胚胎干细胞体外培养
胚胎干细胞体外培养
(一)胚胎干细胞的来源
目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离
1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1
2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1
3.5～1
4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：
(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。
(3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。
由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。
(三)胚胎干细胞的培养和建系
ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
成千上万的克隆。目前建立ESCs系的方法有多种，常用方法包括以下过程：①原始ESCs 的获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑葚胚或胚泡阶段的早期胚胎，用机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑葚胚或胚泡内细胞团得到原始ESCs悬液。②ESCs的传代培养：将原始ESCs悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。培养1周左右，发现典型的ESCs集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3～5天传1次。经反复传代培养，可获得生长旺盛的高纯度ESCs。③ESCs 的鉴定。
由于ESCs来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，所以维持其生长代谢所需的营养要充足，用于ESCs培养的饲养层细胞培养基含高糖和谷氨酰胺，同时加胎牛血清、新生牛血清、2-巯基乙醇。高糖的作用是提高ESCs的增殖速度，同时提供饲养层细胞生长所需的能量；谷氨酰胺作为细胞合成蛋白质与核酸的原料，是饲养层细胞培养基的必需品；2-巯基乙醇的作用为促进胚胎细胞的分裂增殖，并可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ESCs的损害。
1.胚胎干细胞的培养体系：
(1)常规培养液：选择和配制高质量的培养基是体外培养ESCs的基本要求。常用的培养基有MEM-α、DMEM、TCM-199、F12等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。再加入10%新生牛血清、10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/ml L-谷氨酰胺。Thomson等建立恒河猴(rhesus monkey)ESCs系时，培养基中补加了1%的非必需氨基酸，结果ESCs生长良好。Gardner和Lane发现，如果培养基中含有输卵管液中高浓度表达的氨基酸成分，胚胎卵裂、囊胚形成和孵化均显著增加。
(2)无血清培养基：血清中含有大量促细胞生长因子和多种营养物质，有促进细胞生长繁殖和黏附的作用，但血清中还含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于ESCs 未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液(chemically defined medium)进行ESCs的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，发现ESCs 增殖旺盛，且能保持未分化状态。
(3)条件培养基(conditioned medium，CM)：Martin曾应用小鼠畸胎瘤多能干细胞系PSA-1的条件培养基建立了小鼠ESCs系，后Axelrod对其进行了改良：将PSA-1畸胎瘤细胞接种于STO饲养层上，在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养，达到50%～75%汇合时更换培养液，用不含血清的DMEM培养基(加有10mg/ml转铁蛋白、10mg/ml 胰岛素)继续培养24小时，收集培养液，离心，去除细胞沉淀，上清液再经过0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤后的PSA-1培养液再加入10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇，即为PSA-1条件培养基。使用前用含有10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇的DMEM培养基稀释，PSA-1细胞分泌的细胞因子等活性物质的活性基本保持不变。以后许多实验室制备了不同的条件培养基取代饲养层细胞来维持ESCs的生长，如BRL(buffalo rat liver cells)、PC10-6R转染的COS细胞、HBC-5637(5637 human bladder carcinoma cells)、RH-CM(大鼠心肌细胞条件培养基)等，这些条件培养基中都含有高浓度的细胞分化抑制因子，可以抑制ESCs的分化。
(4)饲养层(feeder layer)：饲养层是一层经过射线照射或丝裂霉素C处理后用作培养ESCs的底物细胞层。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但
仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，LIF等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制其分化，而且可以除去体外培养环境中的毒素。目前常用的饲养层有：STO、PMEF(primary mouse embryonic fibroblast)、SNL(G418R基因和LIF基因转染的STO)、HBC-5637等。其中PMEF以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用。
制备饲养层时，取达到80%汇合的原代鼠胚成纤维细胞，加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养液，作用2～4小时后，弃去培养液，用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液洗涤培养细胞4～5次后，0.125%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化制成细胞悬液，接种在涂有0.1%明胶的四孔板中。安立龙等将小鼠ESCs置于衰老饲养层表面进行培养时发现，ESC集落松散，表面及周围形成许多颗粒细胞、巨型细胞和上皮样细胞，认为衰老饲养层能诱导小鼠ESCs的体外分化，所以建议使用新鲜制备的饲养层细胞来分离培养ESCs。
2.胚胎干细胞的获取：
(1)早期胚胎细胞培养法：早期胚胎细胞培养法是将致密桑葚胚用0.3% EDTA将其离散为卵裂球，并单个培养在STO(原代胎儿成纤维细胞)饲养层上，在培养48～72小时后，出现ESCs集落。
(2)胚胎与饲养层细胞共培养法：将早期胚胎如桑葚胚、囊胚、扩张囊胚等放置在铺有STO或3T3饲养层细胞的培养液中培养，待胚胎贴壁、透明带脱落、ICM附着增生，出现鸟巢状集落时，挑出ICM，消化ICM为细胞小块，用等体积培养液或胎牛血清中和胰蛋白酶作用，将细胞小块接种在新饲养层上培养，就会获得ESCs。
(3)ICM与饲养层细胞共培养法：用免疫外科手术法剥除滋养层细胞，以STO细胞为饲养层，用ESCs条件培养基培养ICM细胞，也可获得ESCs，剥除滋养层的主要目的是防止滋养层细胞对ICM细胞的竞争抑制和诱导分化。
(4)原始生殖细胞与饲养层细胞共培养法：将原始生殖细胞PGCs接种于STO饲养层细胞表面，可获得人ESCs。从人流产胎儿生殖嵴分离和克隆人ES细胞，克服了实验材料难以取得的困难，这将会促进与人ESCs相关研究的进行。
(5)裸胚与饲养层细胞共培养：用玻璃针刺破囊胚或桑葚胚透明带，将有破口透明带的胚胎置于培养液中培养，次日，ICM就从透明带中脱出贴附于饲养层。透明带坚固、厚、不易破裂的动物胚胎贴壁缓慢，影响ICM增殖，切除透明带，有利于ICM增殖和ESCs 形成。而透明带薄，易于破裂的胚胎贴壁不受影响，切除透明带等操作对ICM有不利影响，使ESCs形成率降低。
(6)热休克处理胚胎与饲养层共培养：当胚胎在体内发育至2细胞或桑葚胚时，从子宫中取2细胞胚胎或桑葚胚，将胚胎置于41℃持续1小时，增加胚胎ICM细胞。采用热休克处理胚胎，桑葚胚发育至孵化胚的效率为87%，2细胞胚胎发育至囊胚的比率为85.0%。在胚胎分裂的活跃期用热应激处理胚胎，阻制了胚胎分化，扩大了ESCs分离的时间范围。
(7)切割胚胎培养：对早期胚胎进行切割，使胚胎一分为二。若2个半胚均含有ICM 和滋养层细胞，半胚可发育为扩大囊胚，大约有35%的半胚可贴附于子宫成纤维细胞滋养层，且对以后的胚胎和胎儿发育无影响。这表明，用切割半胚可以分离ICM和ESCs。
(四)小鼠胚胎干细胞分离培养的实验室技术
由于ESCs在一般体外培养条件极易分化而失去其多潜能性特点，故需掌握一定的培养技术才能保留其多向分化潜能和体外扩增两大特点。目前，以小鼠ESCs体外培养技术最为成熟，本文将以小鼠ESCs为例，介绍ESCs体外培养和ESCs分离鉴定等实验技术。
1.培养基的准备：
(1)ESCs培养液：以DMEM(高糖，葡萄糖含量要在4.5g/L以上)为基础液，加入以下成分：
NaHCO3 2.2g/L
谷氨酰胺2mM
非必需氨基酸0.1mM
β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)0.1mM或单硫甘油(monothioglycerol)0.15mM
庆大霉素50μg/ml或青、链霉素各100IU/ml(必要时可不加抗生素)
15%胎牛血清(FBS)或10%胎牛血清+10%新生牛血清(NBS)
LIF(leukemia inhibitory factor)，可选择性加入，用饲养层细胞饲养ES细胞时，可以不加，或加入500～1 000IU/ml，无饲养层细胞饲养时要加1 000IU/ml以上。
用超纯水或五蒸水配制，用HCl调pH7.4，过滤除菌，4℃保存备用。
目前GIBCO公司生产了一种KD-SRES细胞无血清培养液，可代替以上培养液使用。
(2)STO及MEFs细胞培养液：DMEM(含葡萄糖1.0g/L即可)，10%新生牛血清，青、链霉素各100IU/ml(或庆大霉素50μg/ml)，三蒸水配制，过滤除菌，4℃保存备用。
(3)胚胎培养液：M16或DMEM(高糖)+10% NBS+10% FCS+青、链霉素各100IU/ml。
(4)消化液：为胰蛋白酶-EDTA溶液。
胰蛋白酶干粉1.25g
EDTA 0.2g
NaCl 7.0g
Na2HPO4·12H2O 0.3g(或NaHPO4·7H2O 0.18g)
KH2PO4 0.24g
KCL 0.37g
Tris 3.0g
D-葡萄糖1.0g
庆大霉素4万IU(或青、链霉素各10万IU)
五蒸水或超纯水1 000ml
过滤除菌，0℃保存备用。
(5)冲卵液：无Ca2+、Mg2+的PBS+10%新生牛血清+青、链霉素各100IU/ml。
(6)丝裂霉素C：STO及MEFs细胞培养液加入丝裂霉素C10μg/ml，用前配制，4℃保存，不超过1周，避光。
(7)孕马血清(PMSG)及绒毛膜促性腺激素(hCG)：用单蒸水配成浓度PMSG 50IU/ml、hCG 100IU/ml，-20℃保存备用。
(8)冻存液：MEFs和STO及ES细胞培养液+10%～15%的二甲基亚砜(DMSO)，用时配制或配制后冰冻备用。
(9)PBS缓冲液：使用超纯水或五蒸水配制，高压灭菌或过滤除菌。
2. ESCs的培养：由于ESCs在体外培养过程中极易分化，故既要保持其不断增殖又要抑制其分化，则必须将其饲养在能分泌抑制因子的饲养细胞单层上或在培养基中加入分化抑制因子。ESCs的培养包括饲养细胞的培养、饲养单层制备及ESCs培养三部分工作。
(1)饲养细胞培养：目前饲养细胞有两大类：MEFs(小鼠胚胎成纤维细胞)和STO(小鼠纤维母细胞株)及已经稳定表达了白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)和neoγ的STO细胞(如SNL细胞)。
MEFs的制备和培养：
①性成熟雌小鼠(7～8周龄)与种雄鼠(8周龄以上)1∶2比例合笼，每天早上观察雌小鼠阴道口，有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)即确定为怀孕，见栓当天为怀孕0.5天。
②取怀孕12.5～14.5天的雌鼠，脱臼处死，无菌条件下暴露子宫，镊住近子宫颈端分离子宫系膜，剪断子宫角，提起整个子宫，在灭菌滤纸上吸干血迹，置入盛有PBS或无血清DMEM平皿内。
③沿子宫系膜侧剪开子宫，摘取胚胎，置入另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内充分洗涤，去除残余血迹。
④用小镊子撕破胎膜，取出鼠胚，去除胚胎头部、内脏、四肢及尾部，将躯干置入另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内，至少洗涤3次，完全去除红细胞。
⑤用灭菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm以下的碎块，吸至离心管内。
⑥加入等体积胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻吸吹30秒，制成单细胞悬液。
⑦加入等体积MEFs培养液终止胰蛋白酶的消化作用，800～1 000r/min离心5分钟，弃上清液。加入5ml左右鼠胚细胞悬液，移入培养瓶内(5个鼠胚可使用1个100～150ml 培养瓶)让细胞悬液能均匀覆盖培养瓶表面(培养液不宜过多)，37℃、5%CO2、100%湿度孵箱培养。
⑧开始培养的前2天不要晃动培养瓶，第3天细胞附着于培养瓶底壁，开始生长，更换培养液，继续培养。
⑨第4～5天，细胞连成一片，即可消化制成细胞悬液，置离心管内静置5～10分钟，取上清液即为单细胞悬液，以1∶3比例传代，一般采用3～5代MEFs作饲养细胞用。
⑩也可以将鼠胚躯干组织碎块收集于离心管后重复下列操作5～6次：加入等体积消化液轻轻吹吸30秒→加入等体积培养液终止消化→静置3～5分钟→收集上层单细胞悬液。最后弃大块组织，将收集到的单细胞悬液离心，800～1 000r/min离心5分钟，弃上清液，加入培养液分装至培养瓶内，37℃、5%CO2、100%湿度孵箱培养。每天观察，及时更换培养液和传代，同样以1∶3比例传代，3～5代作饲养细胞用。
STO细胞的培养：STO细胞是SIM小鼠纤维母细胞的一种耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系细胞，广泛用作多潜能畸胎瘤细胞和ES细胞的饲养细胞，其代替MEFs的优点是：细胞易于生长及不需要经常准备孕鼠，但是STO细胞必须保持在最适生长条件下，否则易于变异，特别是生长密度过大时。目前已有稳定转染了neoγ基因和LIF基因的STO细胞株(如SNL细胞)，可用于ESCs的转染和筛选。STO细胞的培养按一般细胞株的培养方法即可，培养液与MEFs相同。
(2)饲养单层制备：有两种方法，丝裂霉素处理法和γ射线照射法。一定剂量的丝裂霉素和γ射线能够使细胞停止分裂，但又保持生存，并分泌抑制ESCs分化和促进ESCs增殖的因子，保证ESCs的生长。
丝裂霉素处理法：
①MEFs或STO细胞融合成单层，弃培养液，加入含10μg/ml丝裂霉素C溶液(覆盖细胞单层即可)，37℃、5%CO2、100%湿度孵箱内放置2～3小时。
②吸弃丝裂霉素处理液，用PBS充分洗涤3～5次，除去残余丝裂霉素C，因其能影响ESCs的生长。
③用消化液将其消化成单细胞悬液，接种到预先用多聚赖氨酸处理过的培养瓶或培养皿内(多聚赖氨酸覆盖培养瓶或培养皿表面，室温放置2小时以上，用前吸弃多余多聚赖氨酸，直接使用或稍干燥后使用)，调整细胞密度为每毫升3×105个。
④37℃、5%CO2、100%湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。细胞如果过稀可补加丝裂霉素处理过的细胞，这样制成的饲养单层可使用6～10天，用前更换ESCs培养液。
⑤MEFS或STO细胞单层用丝裂霉素处理及PBS洗涤以后，也可以不消化直接使用。
γ-射线处理法：
①MEFS或STO融合成单层后，用γ射线照射，剂量为30～100Gy(3 000～10 000rad)。
②余下步骤同丝裂霉素C处理法。
③照射过的细胞也可以以每毫升5×106个浓度冻存备用。
(3)从小鼠囊胚内细胞团分离培养原代ESCs：
孕鼠的准备及胚胎的采集：
①性成熟前期雌鼠(昆明鼠大约4周，24～26g最好)于11∶00～1∶00或下午4∶00～6∶00腹腔注射HMG 5～10IU/只。
②46～48小时后腹腔内注射hCG 5～10IU/只，同时以1∶1比例与种雄鼠合笼。
③第2天上午观察雌鼠阴道栓，见栓者当天为怀孕0.5天。
④怀孕3.5天(即见栓第4天)雌鼠脱臼处死，无菌条件下打开腹腔，暴露子宫。
⑤镊住近子宫颈端，剪断，分离子宫系膜，并于输卵管端剪断子宫角。
⑥小鼠为双角子宫，分离后的子宫用无菌滤纸吸干血迹后置于无菌平皿内(直径35mm)。
⑦5ml灭菌注射器(平头)吸入冲卵液，从子宫角端进针，针头要保证进入子宫腔内，将冲卵液快速推入子宫腔(每侧子宫0.2～0.5ml)，胚胎连同冲卵液从子宫颈端排出，要注意用平皿接好排出的冲卵液。
⑧将盛有胚胎冲卵液的平皿置于显微镜下(50～100倍)，仔细采集胚胎。3.5天胚胎处于囊胚期，但也可能处于桑葚胚期，均可使用。
胚胎培养：
①用胚胎培养液在直径35mm平皿中做成小滴，每个直径35mm平皿可做成4个小滴，上覆盖透明石蜡油。
②收集的3.5天胚胎置入培养小滴内，37℃、5%CO2、100%湿度孵箱内培养。
③每天观察，换液每日1～2次。
④待胚胎发育为囊腔充分扩展或突破透明带时移植到MEFs或STO饲养单层(用直径35mm培养皿准备，上覆盖透明石蜡油)上继续培养，此时换上DMEM(高糖)培养液(加10%新生牛血清、10%胎牛血清和双抗)。
⑤1～2天后，胚胎贴附在饲养单层上，滋养细胞扩展成薄薄一层，将饲养细胞推开，内细胞团位于中央向上隆起生长，边缘界限清晰，表面较光滑，结构致密，3～5天后内细胞团增大，即可做内细胞团分离和早期培养。此期隔日半量换液。
(4)内细胞团细胞分离培养：
①毛细吸管的准备：将18cm巴氏德吸管在火焰上拉细，用砂轮切断末端，准备末端口径比内细胞团稍大或稍小两种。
②将内细胞团生长良好的培养皿置于显微镜下(50～100倍)，用末端口径比内细胞团稍大的毛细吸管挑起内细胞团，收集到覆盖有透明石蜡油的培养小滴内(用胚胎培养时相同的培养液制备)。
③将内细胞团收集齐后，一同置于覆盖有透明石蜡油的胰蛋白酶-EDTA消化液小滴内，用消化液洗涤1次，弃除残余培养液，加入新的消化液，37℃作用3～4分钟。
④改用末端口径比内细胞团稍小的毛细吸管，轻轻吸吹内细胞团块，至分散成2～4个细胞在一起的小团块。
⑤将含有内细胞团细胞的消化小滴吸至MEFs或STO饲养单层上(预先用丝裂霉素C 或γ射线处理)，换上ES细胞培养液。
⑥每天观察，2天后可见ESCs样细胞小集落出现，3～4天集落进一步增大，6～7天可按ES细胞培养方法进行消化传代。
(5)ESCs的培养：
饲养层培养法：
①将ESCs种植到用丝裂霉素C处理或γ射线照射后制成的饲养单层上，换上ESCs 培养液。
②37℃、5%CO2、100%湿度孵箱培养，每天观察，及时更换培养液，每2～3天以1∶3至1∶6的比例传代。
③消化时，弃培养液，PBS洗涤1次，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，以能覆盖细胞表面为度，作用30秒，弃消化液，让残余消化液继续作用，轻敲培养皿底部，细胞层出现裂隙，细胞纷纷脱落时，加入ESCs培养液，轻轻吹打至成单细胞悬液。
④正常的ESCs集落边缘清楚、表面平滑、结构致密、隆起生长、碱性磷酸酶检查强阳性。若饲养条件不适，ESCs易于分化，集落变得扁平，边缘不清楚，表面粗糙，见有较大内胚层样结构，碱性磷酸酶检查阴性。
无饲养层培养法：
①LIF的使用：于ESCs培养液中加入LIF，浓度1 000IU/ml即可在无饲养层的情况下培养ESCs。
②Buffalo大鼠肝细胞(BRL)条件培养基(BRL-CM)的使用：BRL是一种细胞株，能分泌LIF，故收集其上清液可用于ESCs的培养。方法是：以2×105个/ml浓度种植细胞，培养72小时，收集上清液，使用的培养液为不加LIF的ESCs培养液。培养上清液使用前过滤弃细胞碎片。使用时，6～7份培养上清液加3～4份新鲜不加LIF的ESCs培养液，再加入8%～10%的胎牛血清，组合成BRL-CM培养基，培养ESCs时不加饲养层，同LIF一样可保持ESCs未分化状态和多向分化潜能。
③大鼠心肌条件培养基(RH-CM)的使用：2～3周龄大鼠的心肌细胞培养上清液也有BRL培养上清液类似的作用。方法是：将2～3周龄的大鼠心肌制成单层细胞，以1∶2传代，收集5代内的培养上清液。所用的培养液为不加LIF的ESCs培养液。培养上清液使用前过滤弃细胞碎片，使用时6份培养上清液加3份新鲜不加LIF的ESCs培养液，再加1份胎牛血清，组合成RH-CM。
④无饲养层培养的ESCs，呈岛屿状生长，克隆的特征性形态更清楚。
3.ESCs的冻存与复苏：由于胚胎干细胞来源较少，这就需要通过体外扩增以获得足够数量的胚胎干细胞。但是在长期的细胞培养过程中，可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，从而导致具有优良特性的细胞系丢失，为防止干细胞丢失，胚胎干细胞在体外的合理冷冻与复苏并无限期保存将成为关键。
如需要将ESCs冷冻，最好在培养早期进行，选择细胞形态及核型均正常的细胞冷冻，并在液氮中长期保存。方法同一般细胞株的冻存与复苏方法，冻存液则是在培养液的基础上加10%～15%DMSO(最好用时配制)。复苏溶解后一定要尽快加培养液稀释冻存液，减少DMSO对细胞的毒性作用，离心，弃上清液，重新加培养液培养。
(1)ESCs的冻存：
①冷冻保护剂：冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，可分为渗透性和非渗透性两种。不同的冷冻保护剂有不同的优缺点，如DMSO虽然是一种最优先选择的、最有效的、广泛使用的冷冻保护剂，其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，但它本身有一定的毒性，可以和不溶于水的蛋白残留物起反应，导致蛋白的变性和破坏。如何充分发挥DMSO低温保护细胞的效应，又能有效降低其细胞毒性作用，是ESCs低温保存的主要问题。
②保存温度：虽然有研究表明-196℃冷冻的干细胞，细胞的增殖和分化能力改变很小，但由于程序降温，液氮保存设备昂贵、费时、难以普及，故人们一直寻求一种更简单、可靠的方法来保存ESCs。-80℃直接冷冻保存ESCs逐渐显示其优越性，并受到广泛的重视和推广。
③冷冻方法(以小鼠胚胎神经干细胞为例)：对需冻存的细胞——从胎脑和脊髓中分离到的原代细胞或经体外培养处于对数生长期的细胞进行计数，收集细胞至离心管，于4℃15 000r/min离心10分钟后吸弃上清液，按冷冻细胞所需浓度每毫升(1～2)×106细胞，定量加入预冷的神经干细胞冻存液，充分混匀后，将此细胞悬液转移到冷冻管中，每管1ml，封口做好标记。将冷冻管放入隔热的泡沫塑料盒内，直接放入-80℃低温冰箱过夜，翌日转入液氮中保存。
(2)ESCs的复苏：解冻过程也可影响到细胞的活性。许多研究已证明，复温速度越快越好，通常是在37～40℃的水浴中解冻2分钟左右，快速复温可避免重结晶现象的发生，使冻存的细胞复苏后仍保持其正常的结构和功能。
以小鼠胚胎神经干细胞为例，将冷冻管迅速由液氮转入到37～40℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免污染，不定时搅拌加速解冻。当细胞将要完全解冻时，用含70%乙醇的消毒棉擦拭冷冻管消毒，将细胞转移到含有4℃预冷的神经干细胞复苏液的试管中(按1∶10的比例)，1 500r/min离心10分钟，去除DMSO，将细胞重悬于新鲜的干细胞培养液，用培养液调节细胞至适宜浓度，并将细胞转移到细胞培养瓶，于CO2培养箱中培养。
4.ESCs的鉴定：ESCs是一种正常的胚胎性干细胞，具有正常二倍体核型、体内外分化能力及整合到宿主内细胞团并共同发育成嵌合个体的能力，但其易分化变异，引起这些能
力的减弱甚至消失，故对ESCs长期传代培养时要及时进行ESCs核型的鉴定、体内外分化能力及嵌合能力的观察，以判定ESCs是否发生分化。
(1)形态鉴定：ESCs胞体较小，核大，有1至多个核仁，细胞致密，细胞间无界限，ESCs集落形似鸟巢，集落周边整齐，与饲养层界限分明。
(2)核移植：ESCs最重要的特性即全能性。以待测细胞作为核供体注射到去核的卵母细胞中，观测该重构胚是否能够正常发育并产生后代，进而确定是否为ESCs。这是一种最可靠的鉴定方法。
(3)核型鉴定：ESCs应具备正常的二倍体核型。高分辨率分带技术如染色体G带技术可精确地识别染色体，判断核型是否正常。
(4)碱性磷酸酶(AKP)活性检测：ESCs中AKP具有较高的活性，而在已发生分化的ESCs中AKP的表达骤然降低，甚至是不表达，故可以通过AKP活性检测来判断ESCs是否发生了分化。用染色液固蓝RR或固绿B盐、萘酚AS-TR磷酸盐进行鉴定，阳性染色细胞为红色，阴性无色。
(5)Oct-4活性检测：Oct-4是维持细胞多能性的一个重要转录因子，是POU家族成员。有资料表明缺乏Oct-4的胚胎在附置后不久死亡，因为其ICM不能正常发育，OCT-4是细胞具有全能性的标志。ES细胞中含有OCT-4基因，经OCT-4基因产物的免疫荧光检测ESCs可呈阳性着色。
(6)体外分化能力观察：将ESCs按常规方法消化，但不要吹打成单细胞悬液而让其保持团块状。移至无饲养层培养瓶(皿)内，培养液中不加LIF，胎牛血清浓度降至10%。按常规培养条件培养，每天观察，轻轻晃动培养瓶(皿)或用吸管吹打，每天2～3次，不让ESCs团块贴壁和粘连在一起，必要时更换部分培养液。
每天观察，一般3天左右ESCs团块开始分层，外部一层是较大的内胚层样细胞，内部细胞小而紧密，为外胚层样细胞和干细胞。此时为简单类胚，培养至5～10天，分层增多，并逐渐出现囊腔，最终细胞团胀大成圆泡状，为囊状胚。
如果细胞团贴壁并且分化，长出如上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞等多种细胞，将这些细胞团挑出固定，可初步了解其分化时间和分化能力的强弱。
不同的ESCs分化能力不同，根据其分化程度的不同，可初步了解其分化能力的强弱。
(7)体内分化能力的观察：
①取生长良好的ESCs，按常规方法消化制成单细胞悬液。
②800～1 000r/min离心5～10分钟，弃上清液。
③加入少量培养液，调成高浓度细胞悬液(约1×108个/ml)。
④取同种小鼠，腹股沟注射ESCs高浓度悬液，每只鼠约1×107个细胞。或接种裸小鼠腹股沟皮下，每只鼠1×106个细胞即可。
⑤小鼠接种细胞后放回笼内饲养，约2周腹股沟注射处出现肿块，4～5周后，肿块进一步增大，处死小鼠，摘除肿块。
⑥肿块一部分固定，切片，染色，观察；另一部分消化制成单细胞悬液(方法同MEFs 的制备)体外培养。继续观察，切片中可见属于各个胚层的分化组织，如各种上皮组织、神经纤维、角质化的复层扁平上皮、肌肉组织、软骨、硬骨、腺腔、神经管以及干细胞巢等，为畸胎瘤结构，恰如将小鼠胚胎异位移植后的结果。体外培养的细胞见有多种细胞生长，如上皮细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、成纤维细胞、心肌细胞以及干细胞集落等等。
⑦腹腔注射，剂量同腹股沟接种。见小鼠腹部逐渐胀大，2～3周后，处死小鼠，打开腹腔，可见大小不一畸胎瘤肿块游离或粘连在肠系膜上。同样可摘除固定、切片、染色以及体外培养，观察方法同上。
(8)嵌合能力观察：将ESCs注射到宿主囊胚腔内，可与宿主内细胞团细胞发生整合共同发育成个体，即嵌合体(chimera)。来源于不同动物品系的ESCs，有不同的遗传特点，通过这些遗传特性的观察，可确定ESCs是否整合、分化、发育，目前最常用的方法是对新生个体毛色的观察。
①确定ESCs的来源及选择宿主鼠品系：大多数ESCs来源于129品系小鼠。129小鼠毛色为野灰色，应选择白化体鼠(如BALB/c)和非野灰色鼠(如C57BL/6)；也有来源于C57BL/6鼠的ES细胞，则应选白化体鼠(如BALB/c)和野灰色鼠(如129鼠)，产生的嵌合体应是花色鼠，被毛是白色和野灰色或黑色相间，眼睛虹膜为野灰色或黑色。
②准备3.5天受体囊胚(同前)。
③生长良好的ES细胞消化制成单细胞悬液。
④应用显微注射仪将ESCs注射到受体囊胚腔，每个囊胚5～10个ES细胞。
⑤将注有ESCs的囊胚移植到假孕鼠子宫腔，使之发育并产下个体，鉴定嵌合情况(图16-1)。
图16-1 嵌合体的制备过程
5.操作注意事项：
(1)定期将未分化的细胞集落从已分化的细胞中分离出来并接种到新的培养基上。
(2)转移细胞时尽量快，以免细胞发生解离和死亡。
(3)分离细胞集落时使每个部分含5～10个细胞，否则细胞过多将导致分化，细胞过少则克隆的效率低。
(4)由于ESCs 是对各种内毒素最为敏感的细胞，故要重视培养液和血清的质量。
(5)重视原始饲养层细胞的质量，没有原始饲养层细胞所在的胚胎干细胞将在7～10天内分化或死亡，若原始饲养层细胞质量差，则不能有效地抑制ESCs 的分化而导致培养增殖失败。
6.技术问题讨论：
(1)培养液：ESCs的培养液比较特殊，需要使用高糖的DMEM，葡萄糖的浓度要在24.8mmol/L(4 500mg/L)以上，要加上巯基β-乙醇(0.1mM)或单硫甘油(0.15mM)，有时还要补充丙酮酸钠(1mM)和谷氨酰胺(2mM)以及非必需氨基酸(0.1mM)和抑制分化的LIF。血清浓度也较高，用10%胎牛血清和10%新生牛血清或用15%胎牛血清。碳酸氢钠的用量2.2g/L比3.7g/L可能效果更好。配制培养液必需使用无细菌内毒素污染的超纯水或五蒸水。细菌内毒素是一种脂多糖，是革兰阴性菌的细胞壁成分，很低浓度也会影响ES细胞的增殖。离子交换柱使用时间久，细菌会生长在树胶的表面并释放内毒素到过柱的超纯水中，故用玻璃蒸馏水器制备的五蒸水可能比用离子交换柱制备的超纯水要好。超纯水和五蒸水要现用现制备。目前GIBLO公司生产一种无血清ESCs培养液，可代替传统的培养液。血清成分复杂，不利于整合到ESCs基因组中的外源性基因功能的测定，所以无血清培养基更好。
(2)血清：使用胎牛血清作为ESCs培养液的组成部分。选择一批最适于ESCs生长的胎牛血清很重要，一旦确定最好批次，最好贮备同批足量血清备用。可在平板皿内(每6cm 平皿最多种植1×103个细胞)，培养液加入待测血清，每批血清设定5～6个平皿。另置一平皿测定血清毒性(血清加至30%浓度)。培养7～10天，当肉眼可见ESCs克隆时，去培养液，用PBS洗涤ES细胞，2%美蓝(methylene blue)染色2～5分钟，检测克隆的形态，平板效率应在5%～10%之间。
(3)消化液及细胞消化：使用胰蛋白酶-EDTA和无Ca2+、Mg2+磷酸缓冲液的混合体作为消化液，ES细胞之间结合较一般细胞紧密，使用的胰酶和EDTA的浓度都较一般消化液高，一般使用的浓度是：胰酶0.125%和EDTA 0.02%，胰酶的浓度甚至可高达0.5%。消化传代时，一定要将ESCs克隆消化成单个细胞，多细胞黏附在一起的团块易于分化。
(4)LIF：LIF也称DIA(differentiation inhibiting factor)是一种能抑制ESCs自发性分化的分泌型多肽细胞因子，它通过Src激酶、JAK激酶、有丝分裂原激活蛋白家族及信号转导子和转录子(STAT)来维持ESCs未分化状态。正常的STO及稳定转染了LIF表达质粒的STO细胞皆能分泌LIF。纯化的LIF完全能代替STO细胞及小鼠胚胎成纤维细胞，但LIF很昂贵。在灵长类动物实验中发现，单独使用LIF不能完全抑制ESCs分化，而使用饲养层即可维持ESCs的不分化状态，说明灵长类动物和啮齿类动物ESCs之间存在差别。此外饲养层细胞除了分泌LIF外，也许还分泌另外一些能促进ESCs细胞增殖的因子，故许多的实验室继续使用饲养细胞。
(5)MEFs：使用MEFs的最大优点为来源丰富以及早期培养除了能产生抑制ESCs分化的因子外，也产生一些促ESCs生长的因子。但使用MEFs也有以下几方面缺点：①其生命周期有限，不能长久传代。②培养代数增多，其分泌抑制分化因子和促生长因子能力减弱，甚至消失，在3～5代时使用最为理想。③无耐药性，不能用于外源性基因转染的ESCs 筛选，筛选时可用整合有neoγ基因的STO细胞以及培养基中加入LIF代替MEFs。制备MEFs的小鼠任何品系都可以，但胎数最多的是远交系及F1代小鼠。④也产生一些促ESCs 生长的因子。MEFs和STO单层制备时，种植的细胞密度很重要，建议使用以下密度：STO 5×104/cm2，MEFs则是STO的1.5～2倍，即(0.75～1)×105/cm2。饲养单层使用前要检查是否完全铺满培养皿底。
(6)石蜡油：内细胞团细胞早期培养使用石蜡油。有些研究者认为使用前不需要高压灭菌，因为高压灭菌可能会增加毒性。每批石蜡油使用前要做毒性检查，方法为胚胎培养观察胚胎发育情况甚至观察培养后胚胎移植情况。
(7)支原体的检查：ESCs、饲养层细胞要定期做支原体污染检查。
(8)ESCs培养方法：饲养ESCs的方法有饲养层培养法和无饲养层培养法，皆能很好地维持ESCs未分化性和多潜能性，但饲养层细胞会影响整合到ESCs基因中的外源性基因功能的测定，而且无饲养层培养免去了饲养层细胞培养和饲养单层制备的繁琐工作，故无饲养层培养法可能会比有饲养层培养法更佳。
总之，ESCs的分离与培养是极其复杂的实验室技术，目前的培养条件尚不能避免ESCs 的分化，而且随着培养周期次数的增多，ESCs的稳定性也会下降。因此，如何改进培养条件和培养技术是ESCs研究中急需解决的问题。
知识来源：邓晓惠主编.生殖医学技术及其彩色图谱.济南：山东科学技术出版社.2004.第207页.
胚胎干细胞培养有新法
胚胎干细胞培养有新法 2010-12-22 来源：科技日报责编：杨婷 据美国每日科学网12月19日报道，美国研究人员发现，利用软凝胶基质代替硬培养皿来培养小鼠胚胎干细胞，无需添加昂贵的生长因子，便可让干细胞培养物长时间维持同质的多能状态。研究人员表示，这一技术在未来的再生医学中有着巨大的应用前景。相关论文发表在《公共科学图书馆·综合》杂志上。 干细胞研究面临的主要障碍就是如何让小鼠胚胎干细胞培养物保持一种均一的多能状态。多能干细胞可自发地分化成皮肤或者肌肉等不同的组织类型，长期以来，科学家都是利用一种被称作生长因子的化学物质来维持干细胞的多能态不变，但即便如此，培养出来的干细胞还是会很快进入各自的分化阶段，呈现出不同的基因表达和形态，这种多样性分化使得干细胞培养物很难被诱导生成所需的特定组织。 该研究负责人之一、伊利诺伊大学基因组生物学研究所动物科学教授田中哲也表示，可以从培养一群同质的未分化细胞入手，诱使其分化成特定的细胞类型以实现临床应用。 研究小组发现，多能小鼠胚胎干细胞喜欢“抱团”黏附在一起，而处于群体边缘、与坚硬的培养皿接触的细胞分化速度相对较快，于是他们决定对小鼠胚胎干细胞进行机械学研究而非化学研究。由于干细胞比成熟细胞要柔软10倍，研究人员猜测是否是培养皿和细胞之间的机械力刺激了细胞分化，并通过前期研究证实，即使很小的机械力也可诱导细胞分化。 接下来，研究小组将小鼠胚胎干细胞分成3组进行平行试验：第一组用加入了生长因子的常规培养基培养；第二组采用与这些细胞同样硬度的软凝胶基质进行培养，并加入生长因子；第三组同样用软凝胶基质培养，但没有加入生长因子。结果显示，即使缺乏生长因子，利用软凝胶基质培养的干细胞在3个多月传代20次后仍能表现出更明显的同质性和多能性。 研究合作者、伊利诺伊大学机械科学和工程系教授王宁(音译)说，这体现了事物的两面性：机械力能够诱导分化，但如果降低培养基和干细胞之间的机械力，就可以将干细胞保持在多能状态。这项研究证实了在干细胞分化过程中力学环境的重要性不亚于化学生长因子。在活的有机体中，细胞只在短期内分泌生长因子，而机械力则始终在影响每个细胞。 研究小组下一步打算利用这种新技术来培养诱导多能干细胞(iPS)，虽然iPS 细胞医学应用前景广阔，但也是出了名的难以培养。田中哲也说：“我们可以试
干细胞临床试验研究管理办法(试行)
附件1 干细胞临床试验研究管理办法（试行） （征求意见稿） 第一章总则 第一条为保证干细胞临床试验研究过程规范，结果科学可靠，保护受试者的权益并保障其安全，根据《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》和《药物临床试验质量管理规范》等相关法律法规，制定本办法。 第二条本办法所指干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞临床试验研究，是指在临床前研究基础上，应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后回输（或植入）人体，用于疾病预防和治疗的临床试验研究。这种体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、修饰、干细胞（系）的建立、诱导分化、冻存及冻存后的复苏等过程。用于干细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞以及诱导的多能性干细胞。成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织，以及发育相伴随的组织（如脐带、羊膜、胎盘等）来源的造血干细胞、间充质干细胞、各种类型的祖细胞或前体细胞等。 第三条干细胞临床试验研究必须具备充分的科学依据，其预防和治疗疾病的预期优于现有的手段，或用于尚无
有效干预措施的疾病，优先考虑威胁生命和严重影响生存质量的重大疾病，以及重大医疗卫生需求。 第四条干细胞临床试验研究必须在干细胞临床研究基地进行，干细胞临床试验研究基地由卫生部和国家食品药品监督管理局组织进行遴选和确定。 第五条干细胞临床试验研究基地（法人单位）是干细胞临床试验研究的责任主体。申报单位对干细胞制剂质量及相关研究活动负责。 第六条干细胞临床试验研究应当按照《药物临床试验质量管理规范》要求，遵守以下原则： （一）符合临床试验研究伦理原则，保护受试者、捐献者生命健康权益； （二）符合技术安全性、有效性原则，即风险最小化； （三）符合干细胞制剂质量要求的原则； （四）认真履行有效知情同意的原则； （五）有益于促进公众健康的原则； （六）干细胞临床试验研究透明化原则； （七）保护个人隐私的原则。 第七条开展干细胞临床试验研究，不得向受试者收取费用，不得市场化运作,不得发布干细胞治疗广告。
胚胎干细胞的体外诱导分化模型
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
干细胞知识产品手册
干细胞知识小册子 一、干细胞的美好未来 二、干细胞-------神奇的“万能细胞” 三、干细胞衰老与疾病的发生 四、干细胞与疾病的治疗 五、干细胞与抗衰老 六、干细胞--无创逆龄，定格青春 七、Q＆A 一、干细胞的美好未来 2017年8月27日，湖南卫视原创科技栏目《我是未来》邀请干细胞领域大咖、中国科学院广州生物医药与健康研究院院长裴端卿教授等嘉宾，聚焦干细胞技术的发展及应用，为大家带来了一次生动趣味的生命科技知识科普。节目中，裴端卿教授以浅显易懂的语言，向大家着重介绍了什么是干细胞，干细胞的作用以及未来能给人类带来哪些前所未有的变化，让我们见识到了科学技术的发展带给生命的无限可能性。人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来！ 1、细胞衰弱老化---衰老和死亡的真相 我们的身体是由数十万亿（40-60万亿）亿细胞构成的，随着时间的迁移，我们人体里面的细胞开始老化，这个衰老的过程，会使器官与组织在功能上的衰退，导致机体的死亡。 生命的起始从受精卵的分裂形成开始，胚胎干细胞分化发育成身体的各个组织器官，随着时间的迁移，胚胎干细胞彻底消失，人体内的干细胞种类只有成体干细胞。成体干细胞的最大作用就是在机体受到损伤时进行修复，替代凋亡的组织细胞。随着年龄的增长，成体干细胞的功能慢慢丧失，数量也逐渐减少，到最后完全消失，生命也就走向了终点。 2、干细胞——“长生不老”的秘诀 所谓干细胞，就是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生人体各种组织器官的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
随着时间的迁移，人体细胞会开始老化，而衰老的过程会造成器官与组织在功能上的衰退，那么延缓细胞的衰老出发点就是干细胞，干细胞是生命的起源细胞。大量科学研究发现，干细胞的分化是一个可逆的过程，如果人体细胞能够逆转到干细胞的水平，那么人类的寿命将得以延长。 3、干细胞——再生医学的源泉 除了延长寿命，干细胞还可以培育和再生器官，这就意味着当人们身体的某一器官出现了问题，都可以用再生器官进行替换。 利用干细胞具有的向机体其他细胞分化转变的潜在能力，再生性和再造性地修复各种变性、坏死性、损伤性、代谢性和退行性病变，恢复病损或退化组织器官结构和功能的一系列临床干细胞移植治疗技术和再生保健技术被称为再生医学。通俗理解，再生医学就是让人类的组织或器官再生。 节目现场，教授们展示了由诱导多能干细胞培育出来的牙齿组织，现场的每一位观众都惊叹不已。教授们表示，目前我们可以通过牙齿的再生来了解细胞如何变成组织、组织又怎样变成器官，将来再发展到诸如肝脏的再生、肾脏的再生等等，可以在临床上得到应用。他们认为当拥有这些技术之后，人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来。 4、我们没有理由质疑美好的未来 干细胞技术是攻克传统医学所不能及的重大疾病的一种全新医疗技术，是当今和未来再生医学的研究热点和发展方向，已被列入“人类十大科技进展”之首和国家重大科技专项。科学给予人们希望，而这种希望又不断激励着人们追求更美好的生活。随着科学界对于干细胞领域的深入研究，未来干细胞在治疗疾病与健康保障方面将有更大的作为。干细胞领域研究的不断前进将为人类带来更加美好的未来。 二、干细胞-------神奇的“万用细胞” 干细胞具有再生各种组织器官潜在功能，所以，其在医学界又被称为“万用细胞”。也正是因为干细胞这一特点，使其成为了21 世纪再生医学的基础，更是成为当前科技的前沿和热点。理论上来讲，干细胞可用于多种疾病的治疗，如糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。也正是干细胞这种潜在的价值，引起了各国学者研究探索的兴趣。
胚胎干细胞体外诱导分化综述
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
胚胎干细胞培养SOP
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP) 一、细胞 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。 3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。 二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基 ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGRO 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤
干细胞临床试验研究项目管理办法试行实施细则
干细胞临床研究管理办法（试行） 第一章总则 第一条为规范和促进干细胞临床研究，依照《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》等法律法规，制定本办法。 第二条本办法适用于在医疗机构开展的干细胞临床研究。 干细胞临床研究指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病预防或治疗的临床研究。体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、诱导分化、冻存及复苏等，不包括基因水平的操作。 第三条干细胞临床研究必须遵循科学、规范、公开、符合伦理、充分保护受试者权益的原则。 第四条开展干细胞临床研究的医疗机构（以下简称机构）是干细胞制剂和临床研究质量管理的责任主体。机构应当对干细胞临床研究项目进行立项审查、登记备案和过程监管，并对干细胞制剂制备和临床研究全过程进行质量管理和风险管控。 第五条国家卫生计生委与国家食品药品监管总局负责干细胞临床研究政策制定和宏观管理，组织制定和发布干
细胞临床研究相关规定、技术指南和规范，协调督导、检查机构干细胞制剂和临床研究管理体制机制建设和风险管控措施，促进干细胞临床研究健康、有序发展;共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会，为干细胞临床研究规范管理提供技术支撑和伦理指导。 省级卫生计生行政部门与省级食品药品监管部门负责行政区域内干细胞临床研究的日常监督管理，对机构干细胞制剂和临床研究质量以及风险管控情况进行检查，发现问题和存在风险时及时督促机构采取有效处理措施;根据工作需要共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会。 第六条机构不得向受试者收取干细胞临床研究相关费用，不得发布或变相发布干细胞临床研究广告。 第二章机构的条件与职责 第七条干细胞临床研究机构应当具备以下条件： （一）三级甲等医院，具有与所开展干细胞临床研究相应的诊疗科目。 （二）依法获得相关专业的药物临床试验机构资格。 （三）具有较强的医疗、教学和科研综合能力，承担干细胞研究领域重大研究项目，且具有相对稳定、充分的项目研究经费支持。 （四）具备完整的干细胞质量控制条件、全面的干细胞临床研究质量管理体系和独立的干细胞临床研究质量保证
2020年中国的生命科学(干细胞篇)
2020年中国的生命科学（干细胞篇） 【字体：大中小】https://www.360docs.net/doc/5412562621.html, 时间：2010年1月18日0 来源：生物通 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 摘要：以10年作为一个周期展望未来正在流行，正值2010年，21世纪的头10年刚过去，这10年中国不仅经济取得巨大的发展，生命科学也精彩无比，然而这只是生命科学精彩序幕的开始，更精彩的演绎且看下个10年。 生物通报道，以10年作为一个周期展望未来正在流行，正值2010年，21世纪的头10年刚过去，这10年中国不仅经济取得巨大的发展，生命科学也精彩无比，然而这只是生命科学精彩序幕的开始，更精彩的演绎且看下个10年。 无论是经济、国防甚至是科技领域，不少来自国外的声音都提出中国将称霸的口号！正如笔者不久前看的一篇警世文章中提及的一般，看GDP不能仅看数量，更应该看质量，我们看到中国这些年在科学领域SCI文章的数量的同时也该看到质量，具体就不赘述（有兴趣请看上一篇文章：2020年中国的生命科学世界）。 本篇文章我们将谈谈2020年中国可能在生命科学哪些领域取得可观的成绩。 干细胞 为什么干细胞要放在第一个谈呢？不可否认地，干细胞是目前基础研究、再生医学研究领域中最热门的话题。就连对生命伦理要求严苛的美国、欧洲各国都忍不住克服重重阻碍，企图在干细胞研究领域取得长足的发展。
从美国解禁胚胎干细胞研究，到NIH批准多株胚胎干细胞系成为合法研究株可窥见一斑，更有甚者，不少科学家认为如果再不解禁，美国可能在干细胞领域失去第一的地位，在科技发展日新月异的年代，再要追赶恐怕望尘莫及。 此外，美国不仅在基础研究方面解禁了胚胎干细胞，在临床上，2009年FDA 批准了2个临床胚胎干细胞试验开展计划。这些都说明，美国在胚胎干细胞领域准备大展拳脚。 除了传统的胚胎干细胞，干细胞领域还包括一种可规避伦理问题的新领域：iPS（诱导多能干细胞）。iPS创始人之一James Thomason就是来自美国威斯康辛大学麦迪逊分校的。这个只用成体细胞就能诱导类胚胎干细胞的技术成为干细胞领域的新星。 中国的2020年 干细胞领域的重要性不言而喻，如果你留意，看看2009年新立项的973及重大研究项目名单就能发现问题。 在2009年973项目中，干细胞领域就是立项最多的一个。“973计划”，意味着国家重点基础研究规划项目。每次期限为5年，从2010年到2020年的这头5年，干细胞就占有举足轻重的地位，不难想象2020年，干细胞一定会取得长足的发展。 基础研究方面 北大的邓宏魁教授，广州生物医学与健康研究院的裴端卿教授，中科院动物所的周琪教授，NIBS的高绍荣教授等等，这些干细胞领域内的前沿科研工作者在2008年、2009年已经取得了不错的科研成绩。
胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
生物选修三胚胎工程整理
胚胎工程 第1节体内受精和早期胚胎发育 一、概念 1. 胚胎工程：指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。（经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求） 二、知识结构 精子发生→精子获能 受精→胚胎发育 卵子发生→卵子准备 （一）精子的发生 1. 发生时间：雄性动物从初情期（相当于人的青春期），直到生殖机能衰退，生殖细胞不断增殖，精子不断产生。 发生部位：睾丸曲精管内 2. 发生过程：（各种家畜，大体分为三个阶段）： 第一阶段：（曲细精管管壁的）精原细胞有丝分裂→大量精原细胞→部分形成初级精母细胞第二阶段：初级精母细胞连续两次分裂（减数分裂的MI和MII） 1个初级精母细胞→2个次级精母细胞→4个精子细胞（含单倍染色体） 第三阶段：精子细胞变形→精子 ①细胞核→头的主要部分 ②高尔基体→头部的顶体 ③中心体→尾 ④线粒体（聚集在尾的基部）→线粒体鞘 ⑤细胞内其他物质浓缩→球状原生质滴 （二）卵子的发生 1. 发生时间：动物的胚胎性别分化后 发生部位：卵巢内 2. 发生过程： 第一阶段：【动物的胚胎性别分化后】雌性胎儿卵巢内的卵原细胞有丝分裂→增加数量→演变为初级卵母细胞→被卵泡细胞包围，形成卵泡 第二阶段：【排卵前后】减数第一次分裂→1个次级卵母细胞和第一极体→进入输卵管，准备受精 第三阶段：【精子和卵子结合过程中】减数第二次分裂，次级卵母细胞→1个成熟的卵子和第二极体
△判断是否受精的标志：卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体 ☆精子和卵子在发生上的重要区别： 哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前完成的（即胎儿时期） 注：多数不如动物的第一极体不进行减数第二次分裂形成两个第二极体。 卵子发生成熟示意图 （三）受精 一、概念 1. 受精：精子与卵子结合形成合子（即受精卵）的过程。包括会搜经前的准备阶段和受精阶段。自然条件下是在雌性的输卵管内完成。 2. 放射冠：包围在卵子透明带外面的卵丘细胞群。 3. 透明带反应：在精子触及卵黄膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应。它是防止多个精子进入透明带，引起多个精子入卵受精的第一道屏障。 4. 卵黄膜封闭作用：精子入卵后，卵黄膜会立即发生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，这是防止多精如卵受精的第二道屏障。 二、过程 1. 准备阶段1-精子获能：刚刚排出的精子，不能立即与卵子结合，必须在此行动物【生殖道】发生相应的生理变化后，才能获得受精能力。 2. 准备阶段2-卵子的准备：卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程，动物排出卵子的成熟程度不同（初级卵母细胞-如马、犬等；次级卵母细胞-如猪、羊等），但都要在【输卵 3. 受精阶段： 主要包括精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成配子结合 ①顶体反应，释放顶体内的酶，额直接溶解卵丘细胞之间的物质，形成精子穿过放射冠的通路。 ②透明带反应：穿过放射冠的精子立即与透明带接触，穿过顶体酶溶出通道后，接触卵黄膜，发生透明带反应。 ③卵黄膜封闭作用：精子与卵黄膜接触后，立即被卵黄膜表面的微绒毛抱合→精子外膜与卵黄膜融合→精子入卵→卵黄膜封闭作用 ④入卵后的变化： 精子：尾部脱离，核膜破裂→形成新的核膜→雄原核形成（比原来精子核还大）
人胚胎干细胞培养手册
人胚胎干细胞培养手册 操作指南 运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。 培养条件：温度：37±0.5℃ CO2浓度：5.1±0.6％ 相对湿度：85-100% 主要技术： 1．细胞培养： 当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。 2．培养液和材料 所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2μm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。 3．细胞处理 为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。
培养液准备： MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2μm的滤膜过滤。当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。 生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。 MEF培养液： hESCs培养液： 冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2μm的滤膜过滤,4℃保存。 明胶准备： 用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2μm 的滤膜过滤。 明胶包被： 接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。在接种MEF前吸除明胶溶液。
干细胞保健产品手册.doc
肌体抗衰产品说明 一、概述 安徽安龙科技有限公司（以下简称“安龙基因”）是清华大学施一公院士的支持下，由安龙生命科学基金和清华大学医学院共同成立的高科技生物医药企业。依托清华大学医学院强大的技术力量和平台优势，安龙基因已开发完成一系列应用于临床检测、疾病风险评估以及细胞保健等产品。2015年始，先后成立了北京安龙、安徽安龙、银川安龙、重庆安龙、潍坊安龙、安龙临检和安龙智造等分支机构，逐步开启全国化产业链布局。 二、干细胞产品 名称：肌体抗衰产品 人体的衰老，主要是因为组织细胞的老化而导致器官功能的衰退。脐带间充质干细胞具有神奇的定向分化和自我增殖能力，随血液到达全身各器官后，即可分化成相应新的组织细胞并更新衰老的细胞，恢复身体机能从而达到抗衰老的效果。 功效主要表现为抗衰功能，具体如下表所示
三、产品说明 脐带间充质干细胞 （Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs） 1 产品简介 脐带为连接胎儿和胎盘的管状结构，是胎儿和母体的血液间进行CO2和O2交换、代谢废物和营养物质交换的通道，同时一些激素和抗体等也通过脐带从母体传递给胎儿。脐带在羊膜包裹着的脐动脉、脐静脉之间充满着的疏松、凝胶状的黏膜组织，被称为华通氏胶。脐带间充质干细胞可由华通氏胶洗脱、分离出来。 2 产品特性 （1）可塑性：具有多能干性，在特定条件下，能直接参与组织器官的损伤修复和功能恢复。（2）旁分泌作用：能改善损伤处微环境，促进神经细胞的再生及修复，调节细胞免疫生物学活性。 （3）无免疫排斥，移植无需配型。 （4）脐带属于新生儿产后废弃物，没有伦理学问题。 3 脐带间充质干细胞的优点 （1）原始祖性相对更接近于胚胎干细胞，具备较强的增殖分化能力 （2）较易于分离，相对数量较多，纯化度较高 （3）没有潜伏性病毒和病原微生物污染 （4）体外扩增时培养体系能够统一，利于质控，也可制成冷冻种子细胞 4 产品技术优势 （1）运用自主研发的UC-MSCs细胞培养体系，一周内细胞可达5×107以上 （2）体外增殖严格控制在4代以内 四、适应人群 1.亚健康、高压力人群 2.预防衰老，维持机体年轻化的人群 3.免疫能力下降的人群 4.内分泌紊乱及性功能衰退人群 5.心血管系统功能退变人群 6.内脏器官功能退化人群 7.器官功能衰退骨骼运动系统退变人群 五、禁忌人群 1.高度过敏体质或者有严重过敏史者 2.休克或多脏器功能衰竭者 3.恶性肿瘤患者 4.全身感染或局部严重感染者 5.传染病患者 6.染色体或基因缺陷者 7.怀孕期、哺乳期的妇女
[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞
[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干 细胞 胚胎干细胞培养标准化操作规程6/28/01 目录 一、细胞 二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞明胶包被 细胞传代 三、体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板 体外分化方法 四、移植细胞的准备 细胞 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1、表达绿色荧光蛋白的B5-ES细胞。由Dr、 Nagy的实验室制备。 2、D3-ATCC; CRL-19
34、我们得到时大约传了17代。 3、J1-由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 4、J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。 5、表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr、 Nagy的实验室提供。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液。分装在50ml FALCON管中，，贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO 加入450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF
ECM及Matrigel使用手册
BD Bioscience Discovery Labware BD Biocoat TM产品使用指南 BD Biocoat TM Matrigel TM 基质 BD Biocoat TM细胞相关检测系统
目录 1BD Biocoat TM Matrigel TM 基质 1.1 Matrigel基底膜基质胶 (1) 1.2 高浓度HC Matrigel基底膜基质胶 (3) 1.3 人来源细胞外基质 (4) 1.4 Ⅲ型人重组胶原蛋白 (5) 1.5 高浓度层粘连蛋白/巢蛋白混合物 (6) 1.6 人胚胎干细胞专用的Matrigel基质 (7) 2BD Biocoat TM细胞检测相关系统 2.1 Biocoat肿瘤侵袭系统 (8) 2.2 Biocoat血管生成系统：内皮细胞侵袭 (10) 2.3 Biocoat血管生成系统：内皮细胞迁移 (12) 2.4 Biocoat血管生成系统：内皮血管形成 (14) Caco-2检测系统 (15) 2.5 Biocoat HTS 附录：细胞培养系统快速使用指南 (17) Biocoat TM Matrigel TM常见问题 (17)
1BD Biocoat TM Matrigel TM 基质 1.1Matrigel基底膜基质胶 BD产品货号：354230 354234 356230 356231 356234 356235 356237 储存和运输：-20度储存，干冰运输。 操作指南 BD采用专利技术，从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BD Matrigel 基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。BD Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。 BD Matrigel 基底膜基质形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。 产品特性 Matrigel基质会有色差变化（淡黄色到深红色），是由于酚红和碳酸氢盐与CO2作用引起的，但是与5％CO2平衡后色差即会减少。冻融后，轻轻摇晃试剂瓶使Matrigel分散均匀。所有操作均需在无菌环境下进行，试剂瓶瓶盖可用70％乙醇擦拭，并自然干燥。应使用预冷的移液器以保证Matrigel呈匀浆状。 细胞可在0.5mm厚度的Matrigel基质层表面生长，也可在1mm厚度的Matrigel三维基质内生长。过度稀释的Matrigel会形成非胶质的蛋白层，可以用于细胞贴壁，但不能用于细胞的分化研究。 注意：可将冻融后的Matrigel分装在多个小管，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。 Matrigel在22-35℃温度环境下快速成胶，因此溶解时在4℃冰上过夜冻融（4度时会随着温度的上升部分成胶）。所有用品在使用前需置于冰浴，必须使用预冷的移液管、吸头及小管操作Matrigel。成胶后的Matrigel可以在4℃24－48小时后重新呈液态。 推荐包被与成胶方法 注意：为了保证Matrigel基质膜的成胶性能与稳定性，稀释浓度不应低于1：3，可用无血清培养基稀释，Matrigel成胶后立即使用。 薄胶成胶方法： 1、冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。 2、将需要使用的培养板置于冰上，加入浓度为50μL/cm2生长面积的Matrigel基质。 3、在37℃放置30分钟，即可使用。 厚胶成胶方法： 1、冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。 2、将需要使用的培养板置于冰浴，将培养的细胞与Matrigel基质混合，用移液枪头使其悬浮 于基质中。加入浓度为150－200μL/cm2生长面积的Matrigel基质。 3、在37℃放置30分钟，可成胶。可以加入细胞培养的基质，也可使细胞直接生长在胶表面。薄层包被方法：