3和WP-Q-2等5株菌具有很高的活性,其发酵液乙酸乙酯抽提物对Raji细胞的IC50分别为5.000、1.064、2.796、1.920、0.520Lg/mL.研究结果表明,海洋沉积物来源的真菌中蕴藏着丰富的抗菌及抗肿瘤活性代谢产物产生菌,是开发抗菌和抗肿瘤药物的宝贵资源[11]。又如邬晓勇等的建立了蛙皮抗菌肽的活性测定方法———TTC 微量稀释法; 利用 SephadexG25 凝胶层析分离抗菌肽粗品获得一个活性组分命名为 G5，利用 TTC 微量稀释法测定活性组分 G5 抑制大肠杆菌的 MIC 是 80μg/mL、抑制铜绿假单胞菌的 MIC 是 20 μg/mL、抑制金黄色葡萄球菌的MIC 是 80 μg/mL; 活性组分 G5 再经凝胶 HPLC 分离纯化获得两个活性组分Ⅰ和Ⅱ，组分Ⅰ和组分Ⅱ再分别经过 RP-HPLC 分离纯化获得两个色谱纯的活性组分命名为 RanaⅠ和 RanaⅡ[12]。

1、3平板稀释法

如吴决等的探讨抗菌性中药药物敏感试验在鉴定中药新药上的应用。应用中药药敏试验平板稀释法鉴定中药新药/万力通0对常见十余种细菌的最低抑菌浓度(MIC).结果运用平板稀释法测定中药新药MIC,效果理想.结论在中药药敏试验诸方法中,平板稀释法鉴定中药新药抑菌作用,方法简便,易操作,结果易观

察[13]。

1、4打洞法

如向红采用平板打洞法对西南委陵菜(Potentilla fuigens)的全草、根、叶的水煎剂进行体外抗菌实验。结果表明,全草、根、叶的水煎剂对G-大肠杆菌、G-志贺氏痢疾杆菌、G+金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。不同的入药部位对同一细菌的抑菌能力不同,作用的强弱与药液浓度的大小有关;同一入药部位对不同细菌无明显选择抑制作用[14]。再如袁婷等常见中草药的体外抑菌试验，应用体外抑菌试验的平板打洞法、试管两倍稀释法和平板培养法对本地常见中草药一枝黄花、黑老虎、土甘草、花木通等进行了对肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的药物敏感性测定。结果一枝黄花对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌呈高度敏感，最小抑菌浓度分别为1/ 80 和 1/ 40，最小杀菌浓度分别为 1/ 20 和 1/ 10；对肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌呈中度敏感，最小抑菌浓度均为 1/ 20，未见最小杀菌浓度,黑老虎、土甘草均对肺炎链球菌呈高度敏感，最小抑菌浓度均为 1/ 80，最小杀菌浓度分别为 1/ 20 和1/ 10，对鼠伤寒沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用；花木通则对四种供试菌均未见抑菌作用[15]。

1、5挖沟法

如武延隽等的了解巴豆油抗菌谱。方法:采用琼脂挖沟法与琼脂绝对浓度法[3,6],对20种临床常见的病原菌和条件致病菌进行了实验室条件下,巴豆油抗菌活性研究。结果:琼脂绝对浓度法,巴豆油在1B10~1B40的浓度时,对金黄色葡萄球菌有抑制生长的作用,对其余19种细菌均无作用;琼脂挖沟扩散法,巴豆油对所有20种实验菌均无抑制生长作用。结论:琼脂挖沟扩散法实验中,巴豆油对所有实验菌均无抗菌活性,而在琼脂绝对浓度法的实验中1B40稀释的浓度对金黄色葡萄球菌仍有抗菌活性,不同方法影响巴豆油抗菌的结果[16]。

2、抗病毒方法

2、1细胞病变法(cytopathic effect, CPE)

细菌病变法是以CPE为指标,方法简便,能够对多数药物抑制病毒增殖的效果进行测定与评价。一般以加号表示细胞病变程度,细胞病变<25%为+,细胞病变25% ~50%为++,细胞病变50% ~75%为+++,细胞病变>75%为++++。

如张春江等的探讨藏药甘青乌头抗单纯疱疹病毒 II 型（HSV-2）的作用和机制。方法 MTT 法测定甘青乌头对 Vero 细胞的毒性，采用细胞病变法和蚀斑法测定甘青乌头体外抗病毒活性，以半数抑制浓度和治疗指数为评价指标；定量荧光 PCR 法和蚀斑法考察甘青乌头体外抗病毒作用机制。用 HSV-2 建立小鼠脑炎模型，对甘青乌头体内抗单纯疱疹病毒的抗病毒活性进行评价。结果：甘青乌头对 Vero 细胞的半数中毒浓度(CC50)为 5.57 g·L-1。细胞病变法和蚀斑法测得甘青乌头的半数有效浓度(EC50)分别为 2.25，1.68 g·L-1，治疗指数 TI 分别为 2.47，3.32。LD50值为 0.85 g·kg-1。甘青乌头延长了小鼠的平均存活时间，对小鼠的死亡显示出 10%的保护率。甘青乌头能直接灭活 HSV-2，能够显著抑制 HSV-2 的感染性；对病毒吸附到细胞没有抑制作用，能抑制 HSV-2 大分子的增值。抑制 HSV-2 DNA 合成的抑制倍数达 102。结论：甘青乌头体外具有较强的抗 HSV-2 的活性，抗病毒作用是通过抑制病毒复制循环的各个环节起作用的[17]。

2、2 染料吸收法

2、2、1 MTT染色法

MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成紫色不溶性结晶(颗粒)并沉积在细胞内或细胞周围,而死细胞则无此功能。二甲基亚砜(DMSO)或酸化异丙醇能溶解细胞中的紫色不溶性结晶物,用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光密度值(OD),可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成量与细胞数成正比,因此可用于抗病毒药物的活性筛选。

如付光发等的中药鸭拓草提取物抗病毒作用的研究。在96孔培养板单层培养vero细胞,将鸭拓草提取物按照倍比关系稀释,浓度分别为25.6mg/ml 12.8mg/ml 6.4mg/ml 3.2mg/ml 1.6mg/ml 0.8mg/ml 0.4mg/ml 0.2mg/ml 0.lmg/ml,每一稀释浓度都要重复3次,同时设正常细胞对照,观察细胞病变,采用MTT法,在培养过48h的细胞中,加入含MTT培养液5mg/ml,每孔0.01ml,继续培养4一6h后,加入二甲亚矾,每孔0.lml,测定其在570nm波长下的吸光度。将Vero细胞生长呈单层孔培养板上,加入100而TCro50HZN3型病毒液,每孔加入0.lml,lh 后,除去病毒液,加入TCS(12.80mg/ml)的1/10倍稀释出5个浓度的鸭拓草提取物,再以4倍倍比稀释,即分别为1280、320、80、20、5vg/ml,并设病毒对照,细胞对照,受试药物和阳性药物对照组用此法检测病毒抑制率,按照Probit回归法计算IC50[18]。又如Kruse PF, Patterson等的采用MTT法评价清热消炎复方制剂体外抗柯萨奇病毒(CVB3)、呼吸道合胞病毒(RSV)效果。方法:待正常细胞长成单层,用病毒感染,培养一定时间后,根据不同病毒感染细胞出现细胞病变(CPE)时间的不同,加入一定量的MTT液,然后测定OD570值,计算病毒抑制率。结果:MTT 法较光镜CPE法更为客观,能以OD值变化反映药物对病毒的抑制程度,从而获得实验结果,且便于统计学处理。结果证明MTT法是一种能广泛应用于抗病毒药物筛选和评价的方法[19]。

2、2、2 中性红染色法

中性红染料吸收法的原理是活细胞能够吸收一种弱阳离子染料)))中性红,后者与活细胞胞浆中的阴离子结合而滞留于活细胞中,并不被细胞洗涤液洗脱,渗入活细胞的中性红量与活细胞数量成正比,因此OD值直接反映活细胞的数量,与细胞增殖的程度成正比。

一般根据各组之平均OD值,计算抑制百分率,再按Reed andMuench法计算IC50。

抑制百分率=实验组平均OD值-病毒对照组平均OD值\细胞对照组平均OD 值-病毒对照组平均OD值勤x100%

如高川等的探讨白颖苔草粗提物对呼吸道合并胞体病毒(RSV)、甲型流感病毒(Flu A)和柯萨基病毒B3(Cox B3)的体外抑制作用。方法:采用超声提取,获得药物粗提物,以HEK293-RSV、MDCK-Flu A和HEK293-Cox B3体外感染模型,通过显微镜下观察细胞病变,酶标仪测定中性红染色A540值,计算抑毒指数评价抗病毒效果。结果:白颖苔草丙酮-乙酸乙酯粗提物可抑制RSV和Flu A的细胞病变效应,抑毒指数分别为14.22和92.41,对Cox B3病毒的抑毒指数为1。结论:白颖苔草对RSV和Flu A具有显著的抑制作用,而对Cox B3无抑制作用[20]。再如褚秀玲等采用中性红染色法检测人参皂苷及其衍生物抗马立克病毒作用的研究，研究结果表明先加中药后感染病毒时, 人参皂苷和衍生物7表现出较强的抑制病毒活性作用；先接病毒后加中药时, 人参皂苷和衍生物7表现出较强的抑制病毒活性作用；病毒和药物混合感作后加入细胞时, 衍生物7, 8,2表现出较强的抑制病毒活性作用；综合3种加药试验结果,中药抑制病毒活性作用由强到弱的顺序依次为衍生物7、人参皂苷、衍生物2、衍生物1、衍生物6和衍生物8[21]。

2、3蚀斑减少法

实验证明,将病毒接种于单层培养细胞,数天后固定细胞并染色,因病毒感染而导致变性的细胞不被染色,形成蚀斑(空斑)。蚀斑降低法以此为基础,利用蚀斑的形成,以接种病毒后,在未添加试验药物的培养基上形成的蚀斑数为100%对照,通过计算添加试验药物的培养基上形成的蚀斑减少率,来研究试验药物的抗病毒活性。通常用于对照的蚀斑数为50-100个。超过该范围,药物的感受性即降低,且会影响实验结果。另外蚀斑缩小也是抗病毒活性的指标。因此,蚀斑降低法是一种定量测定法,理论上一个蚀斑代表一个有感染性毒粒。药物处理后,蚀斑数减少,表示病毒复制受到抑制,子代毒粒产生减少。蚀斑降低法定量准确,结果可靠。用一系列药物浓度,可得到剂量反应曲线,适用于不同药物抑制强度的比较。由于操作较复杂。需较多细胞及药物,不适合初筛,可作为二筛或有效药物的效价评估。

2、4病毒抗原的测定

有些病毒不产生细胞病变或蚀斑,或者产生细胞病变过程较慢,如乙型肝炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒等。病毒复制过程可产生各种病毒基因编码的蛋白质,如表面糖蛋白、衣壳蛋白、酶蛋白及调控蛋白等,这些蛋白为病毒的结构蛋白或功能蛋白,出现于病毒繁殖周期的不同阶段,均可作为病毒复制程度之指征。利用抗原、抗体特异结合的免疫学原理,用特异抗体检测某一特异抗原,尤其单克隆抗体的应用,更明显地提高了免疫检测法的特异性。另外,可利用定量PCR、荧光定量PCR等方法测定病毒核酸。

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