(完整版)分子生物学实验复习题附答案

分子生物学复习题

实验一DNA的制备

（1）为什么分子生物学实施时要担心EB？

溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌)

（2）DNA加样缓冲液的用途是什么？

由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

（3）DNA电泳时所用的琼脂糖凝胶其浓度是如何决定的？

1．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

（2）琼脂脂糖的浓度不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1

（4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么

DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。

（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。

（6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？

CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来

氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁

实验二RNA的制备

1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？

应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入;

由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。

2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因

3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？

1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带：28S、18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18SrRNA条带的1.5~2倍。反之，说明部分28S rRNA已经降解成18S rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解。若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA 污染。

4.RNA制备好后通过什么方法测定其含量？

RNA通常用分光光度计测量，通常在A260的读书在0.15-1.0之间才是可靠的，A260为1相当于RNA 的浓度为40微克/ml

实验三质粒DNA的制备

1.什么是质粒？质粒有什么主要用途？

染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等

用途:把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

2.分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？

1环状DNA分子能够自我复制，或整合到染色体上，随染色体复制。

2有多个限制酶切点(便于切割)

3有标记基因(便于进行检验)

3.制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？哪种条带形式的质粒DNA其转化或转染效率最高？

三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。

实验四感受态细菌的制备及质粒DNA的转化

（1）什么是感受态细菌？感受态细菌的主要用途是什么？

感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过时细胞的状态。

感受态细菌吸收异源DNA 分子，使受体细胞获得新的遗传性状.

（2）什么是转化？转化与转染的主要区别是什么？

转化（transformation)感受态细菌捕获质粒DNA的过程

转染（transfection)细菌捕获噬菌体DNA的过程

（3）有哪些主要因素决定质粒DNA的转化效率？

1.细菌的生长状态和密度：OD006=0.3~0.5 细菌出于对数期或者对数前期

2.质粒DNA：

数量：质粒DNA不超过感受态细胞体积的5%

大小：分子量越大转化效率越低，超过30Kb的质粒DNA很难转化成功

构型：超螺旋的DNA具有较高的转化效率，重组DNA效率低一些，环状DNA相比线性DNA转化效率高一些

3.所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度

4.防止杂菌和其他外源DNA的污染

（4）质粒DNA的转化过程可分为哪几个阶段？每个阶段中主要发生了什么事件？

1吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面。

2转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解。

3自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA

4表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转录及翻译。

（5）什么是转化子？什么是非转化子？

转化子：带有异源DNA 分子的受体细胞

非转化子:不带有异源DNA(质粒) 分子的受体细胞

实验五质粒DNA的酶切与鉴定

（1）限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA 的核酸内切酶。限制性内切酶天然存在于细菌体内

（2）什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？

限制性内切酶,与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-Modification System）。用途:降解外来DNA分子，以限制（restriction）或阻止病毒侵染，是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。

（3）限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？

Ⅰ型限制性内切酶功能：限制、修饰

特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）

应用：不常用。

Ⅱ型限制性内切酶功能：功能：识别并特异切割DNA分子, 即通常所指的DNA限制性核酸内切酶。特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段。

应用：种类繁多,分子克隆最常用的内切酶。

Ⅲ型限制性内切酶限制、修饰

特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3`端24-26bp处

应用：数量很少，分子克隆中无实际作用

（4）限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？

II型限制性核酸内切酶的识别序列通常是对称的，识别位点序列长度为4-8个核苷酸对。这种对称序列称为回纹序列（palindrome）。

（5）酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？

限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。

限制性内切酶溶液通常含有50%甘油

（6）1个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？

酶活力单位的量度。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1min 内能转化1μmol底物的酶量，或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。

实验六目的基因的PCR扩增

（1）PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

（2）为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

（3）用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。

1. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。

2. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。

3. 每加一种反应物，应换新的枪头。

实验七DNA重组及转化实验

（1）什么是T-载体？

聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。

（2）什么是T-A克隆？

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。

（3）T-A克隆DNA重组实验的主要步骤有哪些？

切,接,转,增,检

（4）目前获取目的基因的常用方法有哪些？

一直接获取目的基因：

1、从供体细胞直接获取（鸟枪法--用限制性内切酶处理DNA）

2、从基因组文库中获取

二合成法获取目的基因：

1、利用mRNA反转录形成

2、人工合成即根据蛋白质的氨基酸的序列推导出mRNA的核糖核苷酸序列，再推导出DNA的脱氧核苷酸的序列，最后用化学合成法合成目的基因

3、PCR扩增

（5）蓝-白斑筛选的原理是什么？

n 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。

n 当外源片段插入到pUCm-T质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。此为α-互补现象筛选。

分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

分子生物学试题及答案

分子生物学试题及答案一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。

除了5’ 3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（ IF-2 ）和（IF-3 ）。4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。 5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（ DNA重组技术）三部分。 7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（ hnRNA在转变为mRNA 的过程中经过剪接，）、

分子生物学实验室常用试剂的配制

一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解 2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解 3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用 0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于 9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加 32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加 0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassiumacetate）：

溶解 78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）：溶解 7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）：溶解 40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至 5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（ 0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取 186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/LHEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（ 6.8- 8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至 91.4ml的水中。 25mg/mlIPGT：溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。

分子生物学实验设计报告-四川大学

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达一、引言荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省

时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。三、实验步骤 1.质粒DNA的提取实验原理： ~

分子生物学实验复习题

分子生物学实验复习题 1.实验中为什么选用RNA而非DNA作为模板调取目的基因？因为真核生物，DNA出了含有编码序列外还含有非编码序列（内含子），而我们只需目的基因这段序列。RNA是经过加工的，没有内含子，通过提取高质量的RNA再进行逆转录即可得到不含内含子的cDNA，即所需的目的基因。2.RNA提取过程中的注意事项有哪些？（1）所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗涤。（2）全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套。（3）配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理12h 以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um 滤膜过滤除菌。 3.逆转录反应，有哪几种引物可用？如何进行选择？（1）引物：OligodT：①长度适宜，一般为15~30个碱基；G+C含量，一般为40%~60%；②4种碱基应随机分布；③引物自身不应存在互补序列；④2个引物之间不应有多于4个碱基的互补；⑤引物3′端不应有任何修饰；⑥引物5′端可以修饰 4.简述用氯化钙方法制备感受态细胞转化原理？（1）正在生长的大肠杆菌在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）。（2）感受态细胞与外源质粒DNA形成一种粘着在细胞表面上的队DNAase抗性的羧基钙磷酸复合物。（3）42℃下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。（4）进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。（5）将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。 5.转化过程中要注意哪些因素细胞生长状态和密度、质粒的质量和浓度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染 6.简述质粒DNA提取原理在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性，但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，二质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA 及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 7.请列举4种阳性克隆的筛选方法和鉴定方法（一）采用遗传学方法可筛选特定的重组体DNA 1.利用抗性标记可筛选出带有载体的细菌克隆 2.利用不同标记可筛选出带有重组体的细菌克隆 ①插入灭活法利用特定抗性基因的失活进行筛选②α-互补筛选是利用功能互补的基因片段（二）核酸杂交法适合从文库中筛选特定的DNA （三）PCR技术可对特定的DNA进行直接鉴定（四）酶切鉴定是利用限制酶酶切图谱鉴定特定的DNA 8.简单谈一下如何选定酶切鉴定时所用的酶限制性内切酶的选用必须根据载体和插入片段上酶切微点来确定。酶切鉴定是必须的，基于下述：限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱一样。统一载体连接不同的DNA片段，不同的载体连接统一片段（片段上也有位点）酶切图谱是不同的。插入法（单酶单切点）或替代法（双酶双位点）酶切，一般来说用3种限制酶切：可鉴定载体及插入片段的大小、方向、切后并电泳分析，以确定是否得到预期的rDNA。 9.简述克隆大鼠的GAPDH基因的主要步骤 ①TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNA②核酸的定量③电泳检测④PCR产物4℃保存或琼脂糖凝胶电泳检测⑤从琼脂糖凝胶中分离回收PCR产物⑥6GAPDH基因的TA克隆、连接、转化 10.Trizo:是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。 11.荧光定量PCR中，请说明阈、基线、Ct值的概念。 Baseline（基线）：在PCR开始几个循环内所发散的荧光信号，这段时间内定量PCR仪器还未能检测到PCR产物的扩增，缺省设置为3-15个循环的荧光信号（背景荧光信号）。 Threshold（阈值）：用来确定Ct的荧光强度。是在荧光扩增曲线上认为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段在任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。 Ct值：到达阈值荧光信号所需要的循环数。 12.在做荧光定量PCR实验时要注意些什么？ (1)在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性转移器吸头（带滤嘴自卸式），不能用手直接接触毛细管、离心管的底部。 (2)操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。 (3)配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反映体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。 13.影响质粒转染效率的因素有哪些？转化率：转化效率/细胞总数

分子生物学实验室常用仪器及使用方法

实验指导目录实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法实验三琼脂糖凝胶电泳实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验六动物组织细胞基因组 DNA提取实验七 DNA的定量实验八 PCR基因扩增实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组实验十一动物组织细胞总RNA的提取实验一分子生物学实验室常用仪器及使用

事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。一、冷冻离心机低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序（1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。（2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。（3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。（4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。（5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。（6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项（1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。

分子生物学实验报告

分子生物学实验院系：生命科学与技术学院专业：生物科学（基地）班级： 201101班学号：姓名：分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具

有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂

《分子生物学》实验指导(2015-2016)

《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

分子生物学实验思考题答案

分子生物学实验思考题答案实验一、基因组DNA的提取 1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA 答、的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体尽量大的DNA片段. 2、如何检测和保证DNA的质量？答、用看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断，当OD260/OD280< ，表示蛋白质含量较高当OD260/OD280> ，表示RNA含量较高当OD260/OD280=～，表示DNA较纯。实验二、植物总RNA的提取 1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备的菌液。细胞生长密度以刚进入时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；D）化合物及的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 2、感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？答、在中将导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为质粒进入。实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定 1、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？答、活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入会细胞会死亡。 2、什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？答、是细菌体内的环状。

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

分子生物学实验中常用的抗生素配置及工作浓度

常用抗生素：备注：(摘自《分子克隆》第三版附录 2 ) ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用0.22 ym滤器过滤除菌； ②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。氨苄青霉素( ampicillin )(100mg/ml ) 溶解1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml? 50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。羧苄青霉素( carbenicil l in )( 5 0 m g/m l ) 溶解0.5g 羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。甲氧西林( methicillin )(100mg/ml ) 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。卡那霉素( kanamycin)( 10mg/ml) 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素( chloramphenicol)(25mg/ml) 溶解250mg 氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml 。分装

成小份于-20C贮存。常以12.5ug/ml?25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。链霉素( streptomycin)(50mg/ml) 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。萘啶酮酸( nalidixic acid )( 5mg/ml ) 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。四环素( tetracyyline)(10mg/ml ) 溶解100mg 四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20C贮存。常以10ug/mI?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

分子生物学实验室常用有毒药品

分子生物学实验室有毒常用药品 1.溴化乙锭（：具有强诱变致癌性，使用时一定要戴一次性手套，注意操作规范，不要随便触摸别的物品。 2（焦碳酸二乙酯：闻起来香香甜甜的，可是害人不眨眼！一种强有力的蛋白质变性剂，而且怀疑是致癌剂.开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼.操作时戴合适的手套，穿工作服，并在化学通风橱里进行. 3（苯甲基磺酰氟：老板说是神经毒!!!是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂.它对呼吸道黏膜，眼睛和皮肤有非常大的破坏性.可因吸入，咽下或皮肤吸收而致命.戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱里使用.在接触到的情况下，要立即用大量的水冲洗眼镜或皮肤，已污染的工作服丢弃掉. 4. 乙腈，易挥发易燃，是一种刺激物和化学窒息剂，通风橱中远离热、火。 5. 放线菌素D ,是一种致畸剂和致癌剂，通风橱中操作。 6鹅膏蕈毒环肽，具有强毒性,可能致命。 7亚甲双丙烯酰胺,有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末。 8. 甲醇,有毒,能引起失明。 9. 乙酸（浓的：可能因为吸入或皮肤吸收而受到伤害，要戴手套和护目镜，最好在化学通风橱中操作。 10. 过硫酸酸铵:对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤又较大危害性，吸入可致命。操作时戴手套、护目镜。始终在通风橱中操作。

11. 氯化铯:可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴手套和护目镜。 12:很强的还原剂，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜,在通风橱中操作。13.甲醛:毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂，易通过皮肤吸收，对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。避免一如其挥发的气雾。戴手套和护目镜。始终在通风橱中操作。远离热、火花及明火。 14 ,对眼睛有刺激性，腐蚀皮肤。有一次不小心溅出一小滴在脸上，马上就红了，过一会儿感觉到疼，一周之后才好。如果溅上，马上用大量的水冲洗。大家在实验室里，接触到的化学试剂多半都有危害性，紫外灯，如果离心机不是很好的话的噪声污染，会导致手指需要震动，等等,所以每个人都应该注意保护自己，而不能因为图省事或者别的什么原因而放松对安全的注意。另外就是注意规范操作，搞微生物的尤其要注意，不要实验室感染。 15. 叠氮钠,有毒,阻断细胞色素电子运送系统 16. 氟化钠,有毒可致命,通风橱中操作 17. 放射性物质（同位素标记时，要戴手套,护目镜,穿工作服,最好买试剂盒（如果有商品化的 18巯基乙醇，可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害 19. 氨甲蝶呤,致癌和致畸

分子生物学实验心得体会

关于分子生物学实验的体会梁慧媛（生技01 级）不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。分子生物学实验心得体会刘东强（生科01 级）分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值刘佳凝（生技01 级）一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我

分子生物学常用实验指南

生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）

2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

分子生物学实验复习题附答案(最新整理)

分子生物学复习题实验一DNA的制备（1）为什么分子生物学实施时要担心EB？溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。（6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？