钙依赖蛋白激酶CDPKs在植物钙信号转导中的作用

钙依赖蛋白激酶(CDPK s)在植物钙

信号转导中的作用①

刘贯山　陈　珈②

(植物生理生化国家重点实验室,中国农业大学生物学院　北京　100094)

摘要　C DPK s 在植物钙信号转导中起重要作用。本文介绍了植物钙信号转导及C DPK s 的结构与生化性质,在此基础上,重点总结了C DPK s 在植物钙信号转导中的潜在调节作用,包括基因表达、代谢、离子和水分的跨膜运输、细胞骨架的动态变化、气孔运动和生长发育等,并提出了在C DPK s 研究中已达成的共识和需要解决的问题。

关键词　钙依赖蛋白激酶(C DPK s ),植物钙信号转导

R oles of C alcium -dependent Protein K inases (CDPK s)

in Plant C alcium Signal Transduction

LI U G uan-Shan CHE N Jia ②

(State K ey Laboratory o f Plant Physiology and Biochemistry ,College o f Biological

Sciences ,China Agricultural University ,Beijing 100094)

Abstract C DPK s play im portant roles in the plant calcium signal transduction.Based on plant cal 2cium signal transduction ,and structure and biochemical properties of C DPK s ,potential regulatory roles of C DPK s in gene expression ,metabolism ,traffic of ions and water across membranes ,the dy 2namics of the cytoskeleton ,stomatal m ovement ,as well as growth and development were summa 2rized.Recognitions and challenges in C DPK studies were als o put forward.

K ey w ords Calcium -dependent protein kinase (C DPK ),Plant calcium signal transduction

C DPK s 全称为钙依赖的钙调素不依赖的蛋白激酶(calcium -dependent and calm odulin-in 2dependent protein kinases ),或称类似钙调素结构域的蛋白激酶(calm odulin-like domain protein kinases )。C DPK s 是在豌豆中首先报道的(Hetherington and Trewavas ,1982),并在大豆中第一次得到纯化和鉴定(Harm on et al ,1987),它不同于动物细胞中的蛋白激酶C 和依赖于Ca 2+/CaM 的蛋白激酶。C DPK s 在植物、藻类及部分原生动物中均有存在,但在细菌、真菌、酵母、线虫和动物中尚未发现。C DPK s 在植物体内分布广泛:在器官水平上,根、茎、叶、花、果实和种子中无处不在;在细胞水平上,分生细胞、木质部细胞、花粉细胞、保卫细胞和胚细胞中均有发现(Li et al ,1998;Y ahalom et al ,1998;Nishiyama et al ,1999);在亚细胞水平上,质膜、液泡膜(Chen et al ,2002)、线粒体外膜、叶绿体类囊体膜、内质网膜(Lu and Hrabak ,2002)等膜系统和胞质、核质中均有踪迹。C DPK s 在植物钙信号转导过程中具①

②②通讯作者。Author for correspondence.E -mail :chenja @https://www.360docs.net/doc/5417802065.html,.

作者简介:刘贯山,男,1962年生,中国农业大学生物学院生化及分子生物学系博士生,现主要从事钙依赖蛋白激酶功能的研究。陈珈,女,1945年生,中国农业大学生物学院生化及分子生物学系教授、博士生导师,主要从事植物膜蛋白在逆境胁迫信号转导中作用的研究。

收稿日期:2002206203 接受日期:2002208220 责任编辑:崔郁英

①国家重点基础研究发展规划项目(G 1999011700)和国家自然科学基金资助项目(30170088)。植物学通报　2003,20(2):160～167

Chinese Bulletin of Botany

有非常重要的作用。

1　植物细胞钙信号转导

植物细胞在外界刺激下,细胞内Ca 2+浓度发生瞬间、持续或振荡变化。这些刺激包括非生物和生物刺激。非生物刺激有光、低温和高温、触摸、低渗胁迫、氧化胁迫等;生物刺激有激素ABA 和赤霉素、真菌激发子、结瘤因子等。这些刺激因素都借助细胞内钙离子作为第二信使来介导生物学反应。细胞内Ca 2+浓度的变化通过Ca 2+结合蛋白(又称钙调蛋白或Ca 2+感应器)进行识别、放大和向下游传导。通过一系列的级联传导,从而出现细胞分裂、细胞伸长、气孔运动、各种胁迫反应以及生长发育等过程。

Ca 2+结合蛋白的激活或抑制是Ca 2+信使产生后继续传递的下游事件。与动物细胞中一样,植物细胞Ca 2+信号可以通过Ca 2+结合蛋白间接调节,也可以直接调节蛋白质磷酸化,从而调节生物学功能。在植物中已鉴定出许多Ca 2+结合蛋白,其中以钙调素(CaM )和Ca 2+调节的蛋白激酶为主。在拟南芥Ca 2+调节的信号转导途径中已鉴定出约150种蛋白质,在未来几年内这个数字可能会增加到300～400种,编码这些蛋白的基因会达到预期基因数的2%(Reddy ,2001)。

钙调素是植物细胞中胞内Ca 2+最重要的多功能受体蛋白。钙调素自身并没有酶活性,只有其活化后进一步与其靶蛋白中的短肽序列结合,才能诱发其结构变化,从而调控植物的细胞分裂、伸长、生长、发育和抗逆等。

Ca 2+调节的蛋白激酶可分为4类:①C DPK s ,依赖于Ca 2+,而不依赖于钙调素,植物中最为丰富;②CaMK s (calm odulin-dependent protein kinases ),依赖于钙调素,植物中很少;③CCaMK s (calcium and calm odulin-dependent protein kinases ),依赖于钙和钙调素,仅在少数植物组织中表达;④CRK s (C DPK -related protein kinases ),既不依赖于钙也不依赖于钙调素,其催化区与C DPK s 的催化区密切相关,但EF 手性结构退化,调节功能不详(Harm on et

al ,2000)。这4类Ca 2+调节的蛋白激酶共同构成C DPK 超家族。

2　CDPK s 的结构和生化性质

2.1　结构

C DPK s 为单肽链,在结构上具有明显的特征,从N 端到C 端存在四个功能区(结构域),依次为可变区、催化区、连接区和调控区(图1)

。

图1　C DPK 的典型结构

Fig.1　T ypical structure of C DPK

N 末端的可变区长短不一(20～200个氨基酸残基),很少有同源性。

催化区由300多个氨基酸残基组成,具有典型的Ser/Thr 蛋白激酶的催化保守序列,2期刘贯山等:钙依赖蛋白激酶(C DPK s )在植物钙信号转导中的作用161　

催化区的同源性较高。

连接区由20～30个氨基酸残基组成,在各类功能区中最为保守,富含碱性氨基酸,紧靠催化区而以拟底物的方式与催化区结合起自抑制作用(Harm on et al ,1987;Weljie et

al ,2000),所以该区又称自抑制区。在无Ca 2+存在时,C DPK s 催化区可能与连接区结合,

使其激酶活性被抑制。连接区的突变能产生不依赖Ca 2+的组成型有活性的激酶(Harper et al ,1994)。

调控区是钙结合区,也是C DPK s 有别于其他类型激酶的特有区域,保守性最差。调控区有一段结构和功能类似于CaM 的氨基酸序列,共有4个与Ca 2+结合的EF 手性结构,这是C DPK s 对Ca 2+高度亲和而不依赖于CaM 的原因。在分子进化角度上,古老的C DPK s 基因可能来自于蛋白激酶和CaM 基因的融合(Zhang and Choi ,2001)。

2.2　生化性质

C DPK s 分子量一般为40～90k

D ,因为C DPK s 不同的同系物间N 端可变区氨基酸残基数目不同。酶活性的最适pH 值为7左右。

纯化的C DPK s 在mm ol/L 级Mg 2+存在下,受μ

m ol/L 级Ca 2+的激活而使活性提高50～100倍,2μm ol/L 级Ca 2+就可使酶活性达到最高值的一半。当钙激活C DPK s 时,连接区与C 末端的CaM 样结构域的相互作用非常重要,可能形成CaM 样结构域与连接区的分子内复合物,以解除催化区的抑制作用,从而激活C DPK s 活性(Weljie et al ,2000)。

C DPK s 的基因同系物很多,在拟南芥基因组中存在34种C DPK 基因,分布于所有5条染色体上(Cheng et al ,2002)。C DPK 基因的不同同系物可能与某些基因在特殊组织、生理条件或发育阶段的表达相关(Ullanat and Jayabaskaran ,2002);水稻的两个C DPK 同系物(OsC DPK 2和OsC DPK 11)在叶片对光的反应中具有不同的功能(Frattini et al ,1999);烟草

C DPK 基因(NtCDPK1)的转录本存在于根、

茎和花中,但叶片中几乎没有(Y oon et al ,1999);马铃薯C DPK (StC DPK 1)是受发育调控的,在块茎形成开始时被诱导(Raices et al ,2001)。不同的C DPK s 同系物有不同的底物特性。而且不同的同系物受Ca 2+活化所需的

Ca 2+浓度也不同。大豆C DPK α、β、γ磷酸化syntide-2所需Ca 2+的K 0.5分别为0.06、0.4、

1.0μm ol/L (Lee et al ,1998)。因此,不同的C DPK s 可能转导不同的Ca 2+信号。

由于C DPK s 没有跨膜区,因而C DPK s 与膜结合的机制一直受到关注。N 末端的豆蔻酰化是膜定位所必需的(Martin and Busconi ,2000)。许多C DPK s 的N 端都有豆蔻酰化位点(Harm on et al ,2000);西葫芦(Cucurbita pepo )C DPK 在体内被豆蔻酰化(Ellard-Ivey et al ,1999)。另外,C DPK s 的棕榈酰化也是与膜充分结合所必需的(Martin and Busconi ,2000)。

自身磷酸化对C DPK s 的激活作用尚无定论。许多C DPK s 同系物在自抑制区都有潜在的自身磷酸化位点(赖氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-丝氨酸)。落花生(Arachis hypogea )C DPK 的活性需要自身磷酸化作用,但这种作用只出现在钙浓度低的时候,因而在体内可能没有调节作用(Chaudhuri et al ,1999)。从菠菜中纯化的C DPK 在有利于磷酸化条件下温育或用磷酸酶处理,其活性没有变化(Douglas et al ,1998)。

有几个C DPK s 可结合14-3-3蛋白,其中至少有一个C DPK 的活性是通过结合14-3-3蛋白被激活的(Cam oni et al ,1998b ;M oorhead et al ,1999)。T oroser 等(1998)认为,14-3-3蛋白可能将两步连续代谢中所涉及的酶锚定在一起。

162　植物学通报20卷

虽然C DPK s 在体外能将许多蛋白底物磷酸化,但是对C DPK s 内源底物特异性及磷酸化位点知之不多。C DPK s 的许多内源底物都是通过其在体外能被C DPK s 磷酸化而推测出来的。另外,C DPK s 没有专一性的抑制性,这给研究C DPK s 带来了一定困难。富含碱性氨基酸的蛋白(多聚赖氨酸、多聚精氨酸等)、PK C 的抑制剂(鞘氨醇、K 252等)、CaM 拮抗剂(酚噻嗪、三氟拉嗪等)、Ca 2+/CaM 依赖的蛋白激酶的抑制剂(K N62、K N94等)均可作为C DPK s 的抑制剂。

3　CDPK s 在植物钙信号转导中的作用

对C DPK s 进行十几年的研究表明,不同的C DPK 同系物具有不同的内源底物,因而在钙信号转导中具有不同的生理功能。在外界信号刺激下,植物细胞出现[Ca 2+]cyt 变化。变化的[Ca 2+]cyt 激活C DPK s ,C DPK s 磷酸化相应的底物。这些底物在基因表达、酶代谢、离子和水分的跨膜运输、细胞骨架的动态变化等微观方面具有潜在的调节作用(Harm on et al ,2000),从而将钙信号向下游传导和级联放大,使植物表现出生长发育、抗(耐)非生物和生物胁迫反应等宏观变化。

3.1　参与植物的胁迫应答反应

玉米原生质体C DPK 1和C DPK 1a 能激活可被干旱和高盐胁迫诱导的启动子,而去除C DPK 1激酶区的突变体对胁迫和ABA 刺激没有应答(Sheen ,1996)。以0.2m ol/L NaCl 对玉米根尖进行盐胁迫,质膜的一种受钙激活的蛋白激酶(表现为C DPK 的特性)的活性迅速增加(陈武和陈珈,1998)。从冰叶日中花(Mesombryanthemum crystallium )中分离的C DPK (McC DPK 1)是盐和干旱诱导的(Patharkar and Cushman ,2000)。水稻中编码C DPK 的基因OsCDPK7是由冷和盐胁迫诱导的,水稻耐冷和盐/干旱胁迫的程度与OsCDPK7的表达水平密切相关;OsCDPK7的过量表达加速了盐/干旱但不是冷胁迫应答基因的诱导(Saijo et al ,2000;2001)。这些都说明C DPK s 可能在干旱和盐胁迫信号中起着正调节因子的作用,促进植物相关胁迫应答基因的表达。另外,C DPK s 在植物抗真菌的防卫应答和抗非生物的伤害应答中也起重要作用(R omeis et al ,2000;2001;Chico et al ,2002)。

3.2　参与碳氮代谢

蔗糖磷酸合成酶(SPS )是蔗糖合成途径中的关键酶,硝酸还原酶(NR )是从硝酸盐同化氮素的限速酶。这两种酶都是在黑暗中磷酸化而受到抑制的。SPS 是通过Ser 153的磷酸化直接被抑制的;而NR 是通过一个两步反应机制即Ser 543的磷酸化和14-3-3蛋白与该磷酸化位点的结合而被抑制的(Chung et al ,1999)。这两种酶的调节位点的磷酸化可能是由一种C DPK 完成的。C DPK 在黑暗中抑制SPS 和NR 的现象与夜间胞内Ca 2+浓度高于白天的观察是一致的(Johns on et al ,1995)。然而,与S NF1相关的、不依赖于Ca 2+的激酶也能磷酸化SPS 的Ser 153和NR 的Ser 543,并使其失活(Douglas et al ,1997;Sugden et al ,1999)。因此,这两类激酶在体内都可能抑制SPS 和NR ,但分属于不同的信号转导途径。

T oroser 和Huber (1997)认为,C DPK 也可以通过磷酸化Ser 424而激活SPS ,但这种依赖于磷酸化的激活作用仅出现在低渗胁迫应答中。活化的SPS 可增加胞内蔗糖的浓度,降低细胞水势,从而有助于保水。这些结果表明,由不同刺激激活的不同C DPK 途径可反向调节SPS 活性。

2期刘贯山等:钙依赖蛋白激酶(C DPK s )在植物钙信号转导中的作用163

　

3.3　参与离子和水分的跨膜运输

在C DPK s 的底物和生理功能研究中,关于跨膜运输离子和水分的蛋白占有相当大的篇幅。这些蛋白包括液泡膜上的水通道蛋白(G uenther and R oberts ,2000;Harvengt et al ,2000)、保卫细胞液泡膜的阴离子通道(Pei et al ,1996)、质膜的内向K +通道(Li et al ,1998;Berkowitz et al ,2000)、质膜H +-ATPase (Cam oni et al ,1998a )、玉米根尖质膜上的33kD 和58kD 蛋白(陈武和陈珈,1999)、内质网膜上的AC A2Ca 2+-ATPase (H wang et al ,2000;Huang et al ,2001)等。因此,C DPK s 在参与细胞膜物质运输方面具有重要作用。

3.2　参与植物细胞骨架的调节

C DPK s 参与植物细胞骨架的调节是植物细胞中发现的C DPK s 最有意义的功能之一。Putnam -Evans 等(1989)的实验表明,C DPK 在花粉管和节间细胞中与肌动蛋白微纤丝定位在一起。M outinho 等(1998)证明,正在生长的花粉管其顶端C DPK 活性高,而未生长的花粉细胞C DPK 活性在花粉管中分布一致,因而C DPK 在花粉管空间上的重新分布可预测花粉管新的生长方向。C DPK 还参与了植物细胞肌动蛋白的张力调节(G rabski et al ,1998)。因而C DPK s 可能与胞质环流、细胞器运动有关。

3.5　调节气孔运动

C DPK 调节气孔运动是由于其调节离子跨膜运输而引起的。在外界刺激(如干旱)下,ABA 浓度升高,[Ca 2+]cyt 也升高,从而激活C DPK 。通过磷酸化,C DPK 抑制质膜上内向K +通道和激活液泡膜上的K +通道,导致胞内K +净外流,因而引起气孔关闭。蚕豆保卫细胞C DPK 能在体外磷酸化拟南芥保卫细胞内向K +通道(K AT1)(Li et al ,1998)。大豆C DPK 与K AT1在爪蟾卵母细胞中共表达时,K AT1离子流大小降低,通道激活的时间增加(Berkowitz et al ,2000)。

3.6　调节生长发育

C DPK s 在种子形成和萌发过程中具有重要的调节作用(Anil and Rao ,2001a )。C DPK s 参与了檀香木(Santalum album )胚胎发育、种子形成及萌发过程,并具有不同的时空积累和活性(Anil et al ,2000);一个种子发育特异性的水溶性55k

D 的C DPK 得到了纯化和鉴定(Anil and Rao ,2001b )。水稻两个C DPK 同系物OsC DPK 2和OsC DPK 11在种子发育过程中的表达模式不同:OsC DPK 2在种子发育早期表达水平低,随后增加到高水平并保持到种子发育后期(受精20d 后);与此相反,OsC DPK 11在种子发育早期表达水平高,但从受精10d 后迅速降低(Frattini et al ,1999)。

4　小结

在C DPK s 研究中,目前已经达成以下共识:

(1)植物具有许多C DPK 同系物,这些同系物的激酶活性直接被Ca 2+激活和潜在地被Ca 2+与其他信号途径(如CaM 、cG MP 、G 蛋白、脂信号、M APK s 等)的相互作用所调节。

(2)C DPK s 具有多功能,每个同系物提供一条特殊的信号转导途径,以控制基因转录、酶代谢、膜物质运输和细胞结构等。

(3)除了C DPK s 外,植物还有与C DPK s 相关的蛋白激酶,其中有些成员受CaM 调节,而有些成员对钙完全不敏感。

164　植物学通报20卷

未来的主要挑战是描绘出C DPK s 超家族成员在植物生长发育和环境适应性调节中发挥各自作用以及相互协调的一幅完整图谱。在模式植物如拟南芥中进行下列相关研究:

(1)C DPK 同系物的钙激活阀值、抑制剂和底物特异性的差别。

(2)C DPK 同系物的基因表达的组织特异性和发育阶段特异性,以及亚细胞定位。(3)用遗传学和生物学方法鉴定C DPK s 生物学功能,如使用失去调节能力的突变体(即不依赖于Ca 2+)或过量表达的突变体以及采用基因敲除技术等。

(4)用生物信息学提供一幅植物细胞信息传递网络的全景图,即阐明与C DPK s 相关的信号转导分子途径,以及C DPK s 与植物细胞中其他信号途径的动态互作关系。

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征稿简则

《植物学通报》是1983年创刊的植物学综合性学术期刊,双月刊,16开本,每期128页,铜版纸印刷,双月下旬出版。主要刊登植物学各学科的综述与专论、研究论文、研究简报、专题介绍和技术方法,以及科学家简介及论坛,动态信息等。

11来稿需一式两份,并附作者单位同意发表的证明信,信中说明未正式发表,未一稿两投,署名无误。来稿要求用计算机打印。来稿同时需寄来审稿费80元。请来稿时附信说明联系电话及E -mail 地址。

21综述和专论的字数(包括插图、表格、参考文献在内)最好不超过10500字(7印刷页);研究报告不超过9000字;简报和“技术与方法”不超过6000字;信息动态报道500字至1500字。

31来稿应有中文英文的题目、作者姓名、单位、地名、邮政编码、摘要及3～7个关键词,中文摘要应在250字左右,不要太短或太长。中英文摘要和关键词内容应一致。文稿须经署名者签名表示同意,另请附主要作者小介(100字内,研究生的论文应有导师小介),省部级以上基金资助请注明基金名称及编号。

41文内各级标题请一律用阿拉伯数字连续编号,取左顶格编排格式,二、三级标题的编号数字之间用下圆点“.”,如“1.1”,“1.1.1”。

51文章中首次出现的植物名称后应注明拉丁学名。实验方法应以使读者明了为原则,如与前人所用相同,可注明其文献,有不同处须交代清楚,如系新方法则应详细说明。文中请使用法定计量单位。

61实验结果要求充分、可靠、有统计分析;文字部分应避免罗列与图、表重复的数字;图要用电脑绘制并激光打

印;研究论文、简报中(及综述、专论中自制的)图、表的标题要用中、英文写出,内容用中、英文或单独英文表示;照片勿

用翻拍片或复印件;综述、专论中引用的图、表应注明出处;计算机扫描的照片图必须用350线扫描,线条图必须用600线扫描,保存线数在300～396之间的tif 格式文件。

71参考文献务必核实无误,只择主要的列入,专论与综述一般不超过50条,未经公开发表的文献、资料请不要引用。在正文中引用文献时,采用作者年代方式,两位作者表示方式为‘xxx 和xxx ,年代’,三位以上(含三位)作者表示为‘xxx 等,年代’,多篇文献在一处引用,文献间用“;”隔开。如同一作者同年有两篇以上文献,在年代后应写上a ,b ,c ……字样。文后参考文献必须是正文引用的,顺序按中、日、西(英、德、法)、俄编排。中、日文按姓氏笔划,外文按姓的字母顺序排列。文献如为期刊应按:作者、年份、论文题目、期刊名称、卷期号起止页码的项目顺序写全。文章作者的名字全部列出。作者间加“,”,最后两个作者间不加“和”、“and ”等。作者一律先姓后名,名只列出其首字母,该字母后不加缩写点,空一个字母间隔。如为图书,应写明作者,出版年份,书名,编著者,出版社,起止码。

81给“国外大刊重要论文简介”栏目投的稿件,一般应在500字以内,随稿应同时寄来原文首页的复印件;原文应选用在投稿之日前半年内发表的文章。

91接到录用通知及修改意见后请在1个半月内寄回修改稿,并附信说明修改情况,与原稿、软盘一齐寄回。稿件排印后,将初校样寄作者校对,除录入错误外,最好不再改文章内容,并请在指定时间内寄回。

101编辑部对采用的稿件可在文字上作必要的删改。稿件处理情况在4个月内(自编辑部收到作者寄来审稿费之日起)通知作者。对采用稿件收取版面费:100元/页,作者在接通知后30天内将款寄至编辑部,否则按自动退稿处理;超版面部份要加50%收费;若作者要求自决定录用时起3个月刊登,加收50%的版面费,图版适当增加版面费。稿件一经刊登酌付稿酬(包括本刊光盘版和网络版稿酬)寄给第一作者或联系作者,并赠送单行本20份。

111来稿请寄:北京香山南辛村20号《植物学通报》编辑部,邮政编码100093。电话(010)62591431-6135。2期刘贯山等:钙依赖蛋白激酶(C DPK s )在植物钙信号转导中的作用167