代谢组学的定义(1)

代谢组学的定义

代谢组学(metabolomics/metabonomics)[1, 2]是上世纪90 年代中期发展起来的一门新学科，它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000 的小分子代谢物的变化，反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化。代谢组学的概念来源于最初人们提出的“代谢物组”(metabolome)，即指某一生物或细胞所有代谢产物，后来发展为代谢组学的概念。其最主要的特征是通过高通量的实验和大规模的计算，从系统生物学的角度出发，全面地综合地考察机体的代谢变化。作为一种崭新的方法学，代谢组学已成为国际上疾病与健康研究的一个重要热点。

Nicholson 研究小组于1999 年提出了metabonomics 的概念[1]，并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大量的卓有成效的工作[3, 4]。Fiehn 等[5]提出了metabolomics 的概念，第一次把代谢产物和生物基因的功能联系起来。之后很多植物化学家开展植物代谢组学的研究，使代谢组学得到了极大的发展，形成了当前代谢组学的两大主流领域：metabolomics 和metabonomics。前者是对生物系统整体的、动态的认识(不仅关心代谢物质的整体也关注其动态变化规律)，而后者强调分析且是个静态的认识概念，因此可以认为metabolomics 是metabonomics 的一个组成部分。代谢组学经过不断的发展，一些相关层次的定义已被学术界广泛接受。第一个层次为靶标分析，目标是定量分析一个靶蛋白的底物和/或产物；第二个层次为代谢轮廓分析，采用针对性的分析技术，对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定；第三个层次为代谢指纹，定性或半定量分析细胞内外全部代谢物；第四个层次为代谢组分析，定量分析一个生物系统全部代谢物，其目前还难以实现。

目前，代谢组学已在药物毒性和机理研究[6-7]、微生物和植物研究[8,9]、疾病诊断和动物模型[10, 11]、基因功能的阐明[12]等领域获得了较广泛的应用，在中药成分的安全性评估[13]、药物代谢分析[14]、毒性基因组学[15]、营养基因组[16]、药理代谢组学[17-19]、整合药物代谢和系统毒理学[20, 21]等方面也取得了新的突破和进展代谢组学的具体研究方法是：运用核磁共振(NMR)、质谱(MS)、气质联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)等高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，通过对细胞提取物、组织提取物、生物体液(血浆、血清、尿液、胆汁、脑脊液等)和完整的脏器组织等随时间变化的代谢物浓度进行检测，结合有效的模式识别方法进行定性、定量和分类，并将这些代谢信息与生理病理过程中的生物学事件关联起来，从而了解机体生命活动的代谢过程[22]。

基于核磁共振的代谢组学

作为众多化学分析方法中的一种，NMR 在代谢组学的研究中起着非常重要的作用。首先，NMR 分析生物体液或活体组织等复杂样品时，预处理过程简单，测试手段丰富，包括液体高分辨NMR、高分辨魔角旋转(HRMAS) NMR 和活体磁共振定域谱(MRS)，因此能够在最接近生理状态的条件下对不同类型的样品进行检测。其次，NMR 是一种无创性的多参数动态分析技术，同时具有定性分析和定量分析的能力；NMR 谱本身携带有丰富的分子结构和动力学信息，通过扫描生物样品可以得到其所有含NMR 可观测核的、且含量在NMR 检测限上的代谢物的特征NMR 谱。再次，NMR 检测可以在很短的时间内完成(一般5 ~ 10 分钟)，这对于实现高通量样品检测，并保证样品在检测期内维持原有生化性质至关重要。此外，低温探头、自动进样技术的出现和日趋完善，也使检测灵敏度和速度不断提高。最

后，NMR 技术灵活多变，通过操控脉冲序列可以获得样品中不同官能团、不同分子量或不同存在状态的分子信息[23, 24]。

NMR 代谢组学方法提出以来，引起了各国科学家的极大兴趣，现已应用于包括疾病诊断、药物作用机制研究、药物研发、分子生理学、分子病理学、基因功能组学、营养学、环境科学等重要领域[7, 17, 15, 16]。在疾病诊断方面，NMR 代谢组学方法的应用范围涵盖了先天性代谢缺陷[17, 18]、脏器移植[29]、Alzheimer 疾病[30, 31]、癌症[25, 32, 32]等领域，其中典型的例子是冠心病的研究。冠心病以前主要通过血管造影术来诊断和判断冠状动脉的狭窄程度及病理变化情况，该方法不仅昂贵，而且有创，并伴随有许多不良反应，甚至可能导致死亡。Brindle 等[3]将代谢组学方法用于冠心病研究，结果显示经过正交信号校正(OSC)的模式识别方法能很好地区分重症冠心病(三支血管疾病，TVD)病人和冠状动脉正常人的血清。多种癌症(乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、脑肿瘤)、先天性障碍等疾病在代谢组学的指引下也有了许多新的发现。

在药物毒性研究方面，利用高分辨1H NMR 波谱，可检测血浆、尿液和胆汁等生物体液中有特殊意义的微量物质的异常变化[23]。每一种类型的毒素都会导致生物体液中独特的内源性代谢物浓度和模式的变化，这些变化可以反映因中毒或代谢损害而引起的细胞功能异常，从而提供毒物作用机制和作用位置的信息。在基因功能研究方面，使用计算机辅助的模式识别方法和专家系统来解释代谢组学中得到的NMR 数据，将NMR 信号强度数据看做一个代谢物浓度或分泌速率的多样本数组，进而对样本进行分类[24]，找到与基因功能相关的生物标记物，并将其与生物学途径或代谢网络关联起来，就可以推断出基因的功能。Raamsdonk 等[35]研究了两种具有不同表型的实验室常用动物小鼠(C57BL10J 和Alpk:ApfCD)，发现这两种小鼠的代谢产物谱模式是不同的，据此提出了“代谢表型”的概念，试图将生理和生化定量分析的数据与生物体的表型和遗传差异联系起来。NMR 代谢组学主要是利用NMR 和模式识别方法对生物体液(血液、尿液、唾液等)和组织进行系统测量和分析，对完整的生物体(而不是单个细胞)中随时间改变的代谢物进行动态跟踪监测、定量和分类，然后将这些信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点，进而确定相关的生物标记物，以及它们所揭示的生物学意义，并从分子水平上认识生命运动的规律。

NMR 代谢组学分析的主要步骤。

生物样本的预处理

代谢组学的研究对象很广泛，常用的生物样本包括尿液、血液、唾液、组织提取液及活体组织等。生物样品的收集与制备是代谢组学研究的第一阶段，也是重要环节之一，样品的浓度、pH 值等对最终分析结果有很大影响。生物体液是生物体新陈代谢的终端产物，反映的是整个生命体系在应激状态下代谢变化的总和，不具备特异性，难以从来源处和代谢途径上分析浓度发生变化的代谢物。相对于体液，检测组织样品则针对特定的组织器官，代谢物在NMR谱中的强度分布可以直接表示它在该组织中的浓度大小。由于组织样品受自身的偶极-偶极相互作用、化学位移各向异性及磁化率不均匀性等因素影响，用常规的NMR 技术检测所得谱图谱线较宽，小分子代谢物信号无法辨识。为了克服这些因素的影响获得组织的高分辨NMR 谱，通常采用化学萃取方法处理组织样品或魔角旋转方法研究组织样品。

尿液：尿液预处理方法简单，且尿液中代谢物可在一定程度上反映机体重

要器官的功能状态，其内代谢物变化可作为观察研究指标，所以尿液在NMR 代谢组学研究中应用很广。

血液：相对于尿液获取的无创性和随时性，血样的收集没有尿液便捷，但血液代谢物作为机体功能状态最直接的反应，在代谢组学方面的应用依然广泛。

唾液：唾液是唾液腺分泌的一种无色液体，是副交感神经系统受到生理、化学和思想刺激时所产生的神经冲动反应。机体功能不正常可能会导致唾液分泌增多或减少，唾液成分也会发生变化，这就给代谢组学研究提供了可能性。收集唾液之前，志愿者停止一切口腔行为，清晨醒来用蒸馏水漱口吐净，5 分钟后先弃去开始部分唾液，采用自然取样法：取前倾坐位，低头，舌抵上颚，唾液沿下唇自然流下，接入试管。

组织萃取液：组织萃取法指采用化学试剂把参与生化反应的化合物从生物组织中提取出来，再利用液体NMR 技术对代谢物进行化学和结构分析，以克服组织自身引起的谱线增宽[36, 37]。

完整组织块：生物组织介于固体和液体之间，其偶极-偶极相互作用和化学位移各向异性引起的谱线增宽可以通过采用Nano 探头让生物组织在魔角方向(54.7 )快速旋转(2.0 ~ 5.0 kHz)来消除，从而提高谱图分辨率。采用Nano 探头将体积很小的样品全部集中在探头接收线圈的有效范围之内，可确保样品保持均匀的磁化率和高填充因子，从而得到好的灵敏度和线形。这种微量探头的出现为生物组织研究提供了一种便捷有效的办法[38, 39]。

NMR 数据预处理

通常情况下，原始NMR 谱图不能直接用于多元统计分析，在进行多元统计分析之前，必须先对NMR 谱图进行一系列预处理。在数据分析中，我们将由n 个

样品组成的整个NMR 数据集看成一个矩阵X(x

ij )，其中每一行(x

i

)代表一个NMR

谱图，每一列(x

j

)代表谱图中化学位移相同的某一数据点。一般来说，预处理步骤如下：NMR 谱图去噪、溶剂峰消除、调相与基线校正；NMR 谱图分段积分；归一化；标准化。

模式识别分析

一维1H NMR 谱图通常含有几千甚至上万个数据点，利用模式识别技术对这种高维的数据集进行数据分析，达到数据降维和对样品分类或判别的目的是代谢组学研究的关键。对于含有m 个变量的模式矢量，每个矢量是m 维空间中的一个点。当m=2 或m=3 时，可以直接用图形表现这些模式矢量；当m>3 时，直接用图形表现显然是不可能的。因此，如何将m 维空间的图景在二维或三维空间显示出来，并尽可能避免原m 维空间中分类信息的丢失，是数据降维处理的核心所在。

模式识别是一种借助大量信息和经验进行推理的方法，一般分为非监督性模式识别和监督性模式识别两大类[40]。非监督性模式识别用于从原始谱图信息或预处理后的信息中对样本进行分类，并采用相应的可视化技术将分类结果直观地表达出来。该方法可对得到的分类信息和这些样本的原始信息(如药物的作用位点或疾病的种类等)进行比较，建立代谢产物与这些原始信息的联系，筛选与原始信息相关的标记物，进而考察其中的代谢途径。由于这个方法没有可供学习利用的训练样本，所以称为非监督性方法。应用在代谢组学领域的非监督性方法主要有主成分分析法(PCA, Principal Component Analysis) [41]、非线性映射(NLM,Non-Linear Mapping) [42]、层次聚类分析(HCA, Hierarchical Cluster Analysis) [43]等。监督性模式识别则是建立一系列已经正确分辨出类别的数据模

型，并利用已建立的多参数模型对未知样本进行预测。在监督性模式识别方法中经常需要建立用来确认样品归类的确认集和用来测试模型性能的测试集。应用于监督性模式识别的多元统计分析方法主要有偏最小二乘法(PLS, Partial Least Squares) [44]、偏最小二乘判别分析(PLS-DA, Partial Least Squares Discriminant Analysis) [45]、正交偏最小二乘判别分析(O-PLS-DA) [46,47]、k 最近邻法(kNN, k-Nearest Neighbor)[48]、软独立模型分类分析(SIMCA, Soft Independent Modeling of Class Analogy)[49]、支持向量机(SVM, Support Vector Machines) [50]、自组织映射(SOM, SelfOrganizing Maps) [51]等。在所有模式识别方法中，使用最广泛的是无监督的PCA方法。

特征代谢物识别和生物分析是代谢组学分析的最后一步，也是关键步骤之一。利用模式识别方法得到特征变量，通过对这些变量的分析研究并结合NMR 谱图归属信息，可以获得全面的代谢物信息及代谢紊乱标记物。根据已知的特征代谢物，结合生物、化学、医学手段可以进行疾病诊断、药理分析和药物毒性跟踪。

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