重叠PCR
重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。
引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。
2. 分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。
3. 分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。
4. 将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq 酶进行PCR。进行PCR约5-10轮即可。
5. 取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。建议可以优化退火温度，可以做个梯度PCR。
如果认为设计引物方面没有问题，那么再考虑其它条件。
关于重叠PCR：
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重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR 技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为：
A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3
A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3
B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3
B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3
我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重叠PCR的步骤：
（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因
（2）回收A，B基因
（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B.
第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。
目前重叠PCR的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基因，其实人工合成基因最基本的技术（目前应用最为广泛的）就是利用重叠PCR的方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知道我们在使用DNA 调取或者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果，但由于绝大多数的DNA中都含有内含子，也就是说几个外显子并不是串连在一起的，而要想达到我们的目的，只要应用重叠PCR技术就可以轻松完成。
overlap 能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）
有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。
另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。
如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。TouchDown PCR 方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。Touch Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。
( KB)
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最近由于实验需要，做了两组pcr，连接了一个启动子，一个调控子，还有一个抗性基因，三天就搞定。
三个pcr片段分别为131bp, 650bp., 927bp
如果你扩增的片段特异性好，用PCR回收试剂盒回收，方便快捷。
如果有杂带，只能切胶回收了。下面从pcr引物设计，重叠pcr两个方面说一下。
1.重叠pcr引物设计
很简单，就是和你平常的引物设计一样。两个基因的引物都设计好了后，如：A基因：5…TTAAGACCCACTTTCACATT3?上游序列
5… TAGATTAGATAAAAGTAAAGTG3? 下游序列
B基因
5… CATTAATTCCTAATTTTTGTTG3? 上游序列
5… GATTTTTGTCGAACTATTC3?下游序列
把A基因的下游序列全加到B基因上游序列的5'端
把B基因的上游序列全加到A基因下游序列的5…端
就万事OK了，别想着替你老板省钱，那是让你自己找罪受！
2、重叠pcr的做法
两个基因的pcr产物回收后
20ul体系，各取1ul,其它的如加酶等一切照常，但先不加两端引物。
94度2min
94度30s
50度1min
72度1min 5个循环
72度10min
加两端引物：A基因的上游序列和B基因的下游序列
94度2min
94度30s
58度1min
72度1min 18个循环
72度10min
延伸时间视你的基因长短来确定，一般普通taq酶1kb 1min, 高保真酶
1min ,800bp
over
还有一个很重要的问题是，你们扩基因的时候要用高保真酶，用普通TAP酶会在3…末端加A，这样你重叠的时候会发生移码突变
关于Touchdown PCR
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PCR 优化的方法很多，TD-PCR代表了其中的一种。TD-PCR不应该仅仅被看作一种确定某一特定的PCR最优化循环条件的方法，而是应该看作一种潜在的一步法达到优化扩增的方法。在引物和模板特性未知的情况下，TD-PCR的应用是很有价值的。比如当引物是在氨基酸序列的基础上设计的，或对多基因家族的成员进行扩增，或者尝试做与进化有关的PCR时，也就是说从一个物种中根据同源性用引物去扩增与另一个物种中同源的一个片断时经常出现这种情况。这种情况下，引物和模板的错配可能是由于Tm值太低导致引物与模板在错误位点的结合所致。
热循环编程：
TD-PCR编程的目的是产生一系列退火温度程序降低的循环。退火温度范围的跨度约15度，从此所估计的Tm值高出几度一直到Tm值以下10度左右分布。例如，对于引物- 模板间的Tm值计算为62度时，热循环的设置是从65—50之间，每一次循环比上一次的退火温度降低1度，随后在50度进行15个循环。对于使用简并引物或者含有错配碱基的的引物进行的TD-PCR，程序运行的调整包括降低退火温度范围（例如从50度降至35度），而在最后15个循环中采用50度或更高一些的退火温度（一旦扩增开始，引物会全部补充到新合成的复制子中，会有更高的Tm值，这时低的退火温度则不利于扩增）。
这种试验方法我也是接触不久，如果PCR时按常规方法调整后，依然得不到预想的结果，建议采用TD-PCR，希望能帮你扩增出特异的条带！
循环很多TAQ酶的活力都下降了，循环数多了没用，应该从引物和其他的地方找原因扩增效率低应该注意酶、Mg浓度、降低退火温度、延长扩增时间或者做延伸温度TOUCH UP 讨论这种问题应该提供酶的种类，PCR条件、模板的类型，这样才好分析原因
同意nano的说法。以前我也遇到过同样问题，无论是优化PCR条件还是做touch down，都没有收到好的结果；后来重新换了引物才做出来。
PCR程序中最重要的就是退火温度了，如果你把所有的退火温度都试了还是扩增效率底或者没有目的片段的话，就要考虑引物的情况了，另外你的目的片段比较长，可以尝试一下用LAtaq去扩增，这个酶扩长片段有优势的，扩增体系按照酶说明书上的体系就可以了
touchdown循环数不要超过35，超过容易出现假阴性
PCR经验总结
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1. primers design
这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件
a 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量
b GC% 40%~~~~60%
c 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
d 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC
e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER
f. 避免3'端的错配
g. 避免内部形成二级结构
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补和二级结构是要加上它们
i. 需要使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)
j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设
计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg离子的作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液
b. 其他的离子
NH4+ K+都会影响PCR。增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的严谨性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的.当然, 过高的阳
离子浓度(KCL>)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR 了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度。一些高
保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性
d. template
50ul PCR SYSTEM
human gDNA -1ug
10ng-100ng
LamadaDNA -5ng
Plasmid DNA -10ng
4. termperature
a. denaturation
常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟，除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation
b. annealing
重点到了。一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险.另外,在对于一些
困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度
94 5min
94 30s
60 30s
72 1min 2cycles
94 30s
59 30s
72 1min 2cycles
94 30s
58 30s
72 1min 2cycles
........
94 30s
51 30s
72 1min 2cycles
94 30s
50 30s
72 1min 20cycles
72 5min
6. hot start PCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能
完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。
ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X105幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster.具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template 的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平
8. 循环数和长度
确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造成ERRORS和非特异性产物的积累产物的量不够, 优化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循环数
如何确定循环数,有一个方法.做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在
20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR 仪,也没有多少挑选的余地
9. thermal cycler
PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis). 10. PCR additives
附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量.在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情
况下,additive由于造成错配的primer-template 复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合gradient pcr选择最优条件.
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dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extehder (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度
11. Template DNA preparation
提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.
12. Nested PCR
简单点说设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况.
增加PCR的保真性
高保真酶
高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型：a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变
b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。其他因素
除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。