细胞免疫组化常用试剂配制
免疫细胞化学常用试剂
一、固定剂
大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）
试剂：多聚甲醛40g
0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml
配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠
试剂：A液：多聚甲醛40g
蒸馏水400ml
B液：Na2HPO4·2H2O16.88g
蒸馏水300ml
C液：NaOH 3.86g
蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液
试剂：饱和苦味酸
40%甲醛250ml
冰醋酸50ml
配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液
试剂：多聚甲醛20g
饱和苦味酸 150ml
Karasson-Schwlt’s PB至1000ml
配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液
（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
试剂：过碘酸钠
赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：
多聚甲醛
蒸馏水
配制方法：
（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3）
试剂：多聚甲醛30g
25%戊二醛80ml
0.1mol/L PB 至1000ml
配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加
0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）
试剂：对苯醌 4.0g
0．01mol/L PBS 1 000ml
配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。
8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）
试剂：对苯醌20g
多聚甲醛15g
25%戊二醛40ml
0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml
配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液
试剂：0.05mol/L PB 500ml
0.01mol/L PBS 500ml
Tris 约14g
浓HCl 少许
ECD 10g
25%戊二醛 3.5ml
配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加
入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N
的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS 漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐
[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）
配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。为保证充分溶解，应在用前几天配制。
（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
（2）1% OsO4-PB：
试剂：A、2.26% NaH2PO4·2H2O 4.15ml
B2.52% 8.5ml
C、5.4% 葡萄糖5ml
D、OsO4 0.5g
配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。
（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：
试剂：2% OsO4水溶液10ml
0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）10ml
配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。但由于OsO4的反应产
物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s 液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamb oni’s液等混合固定液。
二、缓冲液
免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。
1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）
试剂：NaH2PO4·2H2O
Na2HPO4·12H2O
配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或Na2HPO4·7H2O 53.6g或Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。
（3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）
试剂：0.2mol/L PB 50ml
NaCl 8.5～9g(约0.15mol/L)
重蒸水至1000ml
配制方法：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。
PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。
0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/l PB的pH
值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。
3．Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液
试剂：NaH2PO4·H2O 3.31g
Na2HPO4·7H2O33.77g
重蒸水至1000ml
配制方法：同前
该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。
4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。
试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷) 60.57g
1N HCl 约420ml
重蒸水至1000ml
配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N 的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。
该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液。
5．Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered,Saline,TBS）
试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液100ml
NaCl 3.5～9g(0.15mol/L)
重蒸水至1000ml
配制：先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。
TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。
6．Tris-TBS(PBS)
试剂：Triton X-100 10ml(1%)或3ml(0.3%)
0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6）1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)
NaCl 8.5～9g
重蒸水至1000ml
配制方法：先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。
该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。
7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液
试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠500ml
0.1N HCl 28ml
蒸馏水至1000ml
配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N，最后取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。
8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表
（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）
(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10）
(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6）
(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）
注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。
（5）0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）
三、显色液
免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine）显色液
DAB即3，3-二氨基苯联胺
试剂：DAB（常用四盐酸盐）50mg
0.05mol/L TB 100ml
30% H2O2 30～40μl
配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液
配方1：4-Cl-1-萘酚100mg
纯乙醇 10ml
0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml
30% H2O2 10μl(0.003%)
配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。
配方2：4-Cl-1-萘酚
N-二甲基甲酰胺（DMF）
0.05mol/L TB(pH7.6)
30% H2O2
配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为5min左右。
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。
多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。
3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液
试剂：AEC 20mg
二甲基甲酰胺（DMF） 2.5ml
0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.5）50ml
30%H2O2 25ml
配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H2O2。切片显色时间为5～20min。
该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。
4．TMB显色液
试剂：TMB
HCl
亚硝基铁氰化钾
无水酒精
配制方法：
（1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml 中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。
（2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml 混合。
（3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
（4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。
（5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）继续孵育液20min 左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染5min后贴片、脱水、封片。
TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚
体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA
神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。
5．NBT显色液
试剂A液：5%NBT：称取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充分混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。
B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前恢复至室温。
C．显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管内，充分混匀；再加入B液40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。
NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐
（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。
四、粘附剂
在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常影响工作的质量的速度，故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。
1．铬矾明胶液
试剂：铬矾0.5g
明胶（Gelatine）5g
H2O ~1000ml
方法：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70℃。如有明显残渣，过滤后使用。
2．甲醛-明胶液
试剂：40%甲醛 2.5ml
明胶0.5g
蒸馏水至100ml
配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。
3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）
试剂：多聚赖氧酸 5g
蒸馏水 ~1000ml
配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。
4．Vectabond试剂该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮配）。处理载玻片前（事先酸处理），用染色缸装好各种液体，按下列程序进行：
干净载玻片→丙酮5min→Vectabond试剂工作液（7ml Vectabond+ 350ml 丙酮）：将载玻片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃过夜）→用铝箔包好，室温存放备用。
注意：避免污染（尘埃等）。
综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。
五、封固剂
1．甘油-TBS及甘油-PBS
配制方法：按比例将甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4℃，冰箱静止；待气泡排除后方可使用。
2．甘油-明胶（冻）
试剂：明胶 10g
甘油12ml
蒸馏水 100ml
香草酚少许
配制方法：称取1g明胶于温热（约40℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12ml甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。
3．液体石蜡液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。
4．DPX
试剂：Distrene 10g
酸二丁 5ml
二甲苯35ml
DPX为中性封固剂，用于多种染色方法匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售，可直接应用。若感过于粘稠，也可加少量二甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上出现许多干燥的空泡，影响观察，遇有这种情况，可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。
六、酶消化液
1．0.1%胰蛋白酶
试剂：胰蛋白酶0.1gm
0.1%氯化钙（pH7.8）100ml
配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度）。该消化液时间约为5～30min。
2．0.4%胃蛋白酶
试剂：胃蛋白酶400mg
0.1N HCl 100ml
配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。
3．0.06% Pronase
试剂：Pronase 0.06g
0.05mol/L TB(pH7.5) 100ml
配制方法：同前。
在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。
七、其它
1．蔗糖溶液免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为5%～30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。
（1）20%蔗糖液：
试剂：蔗糖20g
0.1mol/L PB(pH7.5) 至100ml
配制方法：先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml 充分混合，置4℃冰箱保存。
该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。
（2）20%蔗糖-5%甘油：
试剂：蔗糖 20g
甘油5ml
0.1mol/L PB 至100ml(约95ml)
配制方法：先用少许PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB 至100ml，于4℃保存备用。
该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为
2h左右）。
蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较为方便。若无试剂蔗糖（Sucrose）也可用普通蔗糖（Cane Sugar）。配制好的蔗糖溶液，放置时间超过一个月时，应重新配制。
2．T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。
30% Triton X-100的配制：
试剂：Triton X-100 28.2ml
0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml
配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。
Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。
3．甲醇-H2O2液
试剂：纯甲醇10ml
30% H2O2 0.1ml
配制方法：吸取30%的H2O20.1ml，加入100ml纯甲醇中，充分混匀即可，使H2O2终浓度为0.3%（也有的用0.03%、0.5%等）。
甲醇-H2O2处理组织标本，具有封闭内源性过氧化物酶活性的作用，但其具体机制至今仍不详。通常处理时间在室温约为5～30min。注意，用H2O2处理标本，对某些抗原的抗原性有影响，故建议在使用新的抗血清或抗原时，最好同时设立非处理对照组。
4．常用生理盐液
常用生理盐液的成分（g/1000ml）
配制方法：精确称取各种药品（如上表），加入500ml重蒸水中，待完全溶解后，补足重蒸水至1000ml，充分混匀即可。
在免疫细胞化学实验中，某些物质不宜经固定剂作用或经固定剂作用后仍易丢失，而需浸泡在生理盐液中。这些生理盐液的成分与正常哺乳动物血清的成分相似，能使组织离体后能处于尽量接近生理状态时的环境。Glucose通常是在用前临时加入。有的（如Kerbs液）在使用时通常需通入含CO2/O2为2.5～
5%/97.5～95%的气体。这些生理盐液中的CO2和二碳酸盐，主要起缓冲作用，Glucose主要是提供离体组织有限的代谢所需的能量。
常用免疫组化标记物精编版
常用免疫组化标记物公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料的基础要求
免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料的基本要求 2013-01-04 01:48 免疫组织化学抗体试剂及检测试剂是指一类利用免疫学原理结合酶催化底物显色的化学方法，检测组织标本中抗原的检测试剂。此类试剂为待测抗原特异性单克隆或多克隆抗体，或抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒。该类产品检测项目繁多，应用广泛，检测过程为多步骤检测，影响因素多，在临床上主要用于检测细胞的特异性抗原以确定细胞的表型。该类产品的预期用途与诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药相关，按照三类体外诊断试剂管理。 基于该类产品临床应用的重要性及特殊性，根据目前注册申报工作的需要、依据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》、《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》以及《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的相关规定，结合临床及病理检测中的应用实践、临床病理专家和生产企业的建议，现对免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料提出以下基本要求（对于本要求未提及的部分，申请人均应依据相关法规要求提交注册申报资料）。 本《要求》是在目前科学技术认识水平及现阶段免疫组化类产品技术审评基础上形成的，审评人员会密切关注相关技术的最新进展，随着认识的提高将适时调整。由于该类产品种类繁多，《基本要求》不能涵盖所有该类产品的特殊情况，如某些要求不适用，申请人也可采用其他方式证明产品的技术性能，建议申请人对此进行详细说明，并
提交相应的性能验证资料。 依据免疫组化不同标志物的临床应用情况，将其分为二个大类：A类：Her2/Neu、ER、PR、ALK、CD117、c-met、CD20、EGFR等与临床治疗、用药密切相关的标志物；其他全新标记物，具有新的临床意义。 B类：临床使用多个指标综合诊治的标志物之一，与辅助诊断、鉴别诊断、病情监测、预后相关标志物：如：Ki67、CK5/6等。 一、产品说明书 1. 【产品名称】：单独的第一抗体试剂通用名称建议采取以下命名方式：待测抗原特异性抗体+试剂（免疫组织化学法）。抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒通用名称建议采用以下命名方式：待测抗原+检测试剂盒（免疫组织化学法）。如：雌激素受体抗体试剂（免疫组织化学法）、孕酮受体检测试剂盒（免疫组织化学法）。 2. 【预期用途】：应明确检测的样本类型（冰冻和/或石蜡包埋等）；明确抗体的类型、克隆号、阳性着色特点；明确临床用途（诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药）；指明“对任何阳性或阴性结果的解读，应
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤 1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。 2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。 5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。 6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。 9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。 10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min 11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。 稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。 淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化) 另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20μl即可。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
细胞免疫组化常用试剂配制
免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
免疫组化步骤
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS
免疫组化方法(冰冻切片)
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
免疫组化试剂
免疫组化 免疫组化是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。 免疫组化试剂盒： Vector Laboratories公司VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒： Vector公司于1977年率先开发出了生物素-亲和素系统，该产品系列是检测方法上的重要革命。其后，公司发展出ABC技术（Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术），并建立了著名的VECTASTAIN?ABC系统，目前，该系统被视为最灵敏、最可靠与最有效的染色系统，并被广泛应用于免疫组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。ABC技术利用生物素和卵白素具有极高亲和性的生物学特征，将卵白素和生物素化辣根酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物。该法亦被称作三步法，第一步为biotin化二抗和一抗结合，第二步为avidin（亲和素，A液）和二抗上的biotin结合，第三步为HRP偶联的biotin（B液）和avidin结合，而HRP再催化底物显色完成染色。试剂盒组份： 2ml试剂A（Avidin DH溶液） 2ml试剂B（生物素化的酶） 1ml生物素化的二抗（1.5mg anti-IgG/0.5mg anti-IgM抗体/2.1mg通用抗体） 3ml阻断血清 其中standard试剂盒只含有试剂A和试剂B VECTASTAIN?ABC系列产品 VECTASTAIN?ABC-HRP Kits（辣根过氧化物酶）最通用的系统，使用范围广VECTASTAIN?ABC-AP Kits（碱性磷酸酶）灵敏度较高，染色密度较低，适于形态学染色非常重要的组织 VECTASTAIN?ABC-GO Kits（葡萄糖氧化酶）灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或AP 含量比较高的组织，常与HRP或AP系统配合进行双染。 VECTASTAIN?ABC Kits（辣根过氧化物酶）灵敏度高，特别适用于神经组织
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
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免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事 项 免疫组化 ，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等, 用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 ，免疫组化步骤 1, 切片，烤片60C, 1h;
2, 脱蜡及复水 二甲苯10min，100%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min，80%乙醇5min，75 %乙醇5min，60%乙醇5min，50%乙醇5min，30%乙醇5min，自来水1min，双氧水1min ； 3，1份30%H2O加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min; 4, 微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98E -100C）加热至沸腾，冷却（约5-10min）,反复两次； 5, 将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min； 6, 封闭，5%BSA室温20min,甩去多余液体； 7, 滴加一抗，37C, 1h,或者4C过夜； 8, PBS洗涤3次，每次3min； 9, 滴加二抗，37°C, 15-30min ； 10, PBS洗涤3次，每次3min； 11, 滴加SABC 37C, 30min ； 12, PBS洗涤3次，每次5min； 13, 1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀； 14, DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）; 15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水； 16, 苏木素复染2min,自来水冲洗； 17, 脱水 30%乙醇3min, 50%乙醇3min, 70%乙醇3min, 80%乙醇3min, 90%乙醇3min, 95%乙醇3min, 100%乙醇3min,二甲苯20min ； 18, 树胶封片，镜检。
常用实验试剂配制
1DEPC水(1‰) 1000ml 水 1ml DEPC 根据需要确定要配的体积，泡实验器具的DEPC水静止4小时后备用，泡24小时。配液体的DEPC水37℃过夜，送至高压，然后配相关溶液。 20.1M tris(ph 7.5) 12.114g tris 1000ml DEPC水 用HCL调ph至7.5，高压备用。 3 4%PFA的配制(ph 7.0)40g PFA 1000ml 0.1m tris(DEPC水配制高压) 将溶液持续加热至60℃左右，搅拌之至完全溶解，注意温度不要超过65℃，否则PFA降解失效。 30.2% 甘油/0.1M tris 20ml 甘油 980ml 0.1Mtris 4 20XSSC Nacl 175.3g （ph 7.0）柠檬酸钠88.2g DEPC水1000ml 分别稀释至2XSSC和0.2XSSC备用 5 HEPES 溶液HEPES 23.8g (ph6.8-8.0)DEPC H2O 100ml 6 50X Denhaldt′s 液 聚蔗糖（Ficoll 400）0.2g 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinypyrrolidone) 0.2g 牛血清蛋白（BSA）0.2g DEPC 水20ml 7 预杂交buffer Deinoized formanmid 5ml 20X SSC 1.5ml 1M HEPES 0.5ml 50X Denhanldt′s液1ml 龟精DNA 0.6ml(4ug/ul) DEPC水 1.4ml 龟精DNA 要先95℃10-15min加热变性，随即冰浴。杂交buffer分装后-20℃保存。 8Washing buffer (ph7.5) maleic acid 5.8g NACL 4.4g Tween（吐温） 1.5ml 定容至500ml溶质浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 0.3% Tween 9Maleic acid buffer (ph7.5) Maleic acid 5.8g Nacl 4.4g 定容至500ml 溶质的浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 10Detection buffer
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用 生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。 在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧 化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行 显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相 似而非特异性结合较亲和素低。SP 法简化了操作步骤， 同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免 疫绥化染色技术。 二、实验准备： 1. 标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h 。 2. 试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位， 可避免单克隆抗体图2. SP 法原理示意图
免疫细胞化学常用试剂介绍.
免疫细胞化学常用试剂介绍 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m 配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
免疫组化染色机种类介绍
自动化免疫组化染色机种类介绍 免疫组化的传统技术正在受到新的快速高敏的新技术的挑战，一方面是新试剂的推出，如SP、EPOS、Envision和CSA，另一方面是自动免疫组化染色机的问世。免疫组化技术正进入一个新的发展阶段。从先进国家免疫组化规范化或标准化的进程来看，自动免疫组化染色机的应用几乎贯穿始终，早在20世纪末已得到极大的普及，然而国内的自动免疫组化染色机应用则在近几年才得以发展。浙江省肿瘤医院作为省内较早应用的少数单位之一，在自动化免疫组化染色的使用和质量控制方面获得些许经验，在此做简单的介绍交流。 自动化免疫组化染色技术是由电脑控制整个染色程序的免疫组化染色机，具有自动加抗体、自动冲洗、显色、复染及预处理等功能，有全自动和半自动、封闭型和半开放型之分。根据不同仪器大小，每次染色20～240张切片不等，整个染色程序约需60～90min左右，它不仅可以应用于免疫组化染色，某些仪器还可应用于组织化学染色、特殊染色及原位分子杂交染色。目前较为理想的仪器为Roche公司、Lecia公司及Thermo公司的产品等。下面对不同机型的自动免疫组化染色机的特点分述如下。 Thermo公司的LabVision Autostainer 该机型属开放式半自动系统类型，用户可任意编辑所需试剂及模板，内建试剂兼容性检测。切片特殊染色模板可任意调整试剂量、孵育时间。体系开放保证可适就性强，即可同时运行不同检测试剂盒和不同的染色程序及不同厂商生的的一抗。使用单一探头，探头材料为特氟伦包被不锈钢，检测探头交叉污染残留物 <10-6 ，且分样精度>99%(总体积)。联合使用配套的抗原修复仪，可实现脱蜡与抗原修复一步完成。DAKO公司的 Autostainer系LabVision Autostainer贴牌产品，配合使用DAKO的Flex检测系统可获得极为敏感的免疫组化结果。早期的Biogenex i6000TM全自动染色仪亦属该类型产品，不同的是其加样头采用标准的Tip头加样，完全避免交叉污染的风险。 Lecia公司的Bond-Max