基因治疗病毒载体的研究进展

肿瘤基因治疗的最新进展

肿瘤基因治疗的最新进展 王佩星 （徐州师范大学科文学院 08生物技术 088316103） 摘要：癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。癌症的基因治疗目前主要是用复制缺陷型载体转运抗血管生成因子、抑癌基因、前药活化基因（如ＨＳＶ－１胸腺嘧啶激酶）以及免疫刺激基因。主要抗肿瘤机制为：抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导抗肿瘤免疫反应、提高肿瘤细胞对化疗的敏感性、提高肿瘤细胞对放疗的敏感性、切断肿瘤细胞的营养供应。 关键词：肿瘤、基因治疗、免疫、原癌基因、抑癌基因 The latest progress of cancer gene therapy WangPeiXing (xuzhou normal university institute of biotechnology 088316103 foremen who 2008) Abstract: the cancer is a genetic disease, its occurrence, development and recurrence are associated with genetic variation, loss, deformity related. Human body cell carries oncogenes and tumor-suppressor genes. Cancer gene therapy is now primarily with copy DCF with carrier transport antiangiogenic factors, tumor-suppressor genes, before medicine activated genes (such as HSV - 1 thymine bases kinase) and immune irritancy genes. Main antitumor mechanism for: inhibiting tumor cell growth, inducing tumor cell apoptosis, inducing antineoplastic immune response, improving the sensitivity of the tumor cells to chemotherapy, radiotherapy of tumor cells to improve sensitivity, cut tumor cells to nutrition. Keywords: tumor, gene therapy, immunity, protocarcinogenic gene, tumor-suppressor genes 从本质上来讲，癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。正常情况下，这两种基因相互拮抗，维持协调与平衡，对细胞的生长、增殖和衰亡进行精确的调控。在遗传、环境、免疫和精神等多种内、外因素的作用下，人体的这一基因平衡被打破，从而引起细胞增殖失控，导致肿瘤发生。基因治疗的策略有基因替代、基因修复、基因添加、基因失活，目前临床使用的最主要方式是基因添加。针对肿瘤的特异性分子靶点设计肿瘤治疗方案，具有治疗特异性强、效果显著、基本不损伤正常组织的优点。这种肿瘤靶向治疗是肿瘤治疗中最有前景的方案。 1.肿瘤基因治疗的历史进展 肿瘤、艾滋病、遗传病是困扰人们的三大疾病，对肿瘤的根治是人们一直迫不及待想要实现的愿望。

慢病毒载体及其应用的研究进展_毛颖佳

中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】 慢病毒载体及其应用的研究进展 毛颖佳综述郑源强石艳春审校 【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。 【关键词】慢病毒载体；基因治疗 Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their Application MAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China） 【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper. 【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy 慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。 1.慢病毒载体的发展 1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。 1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。 慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能 基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）. 作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）. 通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@https://www.360docs.net/doc/5516059860.html,

过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月

目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展

专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列

基因治疗用腺病毒载体研究进展

基因治疗用腺病毒载体研究进展 录入：wei 来源：Internet 时间：2008-9-20 【字体：大中小】〖双击滚屏〗 【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。 【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法 【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作 【正文】 基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物——蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因[1 ] , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。第二代腺病毒是复制缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒[2- 4 ]。 1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化 删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7～ 8kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。三是基因转录及DNA 复制。在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤等[5 ] , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中[6 ] , 同时提供能量(A TP) 和还原力(NADH) , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环[7, 8 ] , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。 2、腺病毒的定量和计数方法 在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。现在生产企业和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用 摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。 关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗 基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。 1 慢病毒及其载体的简介 慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。 2 病毒载体的构建 由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。 2.1 最小辅助包装元件 为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体

基因治疗研究进展_虎艳

基因治疗研究进展 虎　艳　(甘肃省张掖医学高等专科学校　734000) 摘　要　基因治疗是21世纪具有很大发展前景的新医疗技术,有望成为人类战胜疾病的利器。本文阐述了基因治疗技术的发展和应用进展。 关键词　基因治疗　载体　癌基因 基因治疗(genetherapy)是医学领域中发展起来的一项新技术,它主要是通过向靶细胞或组织引入外源基因DNA或RNA片段,来纠正或补偿基因的缺陷,关闭或抑制异常基因的表达,从而达到治疗疾病的目的。基因治疗通常包括基因替代、基因修饰、基因修正、基因抑制或失活等。上世纪80年代初,Anders on首先阐述了基因治疗的概念。1990年美国的B lease等成功地进行了世界上首例临床基因治疗,即对腺苷脱氨酶(adenosinedeam inase,ADA)缺陷病人进行了基因治疗。1991年我国首例基因治疗B型血友病也获得成功[2]。目前,基因治疗已从遗传病扩展到心血管疾病、肿瘤、神经系统疾病及传染病等。此外,基因治疗也能用于亚健康状态的治疗,如疲劳、肥胖、脱发、衰老等。然而基因治疗依然存在诸如缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和寄主产生免疫反应等一系列问题。但随着科学家对人类基因及其功能、疾病发病的分子机制研究的不断深入,不久的将来基因治疗一定会给人类健康事业带来深远的影响。 1　基因治疗的方法 基因治疗有两种途径:①把一个健康的正常基因拷贝插入病变靶细胞以补偿缺陷基因;②引入经过改造的基因来赋予细胞新的特性。目前基因治疗常用的技术有体内疗法(in vivo)和体外疗法(ex vivo)两种。1.1　体内疗法　体内疗法是将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸DNA直接导入受体体内有关的器官组织和细胞内,以达到治疗目的。这是一种操作简便易行的方法,如静脉注射、肌肉注射、器官内灌输、皮下包埋等,但其缺点是基因转染率较低,疗效短。例如在遗传性疾病的基因治疗方面,以腺病毒等为载体的体内疗法常见于囊性纤维变性(cystic fibr osis,CF)的基因治疗研究。CF为一种白种人常见的致死性疾病,是累及少数器官系统的常染色体隐性遗传病,该病是由于跨膜转导因子(cystic fibrosis trans membrane conductance regulat or,CFTR)基因发生突变导致上皮细胞氯离子通道异常,从而使肺、胃肠道、胰腺和肝胆系统等多种器官功能受损。在CF累及的器官中目前只有肺可作为基因治疗的靶器官,载体主要是腺病毒,还有脂质体、质粒和与腺相关病毒载体。1.2　体外疗法　目前研究和应用较多的还是体外疗法,即将有基因缺陷的细胞取出,在体外将外源基因导入到载体细胞,然后将基因转染后的细胞回输给受者,使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物,以达到治疗目的。例如,1991年复旦大学遗传学研究所与第二军医大学长海医院血液科合作进行的血友病B 基因治疗就是利用皮肤成纤维细胞为靶细胞的体外疗法。该方案应用XL C I X和N2C MV I XC9逆转录病毒载体转染患者的成纤维细胞,以细胞胶原悬液注射到患者皮下,使患者血浆中F I X抗原和F I X活性升高1～2倍,并持续两年以上,患者鼻出血等症状有所好转,每年所需输血次数也减少。此后又进行了2例血友病的基因治疗,跟踪4～7年未发现与基因治疗相关的毒副作用,但转入的F I X表达水平仍有待进一步提高[2]。 另外,W ils on等应用肝细胞为靶细胞的体外疗法治疗了家庭性高胆固醇血症(fam ilial hyperchlester olae2 m ia,FH)。FH是一种由于低密度脂蛋白受体(l ow density lipop r otein recep t or,LDLR)功能或表达异常所致的遗传病。W ils on等首先切除患者部分肝以获取原代培养的肝细胞,然后在体外用含LDLR cDNA的逆转录病毒载体转染后回输,经门静脉注射植入肝脏。治疗后患者血液中LDL水平较治疗前下降约30%,LDL/ HDL(低密度脂蛋白/高密度脂蛋白)之比从治疗前10～13降至5～8,这一水平维持了18个月以上。由于该方案需要切除患者约1/3的肝脏,目前已停止临床应用[2]。 2基因治疗的载体 基因治疗载体可分病毒性载体和非病毒性载体两大类。 2.1　病毒性载体　包括逆转录病毒(R t)、腺病毒(Ad)、疱疹病毒(HS V)及腺相关病毒(AAV)等。 2.1.1　逆转录病毒载体　逆转录病毒(R t)是一类可在感染细胞内将其RNA反转录为DNA的病毒。R t最大的优点是可以有效地整合到靶细胞的基因组中,并稳定持久地表达所带的外源基因,病毒基因组以转座的方式整合,其基因组不会发生重排。因此所携带的外源基因也不会改变,而且转染率高。 2.1.2　腺病毒载体　腺病毒(Ad)是一种线性双链

第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景

class2switch recombination[J].Nat Immunol,2003,4:10232 10281 6　Liddament M T,Brown WL,Schumacher AJ,et al.APOBEC3F properties and hypermutation preferences indicate activity against HIV21in vivo[J].Curr Biol,2004,14(15):1385213911 7　Wiegand HL,Doehle BP,Bogerd HP,et al.A second human an2 tiretroviral factor,APOBEC3F,is suppressed by the HIV21and HIV22Vif proteins[J].EMBO J,2004,23(12):2451224581 8　Zheng YH,Irwin D,Kurosu T,et al.Human APOBEC3F is an2 other host factor that blocks human immunodeficiency virus type1 replication[J].J Virol,2004,78(11):6073260761 9　Dussart S,Douaisi M,Courcoul M,et al.APOBEC3G Ubiquitina2 tion by Nedd421Favors its Packaging into HIV21Particles.J Mol Biol,2005,345:54725581 10　Douaisi M,Dussart S,Courcoul M,et al.The tyrosine kinases Fyn and Hck favor the recruitment of tyrosine2phosphorylated APOBEC3G into vif2defective HIV21particles.Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,329:91729241 11　Navarro F,Bollman B,Chen H,et https://www.360docs.net/doc/5516059860.html,plementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G.Virology,2005,333: 37423861 12　Marin M,Rose KM,K ozak SL,et al.HIV21Vif protein binds the editing enzyme APOBEC3G and induces its degradation[J]. Nat Med,2003,11:1398214031 13　Sheehy AM,G addis NC,Malim MH.The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV21 Vif[J].Nat Med,2003,9:1404214071 14　Kao S,Khan MA,Miyagi E,et al.The human immunodeficiency virus type1Vif protein reduces intracellular expression and inhibits packaging of APOBEC3G(CEM15),a cellular inhibitor of virus infectivity[J].J Virol,2003,77:113982114071 15　Mehle A,G oncalves J,Santa2marta M,et al.Phosphorylation of a novel SOCS2box regulates assembly of the HIV21Vif2Cul5com2 plex that promotes APOBEC3G degradation[J].G enes and devel2 opment,2004,18:2861228661 16　Yu YK,Xiao ZX,Elana S,et al.Selctive assembly of HIV21Vif2 Cul52ElonginB2ElonginC E3ubiquitin ligase complex through a novel SOCS box and upstream cysteines[J].G enes and develop2 ment,2004,18:2867228721 17　Yu X,Yu Y,Liu B,et al.Induction of APOBEC3G ubiquitina2 tion and degradation by an HIV21Vif2Cul52SCF complex[J].Sci2 ence,2003,302:1056210601 18　Kao S,Miyagi E,Khan MA,et al.Production of infectious hu2 man immunodeficiency virus type1does not require depletion of APOBEC3G from virusproducing cells[J].Retrovirology,2004, 1:272391 19　G oncalves J,Santa2marta M.HIV21Vif and APOBEC3G:Multi2 ple roads to one goal[J].Retrovirology,2004,1(1):281 20　Liu B,Yu X,Luo K,et al.Influence of primate lentiviral Vif and proteasome inhibitors on human immunodeficiency virus type1 virion packaging of APOBEC3G[J].J Virol,2004,78:20722 20811 21　Xu H,Svarovskaia ES,Barr R,et al.A single amino acid substi2 tution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resis2 tance to HIV21virion infectivity factor2induced depletion[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(15):5652256571 22　Schrofelbauer B,Chen D,Landau NR.A single amino acid of APOBEC3G controls its species2specific interaction with virion in2 fectivity factor(Vif)[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004, 101(11):3927239321 23　Bogerd HP,Doehle BP,Wiegand HL,et al.A single amino acid difference in the host APOBEC3G protein controls the primate species specificity of HIV type1virion infectivity factor[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(11):3770237741 (2003207223收稿;2003212222修回) 第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景林芳综述　蔡荣钱程审阅 【摘要】　由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体,通常称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high2capacity or gutted or help2dependent Adenovirus,HD2AdV),现将第三代腺病毒载体的特性研究进展作一综述。 【关键词】　第三代腺病毒载体;辅助病毒;Cre/loxP 作者单位:310018浙江理工大学生命科学院 第一代腺病毒载体具有稳定、滴度高、高效率转导目的基因、低致病性、不但可以转染分裂期细胞而

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含

腺病毒及其研究进展

第32卷第5期2010年10月　 　大连医科大学学报 J o u r n a l o f D a l i a n Me d i c a l U n i v e r s i t y 　V o l.32N o.5 O c t.2010腺病毒及其研究进展 陈娜娜,向冬喜,郑丛龙 (大连大学医学院病原生物学教研室,辽宁大连116622) 摘要:本文从腺病毒的分类、结构和受体等方面对腺病毒进行了介绍,同时对腺病毒的感染和致病性做了综述,并进一步介绍了抗腺病毒治疗研究进展和腺病毒载体的应用。对腺病毒多方面进行较全面的了解,有助于促进抗腺病毒药物的研发和加强腺病毒载体在基因治疗中得到更好的应用。 关键词:腺病毒;感染性;致病性;治疗;载体 中图分类号:R373.1 文献标志码:A 文章编号:1671-7295(2010)05-0586-05 A d e n o v i r u s a n d i t s r e s e a r c h p r o g r e s s C H E NN a-n a,X I A N G D o n g-x i,Z H E N GC o n g-l o n g (D e p a r t m e n t o f P a t h o g e n y B i o l o g y o f M e d i c a l C o l l e g e,D a l i a n U n i v e r s i t y,D a l i a n116622,C h i n a) A b s t r a c t:T h e c a t e g o r y,s t r u c t u r e a n dr e c e p t o r o f a d e n o v i r u s a r e i n t r o d u c e di nt h i s a r t i c l e.I t a l s o d e s c r i b e st h ei n f e c t i o n a n d p a t h o g e n i c i t y o f a d e n o v i r u s.F u r t h e r m o r e,t h e r e s e a r c hp r o g r e s s o f a n t i-a d e n o v i r u s t h e r a p y a n dt h e a p p l i c a t i o no f a d e-n o v i r u s v e c t o r a r e r e v i e w e d.W i t h t h e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f a d e n o v i r u s,i t i s h e l p f u l t o p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n t o f a n t i-a d e n o v i r u s m e d i c i n e a n dt h ea p p l i c a t i o n o f a d e n o v i r u s v e c t o r i n g e n e t h e r a p y. K e yw o r d s:a d e n o v i r u s;i n f e c t i o n;p a t h o g e n i c i t y;t h e r a p y;v e c t o r 腺病毒(A d e n o v i r u s)是从手术切除的扁桃体组织分离培养得到的一种D N A病毒,主要在细胞核内繁殖,常引起人上呼吸道和眼部上皮细胞感染。腺病毒作为普通的机会性病原体长期存在于人群中,免疫功能低下的病人感染腺病毒的机率较大,在居住密集的人群,如军队人员中可引起急性发热性呼吸道疾病的暴发流行[1]。随着免疫学、分子生物学、分子病毒学等各个学科的发展和相互渗透,腺病毒在分子水平上的应用越来越广泛,特别是有关腺病毒的感染、致病、抗腺病毒的治疗和腺病毒载体的应用已成为研究的热点。因腺病毒结构简单,宿主范围广,感染率高,易于培养和纯化,使腺病毒作为载体的基因治疗迅速发展。本文就腺病毒及其相关研究进展做一综述。 1　腺病毒的特征 1.1　腺病毒的分类 根据宿主范围不同,腺病毒分为哺乳动物腺病毒属(M a s t a d e n o v i r u s)和禽类腺病毒属(A v i a d e n o v i r-u s)。人腺病毒(H u m a n a d e n o v i r u s e s,H A d V)属于腺病毒科(A d e n o v i r i d a e),根据免疫学、生物学、生物化学特性不同,将其分为A～G7个亚种,共有52个血清型[2],不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现。 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30870681) 收稿日期:2010-06-27;修回日期:2010-07-12 作者简介:陈娜娜(1986-),女,河北邢台人,硕士研究生。E-m a i l:c h e n n a n a20080@163.c o m 通信作者:郑丛龙,教授。E-m a i l:z c l9812@y a h o o.c o m.c n

基因治疗的研究现状以及应用前景分析

基因治疗的研究现状以及应用前景分析 摘要： 基因治疗是一种通过基因水平的操作而达到治疗或预防的高新技 术。可治疗包括遗传性疾病、癌症、感染性疾病、心血管疾病和自身 免疫性疾病在内的多种疾病。近几年来基因治疗在全球范围内虽然取 得了快速发展，但也遇到了很多技术、伦理以及法律问题。未来基因 治疗的主要目 标是在法律和伦理要求范围内，开发更加安全高效的基因导入系统， 更好的服务于人类。本文主要论述了基因治疗的研究现状，并在此基 础上分析了其应用前景。 关键词：基因治疗，研究现状，应用前景 Abstract： ?Gene therapy is a new technology by which people can cute and prevent many diseases at the level of genes, such as,genetic disease,infectional disease,cardiovascular disease and autoimmune disease.At the past years , gene therapy has been developed all around the world , however , it has also come across some probloms , including technology ,laws and ethics. At the future , the main aim of gene therapy is to develop more safe and efficient gene delivery system within the limits of laws and ethics .The research status and application prospect of gene therapy are discussed in this paper.