微生物实验指导

实验一微生物培养基的配制和灭菌

培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件：(1)适当组分和比例的营养物质；(2)适宜的pH值；(3)合适的渗透压；(4)保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物工作者的主要技术操作之一。

一、实验目的与耍求：

1．了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

2．了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

3．熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。

二、实验原理与材料：

(一) 培养基的种类

根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。

天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。

从培养基的物理状态来分：

液体培养基：不加凝固剂。

固体培养基：在液体培养基中加2％左右的凝固剂。

半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％一0.5％凝固剂。

微生物最常用的凝固剂为琼脂(其次为明胶)，又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96℃以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。

表3-1 琼脂与明胶特性比较

（二）实验材料

1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂；马铃薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、

KN03，MgS04·7H20、FeSO4·7H20、等。

2．高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌。

3．其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。

三、实验方法与步骤：

(一)、培养基的配置

1．培养基的配制常用方法和步骤：

(1)称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。

(2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根据实验需要加入蒸馏水或自来水)，用玻棒搅匀，加热溶解。

(3)调pH值(调pH也可以在加琼脂后再调)，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。

(4)加琼脂熔化，在琼脂熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。

(5)分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装量为管高的五分之一。

特别注意不要使培养基粘污在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。

(6)包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆，挂上所配培养基名称的标签。

(7)灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面，(见图3一1)。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24小时，如确无菌生长，方可使用。

2．三种培养基的配方及配制

（1）.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(用于分离和培养细菌，是一种天然培养基)。

配方：牛肉膏 3克

蛋白胨 5克

氯化钠 3克

琼脂 20克

自来水 1000毫升

pH 7．2～7．4

灭菌 15磅／英寸2，30分钟。

本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨，30％氯化钠。以配制200毫升培养基为例：

吸取30％牛肉膏2毫升，50％蛋白胨2毫升，30％氯化钠2毫升，加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200毫升。用玻捧搅匀，在电炉上稍加热，调pH至7.4，加琼脂4克，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，(见图3—2)。装带有棉塞的无菌试管，装置五分之一的试管高度共12支，作斜面培养基。用铝壳试管帽的各装10毫升，约试管高度的二分之一以上，用作分离时倒平板用。

分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆，(图3—3)挂上标签，灭菌备用。

（2）．马铃薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)琼脂培养基。(用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基)。

配方：去皮马铃薯(或鲜豆芽) 200克

蔗糖(或葡萄糖) 20克

自来水 1000毫升

琼脂 20克

pH 自然

灭菌：(含蔗糖)15磅／英寸2 30分钟。

(含葡萄糖)10磅／英寸220分钟。

制备方法：配制200毫升培养基。

取去皮马铃薯40克，切成小块，放入无刻度的搪瓷杯中，加水200毫升，置电炉上加热，煮沸十分钟，用四层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200毫升，然后加蔗糖4克，加琼脂4克，加热熔化，并用玻棒不断搅拌，直至琼脂完全熔化，分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。

（3）淀粉琼脂培养基(高氏一号Gause’S1)，用于分离和培养放线菌之用，是一种合成培养基。

配方：可溶性淀粉 20.O克

KN03 1.0克

K2HP04 O.5克

MgS04·7H20 O.5克

NaCl O.5克

FeS04·7H20， O.01克

琼脂 20克

自来水 1000毫升

灭菌：15磅／英寸2，30分钟。

制备方法：配制200毫升培养基

吸取配方液：1％ KN03 20毫升；l％ K2HP04 lO毫升；l％ MgSO4·7H2O lO毫升；l％NaCl 10毫升；1％FeSO4·7H2O O.2毫升，加水补足至200毫升，置电炉上加热。用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4克，从200毫升中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后，将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，取下调pH至7.4，加琼脂4克，加热至琼脂完全熔化为止，趁热分装试管，下面一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。

（4）．无菌水的制备：

无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用的材料。

100毫升三角瓶(装有玻璃珠)，装自来水45毫升，试管中装9毫升自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。

(二)分离培养微生物常用器皿的准备

1．清洗一些玻璃仪器：如三角瓶，试管，培养皿、吸管等。

2．棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染。试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约l～2毫米处，用解剖针塞入少许棉花，(约1—1.5厘米长)，以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花滑下为准。

教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松，两头光滑，试管棉塞的长度约3厘米左右。塞入试管内部分约占2／3，头部稍大约占l/3左右，见图3—4。

1 2 3 4 5 .

图3-4 棉塞的要求条件

1.正确的式样

2.管内部太短，管外太松

3.管外太小

4.整个棉塞过松

5. 管内部太紧，管外太松

3．包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管，三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当(见示范)，每组同学包培养皿6只(一包)。

吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在4～5厘米宽的长纸条的一端，约成45o角，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。见图3—5。

(三)培养基和玻璃器材的灭菌方法

灭菌的方法，通常可以分为四大类：(1)加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；(2)过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；(4)化学药剂灭菌和消毒。在本实验中，以介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。

1．干热灭菌法(即热空气灭菌法)：

干热灭菌—般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的

三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等 ，放入电热烘箱中。 打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160℃一170℃，关闭通气孔，使箱内的温度保持在160℃左右，并维持1.5—2小时。时间一到，切断电源。待温度

下降至60一70℃以下，方可打开箱门取灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。

2．加压蒸汽灭菌法

利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高(见表3—2)，来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。

表3-2 加压蒸汽灭菌器压力数与蒸汽温度间的关系

在同一温度下，湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下，易于凝固，(见表6—2)。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与水蒸汽的温度相等，达到平衡为止,从而提高灭菌效率。

手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下：

(1)在灭菌器内加入一定量的水(有的灭菌器内加水至止水线)。将用防水纸包扎好的灭菌物品如:培养基、无菌水等，放进灭菌器内。

(2)接通电源，进行加热。

(3)当压力到达5磅／英寸2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。

(4)当压力表上的压力到达15磅／英寸2(即1.05公斤／平方厘米)时，此时灭菌器内的温度达到121℃，维持30分钟不变。对热不稳定的培养基灭菌时，应适当降低压力，延长时间。

(5)灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。

如果灭菌后的固体培养基要做成斜面,需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。

3．间歇灭菌法：

常采用阿诺(Arnold)氏灭菌器和柯赫(Koch)氏灭菌器或蒸笼灭菌，常压条件下，蒸汽温度不超过100度。在没有高压灭菌器设备的情况下或不宜加压灭菌的物品，可采用此法灭菌。

做法是：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮一次，每次煮沸一小时，连续三天重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品(指培养基)放在37℃恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以使下一次蒸煮时杀灭。

4．过滤除菌法：

一些不能加热灭菌的液体物质(如维生素、血清)，可以用过滤除菌法，一般用细菌过滤器进行除菌。(教师示范)

细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板孔眼很小，细菌不能通去。因此，过滤后的液体就除去了细菌。在进行过滤除菌前，整个细菌过滤器和接受液体的器皿，必须包装妥当进行加压蒸汽灭菌后方可使用。

5．紫外线灭菌：

波长2600一2800 A(A=1／10nm)之间的紫外线有很强的杀菌能力，一般紫外灯管能产生2537A的紫外光，杀死力强而稳定，但穿透力弱，一般只适宜物体表面、空气灭菌。例如接种室、培养室、手术室、药厂包装室等空气灭菌。一般30瓦灯管，9立方米空间，距地面2米，每次打开紫外线照射半小时，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时，先喷洒石碳酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。

在进行微生物接种和分离等操作时，常须用紫外线来杀灭接种室(箱)空气、台面等处的微生物。(参观示范)

紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。

表3—4 常用化学抑茵剂和杀毒剂

紫外线对眼粘膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直接在紫外线灯开启下工作。

6．化学药剂消毒灭菌：

微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。具体见表6—4。

四、实验注意事项

1．使用高压蒸汽锅时应加充足水分，以免蒸干。锅内的冷空气要排尽，否则压力虽达要求，而温度未达到要求，灭菌不完全。

2．每次使用干热灭菌箱时，要灭菌的玻璃器皿，必须完全干燥，以免引起玻璃的破裂。

调节温度不能高于180℃，否则会使棉花、纸张烤焦。灭菌后，需等温度下降到l 60℃

以下，才能打开箱门，否则易使玻璃因骤冷而破裂。凡橡皮塞或橡皮管不能用干热

灭菌，因高温会使橡皮破坏。

3．在使用过滤器前应检查过滤器有无裂隙及漏气，滤器用后应立即清洗。

五、实验记录

六、实验数据处理

七、思考题

1．配制培养基为什么要调节pH值？

2．培养基中加琼脂的作用是什么? 配固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意那些问题?

3．为什么牛肉汁蛋白胨培养基不加矿物盐类？

4．配制培养基要注意哪些问题？可否用橡皮塞、木塞来代替棉花塞？

5．干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌应用的的场合有何不同?

6．如何检查培养基灭菌是否彻底?

I．环境中的微生物

因为微生物是肉眼看不见的，所以初学微生物学的学生常不知道外界环境和所有与外界接触的身体各部位均有微生物的存在。实际上它们广泛分布于室内外的空气、水和土壤中，桌、椅和板凳的表面，衣服以及身体的皮肤、粘膜（例如鼻腔、口腔、喉头等的粘膜）等处，因此，可以说微生物是无缝不钻，无孔不入的。在学生第一次进入微生物学实验室时，建立起“微生物无所不在”这一概念是特别重要的，因为这样才能体会到无菌技术和环境卫生的必要性，才能防止外界微生物对培养物的污染，才能防止病原性细菌或病毒通过手或衣服进入人体而引起传染。

从周围环境和体表各部取样生长出来的微生物，虽然大多数属正常菌群，但当进入破损的皮肤或传入口内或眼睛等处也会引起传染，这一方面是因为通过培养，微生物的量大；另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但当条件改变时也可能致病（称为条件致病菌），因此必须详细阅读操作步骤和听从指导者的说明，特别是用过的棉签和工作完毕后的培养物等均要放在指定的容器内，接种环不仅在用前必须烧灼灭菌，而且用后也应立即烧灼。这是整个微生物学实验课程和今后进行微生物学实验时均需注意的。

下面的实验就是从实验室空气、实验台、门的旋扭（或把手）和人的头发、皮肤、洗手前后的手指和鼻腔粘膜等处取样，接种于琼脂平板上，经培养1—2天后，观察并比较不同来源的微生物生长的数量和类型。

实验二实验室环境和人体表面微生物的检查

一、目的要求

1．证明实验室环境与体表存在微生物。

2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。

3．体会无菌操作的重要性。

二、基本原理

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37℃温度下培养，1—2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

三、器材

肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。

四、操作步骤

每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。

1．写标签

任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

2．实验室细菌检查

（1）空气将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。

（2）实验台和门的旋钮

（a）用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线，如图。

（b）取棉签左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出，将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞（或试管帽），并将空试管放在试管架上。

（c）弄湿棉签左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。

（d）取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2平方厘米的范围。

（e）接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。

（f）划线另取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至

可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。

左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。

闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，从上向下来回划线至1／2处。

烧灼接种环，转动平板，划最后1／4，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。

整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。

3．人体细菌的检查

（1）手指（洗手前与洗手后）

（a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每次写标签时是必不可少的）。

（b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。

（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。

（2）头发在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。

（3）咳嗽将去盖琼脂平板放在离口约6—8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。

（4）鼻腔

（a）按照实验台检查法的步骤（b）和（c），取出棉签，并将其弄湿。

（b）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。

（c）按实验台检查法的步骤（e）和（f），接种与划线，然后盖上皿盖。

4．将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37℃培养箱，培养1—2天。

5．结果记录方法

（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。

（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。

菌落特征描写方法如下：

（a）大小大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。

（b）颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

（c）干湿情况干燥、湿润、粘稠。

（d）形态圆形、不规则等。

（e）高度扁平、隆起、凹下。

（f）透明程度透明、半透明、不透明。

（g）边缘整齐、不整齐。

五、实验报告

1．结果

（1）将你自己的平板结果记录于下表中。

（2）与其他同学所做的结果进行比较。

2．思考题

（1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？

（2）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？

（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？

（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？

实验三显微镜油镜的使用和细菌形态的观察

微生物的个体微小，肉眼难以见到，要研究它们，必须要用显微镜来观察。因此，显微镜是研究微生物的重要工具。显微镜是一种精密的光学仪器，使用时必须了解其基本原理和构造，才能充分发挥其性能。

一、实验目的和要求：

1．学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的基本知识。

2．使用油镜观察细菌的几种基本形态。

3．用悬滴法在高倍镜或油镜下观察细菌的运动。

二、实验装置与材料：

（一）光学显徽镜

1．显微镜的构造

普通光学显微镜可分为两大部份：光学部分和机械部分。光学部分通常是由接目镜、接

物镜和照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)组成的。它使检视物放大，造成物象，是显微镜的重要组成部份。机械部分由镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台移器、粗调节器、细调节器等部件组成，它起着支持、调节、固定等作用。

2．显微镜的放大倍数和分辨率

(1)显微镜的放大倍数

显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造像，再经过目镜在明视距离内第二次放造像。因此，显微镜的放大倍数等于接物镜放大

显微镜放大倍数 = 接物镜放大倍数×接

目镜放大倍数。

(2)显微镜的分辨率

显微镜的分辨率是表示显微镜辨析物体

(两端)两点之间距离的能力，能够辨析物体两

点问的距离愈小，则分辨率愈高，分辨率的高

低，首先取决于物镜的镜口率所使用光线的波

长，见图(1—2)

显微镜的分辨率可以用以下公式表示：

式中D：为物镜分辨出物体两点间的最短距离。

λ：为可见光的波长(平均O.55微米)。

n :为物镜和被检标本间介质的折射率。

α:为镜口角(即入射角)。

λ愈大，D值愈大，分辨率愈低，n和α愈大，D值愈小，分辨率愈高，因此，可以通过降低光线波长，增大介质折射率和加大镜口角(入射角)来提高分辨率。

3．油镜使用的原理：

对于个体微小，用高倍镜仍观察不清的微生物，则必须使用油镜。使用时，需要在标本和物镜间加入一种镜头油。如香柏油，所以叫油浸接物镜，简称油镜。

一般在镜头上有一黑圈或红圈的，表示为油镜物镜，也有的以“O I”或”HI”字样来表示。由于油镜镜面很小，使用时检视物与镜面又非常靠近(O.14一O.19毫米左右)，因而使进入镜头的光线较少。当光线由反光镜通过玻片与镜头间的空气时，由于玻片与物镜之间的介质为空气(接物镜干燥系)，空气折射率为l，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射现象，结果进入物镜的光线必然减少，这样就降低了视野的照明度。若载玻片与物镜之间的介质不是空气，而是一层油质，一般常用香柏油，其折射率为1.515，与玻璃的折射率(1.52)相近。光线通过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而几乎不发生折射(接物镜油浸系)，使视野增加照明度，这样就能使物像更加清晰；

(二)、实验材料

1．显微镜，(显微镜灯)、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

2．细菌的染色标本。

3．培养12～18小时的枯草杆菌(B.Subtilis)

4．盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。

三、实验方法与步骤

(一) 显微镜的使用方法与步骤

1．用前检查：从显微镜箱中取出显微镜时，用右手拿镜臂，左手托镜座，直立移动，轻放在平稳的桌面上，检查各部零件是否齐全，镜头是否清洁，否则报告老师。

2．调节光照：正确的照明是获得良好检查效果的前提。用粗调节器提升镜筒，将低倍物镜旋到镜筒下方，使镜头和载物台距离约为5毫米左右，左眼看目镜调节反光镜镜面角度(在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜)。调节光线强弱，然后调节聚光镜的位置(酌予升降)，直至视野内得到最均匀最适宜的光亮为止。 3．低倍镜观察：低倍物镜视野面广，焦点深度较深，易于发现目标确定观察位置，故应先用低倍镜观察为宜。

将载片标本(涂面朝上)置于载物台的标本夹上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节器，使镜头下降至镜面距离检视物大约10毫米处。然后以左眼看目镜，另一眼睁开，一边观察视野，一边扭动粗调节器使镜头缓慢地升高，至视野内出现物像后，改用细调节器，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物像，选择适宜部位，移到视野中心，待换中、高倍镜观察。

4．依次再进行中倍、高倍观察。在物镜依次由低倍至中倍、高倍的观察过程中，应逐次上升聚光镜以调节光线亮度，同样选择适宜的部位移至视野中央。

5．油镜观察：将聚光镜提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调节器，可见清晰物像，如果油镜上升已离开由面还未看清物像的话，需重新调节。此时可从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接。应特别注意不能压在标本上，更不能用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。用右手向上转动粗调节器，当视野中有模糊的标本物像时，改用细调节器，直到看清物象为止。

6．换片：另换新的标本片，必须从第三条开始操作。

7．用后复原：观察完毕，上旋镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去镜头上的残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。机械部件用细软布擦去灰尘和冷凝水，下降镜筒，将接物镜转成八字形置于载物台上。下降聚光镜，(切勿使接物镜与聚光镜相碰受损)，反光镜垂直于镜座。放进显微镜箱中锁好，并放入指定的显微镜柜中。

四、实验注意事项

显微镜显微镜保养和使用中的注意事项：

(1)不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。

(2)镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布擦，以保证镜面的光洁度。

(3)观察标本时，必须依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可用粗调节器向下旋，以免物镜碰到玻片损伤镜面或压碎玻片。 (4)观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，。以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。

(5)拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿动。

(6)显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片生霉菌而腐蚀镜片。

(7)在转动粗细调节器调节焦距时，要从侧面观察，切勿使物镜镜头与玻片相碰，以免损坏镜头。

(8)在观察细菌、放线菌的形态时，由于采用油镜头透镜口径较小，所以光线要调到最

强，便于观察。

五、实验记录

六、实验数据处理

七、思考题

1.如何区别显微镜的低倍镜、高倍镜和油镜？

2.使用油镜时，为何必须镜头油？

3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？

实验四显微镜直接计数法

一、目的要求

1．明确显微镜计数的原理。

2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图Ⅷ-1，C）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格，如图Ⅷ-2。

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数

因1ml=1cm3=1000mm3，

=50000A·B（个）

同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则

三、器材

酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。

四、操作步骤

1．稀释

将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。

4．显微镜计数

静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

5．清洗血球计数板

使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、实验报告

1．结果

将结果记录于下表中。 A表示五个中方格中的总菌数； B表示菌液稀释倍数。

2．思考题

根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？