质量检验操作规程
重庆卡顿尔食品有限公
司
产品质量检验操作规程
部门：品控部
编制：范昌勇
文件编号：KDRQC018
日期：2015年1月12日
一、菌落总数检测操作规程
检测国标：GB 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
样品：卡顿尔蛋糕、卡曲、西点类产品
产品国标：GB/T 20977-2007糕点通则；GB/T 20980-2007饼干
产品卫生标准：GB 7099-2003糕点、面包卫生标准； GB 7100-2003饼干卫生标准
菌落总数指标：糕点：热加工≤1500cfu/g，冷加工≤10000cfu/g
饼干：≤750cfu/g
试剂：生理盐水（约%）（磷酸盐缓冲溶液）；营养琼脂培养基（或平板计数琼脂培养基）；75%消毒酒精
设备：电子称（）、电子万用炉、灭菌锅、恒温水浴锅、超净工作台、电热恒温培养箱器具：250ml三角瓶、玻璃棒、烧杯（500ml）、试管（15*150或者18*180）、试管架、培养皿、镊子、钥匙、刻度吸量管（1ml、10ml）、移液器（100-1000ul）、酒精灯
操作步骤：
1.药品配制
营养琼脂培养基（配比：32g+1000ml蒸馏水）；生理盐水（+1000蒸馏水）（或磷酸盐缓冲溶液）；75%消毒酒精（500ml95%纯酒精+133ml蒸馏水）。
2.灭菌消毒准备
⑴往灭菌锅外层锅内加适量的水（水位刚好没过加热管，最好用硬度较低的水，避免结垢而缩短加热管的寿命）。
⑵培养皿成套同向整齐排列叠放，用干燥的牛皮纸（或者报纸）包裹卷紧，放入灭菌锅内套中。
⑶将准备好的试管、培养基、刻度吸量管、移液器枪头、生理盐水放入锅内，注意不要放置过于密集紧凑，以免影响蒸汽循环造成灭菌不彻底。
⑷盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。
⑸加热使锅内产生蒸汽，当压力表指针达到时，打开排气阀，将冷空气排出，此时压力表指针下降，当指针下降至零时，即将排气阀关好。注意冷空气必须充分排除，否则锅内温度达不到规定温度，影响灭菌效果。
⑹继续加热，锅内蒸汽增加，压力表指针又上升，当锅内压力增加到所需压力时，将火力减小（自动控制则无需手动操作，老式灭菌锅需手动切断电源来调节），使蒸汽压力升至，温度达°C，维持15~20分钟，然后将灭菌器断电或断火，让其自然冷后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物。
⑺无菌操作间和超净工作台紫外灯开启，关闭通道门，灭菌30-60分钟。
⑻更衣进入无菌间，操作前用75%消毒酒精对手部、样品盒表面、操作台、试管架等进行喷洒消毒。
3.样品处理
卡顿尔产品（含半成品）均为固体和半固体样品，样品处理方法如下：
称取25 g 样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
1:100样品液稀释方法：用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注
于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按此操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。
4.接种培养
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。接种操作必须在酒精灯5—10cm范围内进行。
及时将15 mL～20 mL 冷却至46℃的营养琼脂培养基（或者平板计数琼脂培养基）（可放置于 46±1℃恒温水浴箱中保温，恒温水浴锅提前打开，设定好温度，达到指定稳定后，在样品处理前将培养基放入其中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，水平放置，待冷却后放入培养箱培养，待琼脂凝固后，将平板翻转水平倒置于培养箱中，36±1℃培养48 h±2 h。
5.结果统计
选取菌落数在30CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按以下公式计算：
N=∑C/(n1+ n2)d
式中：N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
6.检测报告填写
若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。
若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字“四舍五入”修约后，取前 2 位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
二、霉菌检测操作规程
检测国标： GB 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数
样品：卡顿尔蛋糕、卡曲、西点类产品
产品国标：GB/T 20977-2007糕点通则；GB/T 20980-2007饼干
产品卫生标准：GB 7099-2003糕点、面包卫生标准； GB 7100-2003饼干卫生标准
菌落总数指标：糕点：热加工≤100cfu/g，冷加工≤150cfu/g
饼干：≤50cfu/g
试剂：蒸馏水；孟加拉红培养基；75%消毒酒精
设备：电子称（）、电子万用炉、灭菌锅、恒温水浴锅、超净工作台、电热恒温培养箱器具：250ml三角瓶、玻璃棒、烧杯（500ml）、试管（15*150或者18*180）、试管架、培养皿、镊子、钥匙、刻度吸量管（1ml、10ml）、移液器（100-1000ul）、酒精灯
操作步骤：
1.药品配制
孟加拉红培养基（配比：+1000ml蒸馏水）；蒸馏水；75%消毒酒精（500ml95%纯酒精+133ml蒸馏水）。
2.灭菌消毒准备同菌落总数检测灭菌操作
3.样品处理同菌落总数检测样品处理操作
4.接种培养同菌落总数检测接种操作，28℃±1℃培养5d。
5.结果统计
选取菌落数在 10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长
覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按以下公式计算：
N=∑C/（n1+ n2）d
式中：
N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
6.检测报告填写
计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。
若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多
不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算
菌落数在 100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。
菌落数大于或等于 100 时，前 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。
称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。
三、大肠菌群检测操作规程
检测国标： GB 、GB 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
样品：卡顿尔蛋糕、卡曲、西点类产品
产品国标：GB/T 20977-2007糕点通则；GB/T 20980-2007饼干
产品卫生标准：GB 7099-2003糕点、面包卫生标准； GB 7100-2003饼干卫生标准
菌落总数指标：糕点：热加工≤30MPN/100g，冷加工≤300MPN/100g
饼干：≤30MPN/100g
试剂：蒸馏水；月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST），煌绿乳糖胆盐培养基（BGLB）；75%消毒酒精设备：电子称（）、电子万用炉、灭菌锅、恒温水浴锅、超净工作台、电热恒温培养箱器具：250ml三角瓶、玻璃棒、烧杯（500ml）、试管（15*150或者18*180）、试管架、镊子、钥匙、刻度吸量管（1ml、10ml）、移液器（100-1000ul）、酒精灯
操作步骤：
1.药品配制
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST，配比：36g+1000ml蒸馏水）；煌绿乳糖胆盐培养基（BGLB，配比：40g+1000ml蒸馏水）；蒸馏水；75%消毒酒精（500ml 95%纯酒精+133ml蒸馏水）。
2.灭菌消毒准备同菌落总数检测灭菌操作
3.样品处理同菌落总数检测样品处理操作
4.接种培养
初发酵
根据对样品污染状况的估计，选择3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），取1ml 样品稀释匀液接种到装有灭菌LST培养基的试管（加入培养基前先放入小导管，倒置），每个稀释度接种3支试管。接种操作必须在酒精灯5—10cm范围内进行。整齐排放于试管架，置于培养箱中，36±1℃培养48 h±2 h。
培养结束，取出检查，没有产气则计为大肠菌群阴性，产气则保存准备进行复发酵试验。
复发酵
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
值查询
根据确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN 值。
四、水分（干燥失重）检测操作规程
检测国标： GB