生物学中的常用实验
以前做过的实验：
病毒学实验：抗体检测：血凝抑制
ELISA
抗原检测：血凝
PCR
胶体金检测试纸卡测抗原细菌学实验：药敏试验
水质监测测大肠杆菌
其他：PH计测畜禽饮用水PH值
显微镜法测虫卵（饱和盐水法）
建议：可以采用的其他的检测试纸卡扩大抗原检测的种类和缩短检测时间。
各实验具体步骤：
病毒学实验
1.抗体检测：
有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。
疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验
目的意义：
1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；
2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。
基本原理：
许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。
器材及试剂:
待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；
待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；
生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
实验步骤
(一)血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：
1、第一排1-12孔各加生理盐水25ul，第二排1-12孔加生理盐水25ul为红细胞对照；
2、吸25ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取25ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul，
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul。
4、室温静置10-30分，观察结果
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集
的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价
（二）血凝抑制试验（HI）
取一96孔板，按以下步骤操作：
1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。（根据学农实验配置4单位抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以4即为含4单位抗
原的稀释倍数。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水25ul，于第一排第1孔中加入
25ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取25ul至第2孔混匀，吸取25ul至第3孔，依次
稀释至第12孔，弃去25ul，经倍比稀释
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素25ul，微量震荡器震荡2min混匀；
4、室温静置20min；
5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
6、室温静置10-30分，观察结果。将板倾斜，观察红细胞有无成泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原货病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位。
ELISA（酶联接免疫吸附剂测定）
是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫
荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发
展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用
相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯
乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，
从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可
有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检
测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间
接法。
(二)操作步骤
方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／m l。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30
分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度
越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：
在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔
中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，
37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
(三)试剂器材
1.试剂
(1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
Na CO３ 1.59克
NaHCO３ 2.93克
加蒸馏水至1000ml
(2)洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M
KH2PO4 0.2克
Na2HPO４·12H2O 2.9克
NaCl8.0克
KCl0.2克
Tween-200.05％0.5ml
加蒸馏水至1000ml
(3)稀释液：
牛血清白蛋白(BSA) 0.1克
加洗涤缓冲液至100ml
或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
(4)终止液(2M H２SO４）：
蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):
0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml
0.1M 柠檬酸(19.2克／L)24.3ml
加蒸馏水50ml。
(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液:
TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml
底物缓冲液(PH5.5)10ml
0.75％H２O２32μl
(7)ABTS使用液:
ABTS0.5mg
底物缓冲液(PH5.5)1ml
3％H２O２2μl
(8)抗原、抗体和酶标记抗体。
(9)正常人血清和阳性对照血清。
2.器材:
(1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2)小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3)4℃冰箱，37℃孵育箱。
抗原检测
1.PCR
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链，在DNA 聚合酶与引发子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做引发子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR反应步骤
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
Taq DNA 聚合酶
现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现"停滞效应" 这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 5ul
4种dNTP混合物各200μmol/L
引物各10～100pmol
模板DNA 0.1～2μg
Taq DNA聚合酶 1～2 U
Mg2+ 1.5～2.0mmol/L
加双或三蒸水至 50μl
PCR反应五要素
*引物（Primer）
*酶（Taq DNA Polymerase）
*dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP）
*模板（Template）
*Mg2+（Magnesium）
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3''端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
4、引物3''端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
5、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
6、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
7、引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度
目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度
为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR扩增条件的选择
PCR扩增条件包括温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
1、变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
2、退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
3、延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
细菌学实验
1.药敏试验
1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）
2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。
3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
判定标准
一、药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
药物敏感实验判定标准
抑菌圈直径（毫米）敏感度
20以上极敏
15~20 高敏
10~14 中敏
10以下低敏
0 不敏
二、药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。
影响药敏结果的因素
一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
四、培养时间：一般培养温度和时间为37℃ 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。
检测虫卵
1.饱和盐水浮聚法适用于检查线虫卵（未受精蛔虫卵例外），也可检查带绦
虫卵及膜壳绦虫卵，但不适宜检查吸虫卵和原虫包囊。对检查钩虫卵效果尤佳，是诊断钩虫病的首选方法。
基本原理：利用比重较大的饱和盐水，使比重较小的虫卵，特别是钩虫卵，漂浮在溶液表面，而达到浓集目的。
材料准备：漂浮瓶、载玻片、竹签、滴管、饱和盐水、显微镜。
操作方法：用竹签取黄豆大小的粪便（约1g）置于含少量饱和盐水的漂浮瓶中（高3.5mm，直径2cm的圆筒形小瓶），也可用青霉素小瓶代替，将粪便充分捣碎并与盐水搅匀后，除去粪中的粗渣，再缓慢加入饱和盐水至液面略高于瓶口但不溢出为止，在瓶口覆盖载玻片一张，静置15分钟后，平持载玻片向上提起后迅速翻转，使有饱和盐水一面向上，立即镜检，以防标本干燥和盐结晶析出，妨碍镜检。
注意事项：①盐水的配制一定要饱和，将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内，不断搅动，直至食盐不再溶解为止（100ml水中加食盐35~40g），冷却后用两层纱布滤去杂质，测量密度应达1.20；②粪便太多太少都影响浓集效果；③玻片要清洁无油，防止玻片与液面间有气泡或漂浮的粪渣；④漂浮的时间须按规定；⑤翻转玻片时要轻巧、适速。
附: 小管浮聚虫卵计数法本法适用于部分线虫卵，尤其适用于钩虫卵记数，故常用于测定钩虫在人体内的感染度。此法简便、快速，使用器皿简单、便宜；洗涤容易、携带方便。但每毫升粪便中虫卵少于10个时，此法不适用。
材料准备：平底小玻管或塑料管（直径15mm，高20mm）、0.1ml容积粪便定量器、载玻片、盖玻片、饱和盐水。
操作方法：用0.1ml小汤匙取粪便，用牙签刮入一直径15mm高为20mm的小平底玻璃管内。加入少量饱和盐水，捣碎粪便，调匀,再加饱和盐水至满。覆上盖玻片，10min后取下镜检记数，如此共检3张盖玻片。将3次记数所得虫卵数之和乘10，再乘粪便性状系数，即为每ml粪便中虫卵数。
注意事项：除粪便定量（0.1m1）、虫卵计数外（记录盖玻片上全部虫卵数）。重复3次，得3次虫卵数的均数乘以10，再乘以粪便性状系数。粪便性状系数：成形便为1，半成形便为1.5，软湿便为2，粥样便为3，水泻便为4，其余同饱和盐水法。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验室常用试剂的配制
一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解 2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。 分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）： 溶解 3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用 0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）： 加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于 9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）： 在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加 32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加 0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassiumacetate）：
溶解 78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）： 溶解 7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）： 溶解 40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至 5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（ 0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取 186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/LHEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（ 6.8- 8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至 91.4ml的水中。 25mg/mlIPGT： 溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
实验室常用英文术语集锦
实验室常用英文术语集锦 容器与耗材vessel & consumablematerial 小瓶vial量杯measuring cup烧杯beaker量筒measuring flask/measuring cylinderer坩埚crucible坩埚钳crucible clamp试管test tube漏斗funnel比色皿cuvette鱼缸aquarium烧瓶flask锥形瓶conical flask塞子stopper/plug 洗瓶plastic wash bottle玻璃活塞stopcock试剂瓶reagent bottles玻棒glass rod搅拌棒stirringrod容量瓶volumetric flask/measuring flask移液管(one-mark) pipette吸液管pipette滤器filter滤纸filter paper培养皿culture dish移液枪pipette移液枪枪头pipette tips剃刀刀片razorblade手术刀scalpel垃圾袋disposablebag垃圾桶garbagebin橡皮筋rubber band托盘Tray铝箔aluminiumfoil洗耳球rubber suction bulb保鲜膜preservativefilm研磨钵mortar研杵pestle小滴管dropper蒸馏装置distillingapparatus桶bucket 广口瓶wide-mouth bottle离心机转子rotor试管架test tube holder/rack酒精灯alcoholburner酒精喷灯blastalcohol burner搅拌装置stirring device石蜡封口膜Parafilm微量离心管（EP管）Eppendorf tube载玻片Slide盖玻片Cover glass离心管Centrifugetube电泳槽Geltank电线Electricalleads牙签Toothpick螺丝钉Screw锁紧螺母
实验室各种染料的配比
实验室常用染料性能介绍及常用药品试剂和培养基的配制 一、生物标本常用染料性能简介 （一）天然染料 1、苏木精苏木精是从南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。 苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。 2、洋红洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。 洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。 （二）人工染料 人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。 1、酸性品红酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。他是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。他跟甲基绿同染，能显示线粒体。 组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。 2、刚果红刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。他能作染料，也用作指示剂。他在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。他用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于他能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。 3、甲基蓝甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。他跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用他染色后不能长久保存。 4、固绿固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。他和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。 5、苏丹Ⅲ苏丹Ⅲ是弱酸性染料，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。 6、伊红这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。 7、碱性品（复）红碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。 8、结晶紫结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度8.75%）。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。 9、龙胆紫龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。 10、中性红中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度1.8%）。它的碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验室常用仪器及使用方法
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
实验室常用英文术语
实验室常用英文术语 1. 1.当你进入国外的实验室之前，如果不能熟练掌握实验过程中相关物品的英文名称及读音，你与同处一室的技术人员之间必将产生强烈的交流障碍，实验效率也将因此大打折扣。这里我汇总了数篇文章的相关内容，并结合自己实验室的情况，补充了大量词汇，希望对即将出国留学的生物学科研人员有所帮助。欢迎大家补充指正。 一．容器与耗材（vessel & consumable material） 小瓶vial 量杯measuring cup 烧杯beaker 量筒measuring flask/measuring cylinderer 坩埚crucible 坩埚钳crucible clamp 试管test tube 漏斗funnel 比色皿cuvette 鱼缸aquarium 烧瓶flask 锥形瓶conical flask 塞子stopper/plug 洗瓶plastic wash bottle 玻璃活塞stopcock 试剂瓶reagent bottles 玻棒glass rod 搅拌棒stirring rod 容量瓶volumetric flask/measuring flask 移液管(one-mark) pipette 吸液管pipette 滤器filter 滤纸filter paper 培养皿culture dish 移液枪pipette 移液枪枪头pipette tips 剃刀刀片razor blade 手术刀scalpel 垃圾袋disposable bag 垃圾桶garbage bin 橡皮筋rubber band 托盘Tray 铝箔aluminium foil 洗耳球rubber suction bulb 保鲜膜preservative film 研磨钵mortar 研杵pestle 小滴管dropper 蒸馏装置distilling apparatus 桶bucket 广口瓶wide-mouth bottle 离心机转子rotor 试管架test tube holder/rack 酒精灯alcohol burner 酒精喷灯blast alcohol burner 搅拌装置stirring device 石蜡封口膜Parafilm 微量离心管（EP管）Eppendorf tube 载玻片Slide 盖玻片Cover glass 离心管Centrifuge tube 电泳槽Gel tank 电线Electrical leads 牙签Toothpick 螺丝钉Screw 锁紧螺母Nut, Cap nut 复印纸Copy paper 复写纸Carbon paper 钉Nail 试管刷test-tube brush 计时器Timer 闹钟Alarm clock U形钉Staple 衣服挂钩Coat hanger 电泳用的梳子Comb 扳手Shifting spanner 订书机Stapler 订书钉staple 圆珠笔芯Refill 灯泡Globe 记号笔marker pen 注射器syringe
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
实验室常见仪器中英文对照表
实验室常见仪器中英文对照表 量杯measuring cup 烧杯beaker 量筒measuring flask/measuring cylinder 量筒graduated flask/measuring cylinder 坩埚crucible 坩埚钳crucible clamp 坩埚crucible pot, melting pot 试管test tube 试管架test tube holder 漏斗funnel 分液漏斗separatory funnel 烧瓶flask 锥形瓶conical flask 塞子stopper 洗瓶plastic wash bottle 滴定管burette 玻璃活塞stopcock 冷凝器condenser 试剂瓶reagent bottles 玻棒glass rod 搅拌棒stirring rod 蒸馏烧瓶distilling flask 碘量瓶iodine flask 表面皿watch glass 蒸发皿evaporating dish 容量瓶volumetric flask/measuring flask 移液管(one-mark) pipette 刻度移液管graduated pipettes 称量瓶weighing bottle 吸液管pipette 滤管filter 天平balance/scale 分析天平analytical balance 台秤platform balance 游码crossbeams and sliding weights 酒精灯alcohol burner 酒精喷灯blast alcohol burner 搅拌装置stirring device 洗耳球rubber suction bulb 研磨钵mortar 研磨棒pestle 玛瑙研钵agate mortar
分子生物学实验中常用的抗生素配置及工作浓度
常用抗生素： 备注：(摘自《分子克隆》第三版附录 2 ) ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用0.22 ym滤器过滤除菌； ②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素( ampicillin )(100mg/ml ) 溶解1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml? 50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素( carbenicil l in )( 5 0 m g/m l ) 溶解0.5g 羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林( methicillin )(100mg/ml ) 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素( kanamycin)( 10mg/ml) 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素( chloramphenicol)(25mg/ml) 溶解250mg 氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml 。分装
成小份于-20C贮存。常以12.5ug/ml?25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素( streptomycin)(50mg/ml) 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸( nalidixic acid )( 5mg/ml ) 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装 成小份于-20C贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素( tetracyyline)(10mg/ml ) 溶解100mg 四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以 免溶液见光，于-20C贮存。常以10ug/mI?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
常用实验耗材英文
生物实验室英语：常见耗材、仪器、操作、试剂 英文名称 当你进入国外的实验室之前，如果不能熟练掌握实验过程中相关物品的英文名称及读音，你与同处一室的技术人员之间必将产生强烈的交流障碍，实验效率也将因此大打折扣。这里我汇总了数篇文章的相关内容，并结合自己实验室的情况，补充了大量词汇，希望对即将出国留学的生物学科研人员有所帮助。欢迎大家补充指正。 一．容器与耗材（vessel & consumable material） 小瓶vial 量杯measuring cup 烧杯beaker 量筒measuring flask/measuring cylinderer 坩埚crucible 坩埚钳crucible clamp 试管test tube 漏斗funnel 比色皿cuvette 鱼缸aquarium 烧瓶flask 锥形瓶conical flask 塞子stopper/plug 洗瓶plastic wash bottle 玻璃活塞stopcock
玻棒glass rod 搅拌棒stirring rod 容量瓶volumetric flask/measuring flask 移液管(one-mark) pipette 吸液管pipette 滤器filter 滤纸filter paper 培养皿culture dish 移液枪pipette 移液枪枪头pipette tips 剃刀刀片razor blade 手术刀scalpel 垃圾袋disposable bag 垃圾桶garbage bin 橡皮筋rubber band 托盘Tray 铝箔aluminium foil 洗耳球rubber suction bulb 保鲜膜preservative film 研磨钵mortar 研杵pestle 小滴管dropper 蒸馏装置distilling apparatus 桶bucket
分子生物学实验室常用有毒药品
分子生物学实验室有毒常用药品 1.溴化乙锭（：具有强诱变致癌性，使用时一定要戴一次性手套，注意操作规范，不要随便触摸别的物品。 2（焦碳酸二乙酯：闻起来香香甜甜的，可是害人不眨眼！一种强有力的蛋白质变性剂，而且怀疑是致癌剂.开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼.操作时戴合适的手套，穿工作服，并在化学通风橱里进行. 3（苯甲基磺酰氟：老板说是神经毒!!!是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂.它对呼吸道黏膜，眼睛和皮肤有非常大的破坏性.可因吸入，咽下或皮肤吸收而致命.戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱里使用.在接触到的情况下，要立即用大量的水冲洗眼镜或皮肤，已污染的工作服丢弃掉. 4. 乙腈，易挥发易燃，是一种刺激物和化学窒息剂，通风橱中远离热、火。 5. 放线菌素D ,是一种致畸剂和致癌剂，通风橱中操作。 6鹅膏蕈毒环肽，具有强毒性,可能致命。 7亚甲双丙烯酰胺,有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末。 8. 甲醇,有毒,能引起失明。 9. 乙酸（浓的：可能因为吸入或皮肤吸收而受到伤害，要戴手套和护目镜，最好在化学通风橱中操作。 10. 过硫酸酸铵:对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤又较大危害性，吸入可致命。操作时戴手套、护目镜。始终在通风橱中操作。
11. 氯化铯:可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴手套和护目镜。 12:很强的还原剂，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜,在通风橱中操作。13.甲醛:毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂，易通过皮肤吸收，对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。避免一如其挥发的气雾。戴手套和护目镜。始终在通风橱中操作。远离热、火花及 明火。 14 ,对眼睛有刺激性，腐蚀皮肤。有一次不小心溅出一小滴在脸上，马上就红了，过一会儿感觉到疼，一周之后才好。如果溅上，马上用大量的水冲洗。 大家在实验室里，接触到的化学试剂多半都有危害性，紫外灯，如果离心机不是很好的话的噪声污染，会导致手指需要震动，等等,所以每个人都应该注意保护自己，而不能因为图省事或者别的什么原因而放松对安全的注意。 另外就是注意规范操作，搞微生物的尤其要注意，不要实验室感染。 15. 叠氮钠,有毒,阻断细胞色素电子运送系统 16. 氟化钠,有毒可致命,通风橱中操作 17. 放射性物质（同位素标记时，要戴手套,护目镜,穿工作服,最好买试剂盒（如果有商品化的 18巯基乙醇，可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害 19. 氨甲蝶呤,致癌和致畸
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
生化实验室常用试剂中英文对照
HRP: Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 Stripping buffer fetal bovine serum acetone 丙酮 ammonium acetate 醋酸铵 ammonium bicarbonate 碳酸氢铵 ammonium persulfate 过硫酸铵 ammonium formate 甲酸铵 Bromophenol blue 溴酚蓝 Coomassie brilliant blue G250 考马斯亮蓝G250 Chloroacetamide 氯乙酰胺 Chloramphenicol 氯霉素 Ciprofloxacin hydrochloride 盐酸环丙沙星 Coumaric acid 对羟基肉桂酸 Calcium chloride fused 无水氯化钙 Dimethyl sulfoxide DMSO 二甲基亚砜 Dapi fluoromount-G ethyl 2,5-dihydroxybenzoate 2,5二羟基苯酸乙酯 glycerol 丙三醇 EDTA disodium salt dihydrate 乙二胺四乙酸二钠盐 β-glycerophosphate disodium salt hydrate β甘油磷酸二钠盐 Guanidine HCl（hydrochloride）盐酸胍 HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 Hydrogen peroxide H2O2 Imidazole 咪唑 Type flmmersion liquid IGEPAL CA-630 : 酞菁氧钒非离子型表面活性剂MOPS：3-Morpholinopropanesulfonic acid 3-(N-吗啡啉)丙磺酸 Magnesium chloride anhydrous 无水氯化镁 Methanol 甲醇 β-mercaptoethanol Nonidet P-40 乙基苯基聚乙二醇表面活性剂 Ponceau S 丽春红 PMSF：Phenylmethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟抑制trypsin PIPES 缓冲剂 Phenol red solution酚红 Potassium chloride KCl PFA : Polyfluoroalkoxy 过氟烷基化物 Potassium phosphate monobasic 磷酸二氢钾 Sodium fluoride氟化钠 Sodium dihydrogen phosphate monohydrate磷酸二氢钠一水合物 Sodium hydroxide NaOH Sodium bicarbonate NaHCO3 Sodium deoxycholate 脱氧胆酸钠 Sodium acetate anhydrate无水醋酸钠 Sodium carbonate Na2CO3 Sodium borate decahydrate硼酸钠十水合物 Sodium tetraborate decahydrate 四硼酸钠十水合物 Di-sodium hydrogen phosphate dehydrate 无水磷酸氢二钠Sodium thiosulfate pentahydrate 硫代硫酸钠 Sodium chloride Tricine 三羟甲基 Triethylammonium bicarbonate buffer三乙基碳酸氢铵Trichloroacetic acid三氯乙酸 Thiourea硫脲