第十二章 分光光度分析法
第十二章分光光度分析法
（一）判断题
1. 可见光的波长范围在400-760nm之间。（）
2. 吸光度A与透光度T成反比。（）
3. 朗伯-比尔定律只适用于单色光。（）
4. 同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有相同的ε值。（）
5. 可见光源用钨丝白炽灯，紫外光源用氘灯。（）
6. 若显色剂用量多，则显色反应完成程度高，故显色剂用量越多越好。（）
7. 一般来说，加入有机溶剂，可以提高显色反应的灵敏度。（）
8. 浓度相对误差仅与仪器读数误差相关。（）
9. 浓度较高时测量相对误差大，浓度较低时，测量相对误差小。（）
10. 符合朗伯-比尔定律的某有色溶液稀释时，其最大吸收波长λmax向长波方向移动。（）
11. 有色溶液的吸光度随溶液浓度增大而增大，所以吸光度与浓度成正比。（）
12. 在光度分析中，溶液浓度越大，吸光度越大，测量结果越准确。（）（二）填空题
1. 朗伯-比尔定律数学表达式：A=kbc，式中A代表，b代表，c代表，k代表。当c的单位用mol·L-1表示时，k以符号表示，称为。
2. 下列物质水溶液选择吸收光的颜色为：CuSO4；K2Cr2O7； KMnO4。
3. 光度计的种类和型号繁多，但都主要由、、、、五大部件组成。
4. 分光光度计的表头上，均匀的标尺是，不均匀的标尺是。
5. 为了降低测量误差，吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是，吸光度为时，测量误差最小。
6. 在以参比溶液调节仪器的零点时，因无法调至透光度为100%，而只好调节至95%处，此处测得一有色溶液的透光度读数为35.2%，该有色溶液的真正透光度为。
7. 二苯硫腙的CCl4溶液吸收580 ~ 620nm范围内的光，它显色。
8. 测量某有色配合物在一定波长下用2cm比色皿测定时其T =0.60，若在相同条件下改用1.0cm比色皿测定，吸光度A为，用3.0cm比色皿测定，T为。
9. 苯酚在水溶液中摩尔吸光系数为6.17?103 L·cm—1·mol—1，若要求使用1.0cm比色皿，透光度在0.15 ~ 0.65之间，则苯酚的浓度应控制在。
10. 吸光光度分析的方法有、、等。
（三）选择题
1. 在吸光光度法中，透射光强度与入射光强度之比称为（）
A．吸光度 B. 透光度 C. 消光度 D. 光密度
2. 有色溶液的摩尔吸光系数ε与下列哪种因素有关（）
A．入射光波长 B.液层厚度 C.有色物质浓度 D.有色物质稳定性
3. 透光度与吸光度的关系是（）
A. 1/T = A
B. lg1/T = A
C. lg T = A
D. T = lg1/A
4. 若测得某溶液在λmax时A>0.8，可以采取下列哪些措施？（）
A.增大光源亮度
B.改变入射光波长
C.稀释溶液
D.换用小的比色皿。
5. 邻菲罗林测Fe，合适的参比溶液（）
A．样品空白 B.试剂空白 C.蒸馏水空白
6. 分光光度法测定钴盐中微量Mn，加入无色氧化剂将Mn2+氧化为MnO4-，测定中应选（）
A.试剂空白
B.不加氧化剂的样品空白
C. 蒸馏水空白
7. 一有色溶液，测得 A = 0.701，其T %为 （ ）
A ． 10.7 B.19.9 C.15.8 D.25.2
8. KMnO 4溶液吸收白光中的 （ ）
A ．黄光 B.红光 C.蓝光 D.绿光
9. 符合朗伯-比尔定律的有色溶液，当其浓度增大后 （ ）
A. λmax 不变 B .T 增大 C. A 减小 D.ε 增大
10. 有A 、B 两份完全相同的有色物质溶液，A 溶液用1.0cm 比色皿，B 溶液用2.0cm 比色
皿，在同一波长下测得的吸光度值相等，则它们的浓度关系为。 （ ）
A. C A = 1/2C B
B. B A c c =
C. C A = 2C B
D. 2B A c c =
（四）计算题
1. 有一KMnO 4溶液，盛于1cm 比色皿中，在560nm 波长的单色光下测得透光度为60%，如
将其浓度增大1倍，其它条件不变，吸光度为多少？
2. Fe 2+用邻二氮菲显色，当Fe 2+的浓度ρ =0.76μg ·mL —1，于510nm 波长处、用2.0cm 的比
色皿测得透光度为50.2%，求该显色反应的摩尔吸光系数。
3. 当用纯溶剂作参比时，浓度为c 的溶液的吸光度为0.4343，假定光度读数误差为0.20%，
其浓度c 的相对误差应为多少？
4. 某有色物M 为125g ·mol —1在λ=480nm 时ε =2500L ·cm —1·mol —1。某样品含该物质约1.5%，
试样溶解后稀释至100.0mL ，用1.0cm 比色皿测量吸光度A 。为使测量引起的相对浓度误差
最小，应称取样品多少克？
5. 已知KMnO 4 的ε 545 =2.23?103 L ·cm —1·mol —1。某KMn04溶液100mL 含KMn04 8.0?10—3g ，
用1cm 比色皿测定，其吸光度和透光度各为多少？
6. 用双硫腙光度法测定Pb 2+时，Pb 2+的浓度为0.08mg/50mL ，用2cm 比色皿于520nm 下测得
T = 53%，求其摩尔吸光系数。
7. 有一溶液，每毫升含铁0.056mg ，吸取此试液2.0mL 于50mL 容量瓶中显色，用1.0cm
比色皿于508nm 处测得A =0.400，计算吸光系数a ，摩尔吸光系数ε （M Fe =55.85g ·mol
—1）。
8. 若分光光度计透光度读数的绝对误差?T =0.005，计算下列溶液浓度的相对误差。⑴ T
= 0.016； ⑵ A = 0.412。
9. 称取0.500g 钢样，溶于酸后，使其中的Mn 氧化成MnO 4-，将溶液稀释至100.0 mL 。稀
释后的溶液用2.0cm 的比色皿在波长520nm 处测得A = 0.620，MnO 4-在此波长处的ε =2235
L ·mol —1·cm —1 ，计算钢样中Mn 的质量分数。
10. 某钢样含镍为0.12%，用丁二铜圬显色，ε =1.3?104 L ·cm —1·mol —1。若钢样溶解显
色后，其溶液体积为100mL ，在波长470nm 处用1.0cm 比色皿测定，希望测量误差最小，应
称取试样多少克？
11. 称取钢样0.500g 溶解后定量转入100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度。从中移取10.0mL
试液置于50mL 容量瓶中，将其中Mn 2+氧化为MnO 4-，用水稀释至刻度，摇匀。于520nm 处用
2.0cm 比色皿测量吸光度A = 0.50，计算钢样中Mn 的质量分数。 （ε 520 =2.3?103L ·mol
—1·cm —1；M Mn =54.94g ·mol —1）
12. 普通光度法测得4.0?10—4mol ·L —1KMnO 4溶液的吸光度A =0.880，用该标准液作参比液，
在相同条件下测得未知浓度的KMnO 4溶液的吸光度A = 0.301，计算未知液中KMnO 4的浓度。
13. 浓度为2.0?10—4mol ·L —1的甲基橙溶液，在不同pH 值的缓冲溶液中，于520nm 波长下
用1.0cm 比色皿测得下列数据：
pH 0.88 1.17 2.99 3.41 3.95 4.89 5.50
A 0.890 0.890 0.692 0.552 0.385 0.260 0.260
计算甲基橙的p K a θ。
四、自我检测题答案
（一）判断题
1. √
2. ?
3. √
4. ?
5. √
6. ?
7. √
8. ?
9. ?
10. ? 11. √ 12. ?
（二）填空题
1. 吸光度；液层厚度；溶液浓度；比例系数；ε；摩尔吸光系数
2. 黄；青蓝；绿
3.
光源 单色器 比色皿 检测器 显示记录系统 4. 透光度值 吸光度值 5.
0.2~0.8 0.434 6. 37.1% 7. 蓝 8. 0.111；0.46 9.（3.2?10—5~1.3?10—4）
mol ·L —1 10. 目视比色法；光电比色法；分光光度法
（三）选择题
1. B
2. A
3. B
4. C D
5. B
6. B
7. B
8. D
9. A
10. C
（四）计算题
1. 解：b 1 = 1cm A 1 = -lg T 1 = -lg0.60 = 0.22
C 2=2C 1 44.0222.01
11212=?==C C C C A A 2. 解：M （Fe ）=55.85g ·mol -1；ρ =7.6?10-4g ·L -1；
c =7.6?10-4/55.85 =1.36?10-5mol ·L -1
A = 2 -lg50.2 = 0.229 45101110361022290?=??==
-....bc A ε（L ·mol -1·cm -1）
3. 解：A =-lg T ， A =0.4343 ∴ T =0.368 368
.0lg 368.00020.0434.0??=?C C = 0.0054 = 0.54% 4. 解：A =0.434时 ?C /C 最小 ， 0.434 = 2500?1×c 则， c =1.7?10-4（mol ·L -1）
设应称取m g 样品 4107.11251001000015.0-?=?
?m m = 0.14（g ）
5. 解：查得M （KMnO 4）= 158.03 g ·mol —1
C （KMnO 4）= 8.0?10-3/100.0?10-3?158.03 = 5.1?10-4(mol ·L -1)
A =εbc = 2.23?103?1?5.1?10-4=1.13 T = 0.074=7.4%
稀释后 A = 1.13/2 = 0.57； T = 0.27 = 27%
6. 解：T = 53% A = -lg T = -lg0.53 = 0.28
C （Pb 2+）=
6331076.710502071008.0---?=???（mol ·L —1） 46108.110
7.7228.0--?=??==bC A ε （L ·mol —1·cm —1）
7. 解：⑴ 计算吸光系数a
显色液内Fe 的浓度为 33
3102.250
10210056.0--?=???=c （g ·L —1） 23108.110
2.21400.0?=??==-bC A a （L ·g ·cm —1） ⑵计算摩尔吸光系数 ε
显色液内Fe 的浓度为： 53
3100.485
.555010210056.0--?=????=c （mol ·L —1） 45
100.1100.440.0?=?==-bC A ε（L ·mol —1·cm —1） 8. 解： 根据公式
T T T c c ?=?lg 434.0 （１）T =0.016 5.7075.0005.0016
.0lg 016.0434.0==??=?C C % （２）A =0.412 则 T = 0.387，
4.1014.000
5.0412
.0387.0434.0==??=?C C % 9. 解： 查得M Mn = 54.9 g ·mol —1 4104.10
.22235620.0-?=?==b A C ε（mol ·L —1） 50
.09.541.0104.14???==-S m m ω = 0.0015 10. 解：查得 M Ni = 58.69 g ·mol —1 54103.30
.1103.1434.0-?=??==b A C ε（mol ·L —1） 435N 10911010010336958---?=????=...m i （g ）
称试样质量 1600012
010914
N ...W m m i S =?==-（g ） 11. 解：50mL 显色液中MnO 4-的浓度 43101.110
3.22500.0-?=??==b A c ε（mol ·L —1） 试液中Mn 的质量，m （Mn ）=C V M = 1.1?10-4?50?10
100?10-3?54.94 = 3.0?10-3（g ） 500
.0100.33
-?=ω = 0.0060 12. 解：?A = 0.301 A S =0.880 C S = 4.00?10-4mol ·L —1
?A =εb ?C ， S
S C C A A ?=? 441037.11000.4880
.0301.0--?=??=?=?S S C A A C （mol ·L —1） ?C = C X -C S
C X = ?C + C S =1.37?10-4 + 4.00?10-4 = 5.37?10-4（mol ·L —1）
13. 甲基橙为酸碱指示剂，用HIn 表示。HIn = H + + In -
从数据可以看出：pH < 1.17时，A 为定值，说明甲基橙此时基本上以HIn 型体存在，即C = C HIn 。吸光度全由HIn 型体贡献，记作A HIn 。pH > 4.89时，A 也为定值，说明甲基
橙在此酸度基本以In -型体存在，即C = C In-，溶液的吸光度全由In -型体贡献记作A In-。
1.17 A = A HIn + A In 。 根据（8-10）式 p K a θ = pH + lg A A A A In --- HIn A HIn = 0.890 A In- = 0.260 将题给数据代入上式 PH=2.99时 p K a θ= 2.99 + lg 33.3692 .0890.0260.0692.0=-- PH=3.41时 p K a θ= 3.41 + lg 35.3552 .0890.0260.0552.0=-- PH=3.95时 p K a θ= 3.95 + lg 34.3385 .0890.0260.0385.0=-- p K a θ = 34.3334.335.333.3=++ 第20章比色法和分光光度法 【20-1】将下列百分透光度值换算为吸光度： （1）1% （2）10% （3）50% （4）75% （5）99% 解：A＝2－lg T% （1）A=2－lg 1 = 2.000 （2）A=2－lg 10 = 1.000 （3）A=2－lg 50 = 0.301 （4）A=2－lg 75 = 0.125 （5）A=2－lg 99 = 0.0044 【20-2】将下列吸光度值换算为百分透光度： （1）0.01 （2）0.10 （3）0.50 （4）1.00 解：lgT%=2－A （1）lgT1%=2－0.01 = 1.99 T1%=97.7 % （2）lgT2%=2－0.10 = 1.90 T2%=79.4 % （3）lgT3%=2－0.50 = 1.50 T3%=31.6 % （4）lgT4% =2－1.00 =1.00 T4%=10.0 % 【20-3】有一有色溶液，用1.0 cm 吸收池在527 nm 处测得其透光度T = 60%，如果浓度加倍，则（1）T值为多少？ （2）A 值为多少？ （3）用5.0 cm 吸收池时，要获得T = 60%，则溶液的浓度为原来浓度的多少倍？ 解：A＝－lg T =εbc －lg 0.60 = 0.222 浓度增倍时： （1）lg T =－0.444 T= 36 % （2）A＝－lg T = 0.444 （3）1.0cm时：c1 = 0.222 5.0cm时：c2 = 0.222 c2/c1= 1.0 /5.0 = 0.2倍 【20-4】有两种不同浓度的KMnO4溶液，当液层厚度相同时，在527nm处透光度T分别为（1）65.0%，（2）41.8%。求它们的吸光度A各为多少？若已知溶液（1）的浓度为6.51×10-4mol·L-1，求出溶液（2）的浓度为多少？ 解：（1）A＝εbc =－lgT＝－lg 0.650 = 0.187 （2）A＝－lg 0.418 = 0.379 （3）当c1= 6.51×10-4 mol ? L-1时， 紫外-可见分光光度法 一、选择题（其中1~14题为单选，15~24题为多选） 1．以下四种化合物，能同时产生B吸收带、K吸收带和R吸收带的是（） A. CH2CHCH O B. CH C CH O C. O CH3 D. CH CH2 2．在下列化合物中，π→π*跃迁所需能量最大的化合物是（） A. 1,3-丁二烯 B. 1,4-戊二烯 C. 1,3-环已二烯 D. 2,3-二甲基-1,3-丁二烯 3．符合朗伯特-比耳定律的有色溶液稀释时，其最大吸收峰的波长位置（） A. 向短波方向移动 B. 向长波方向移动 C. 不移动，且吸光度值降低 D. 不移动，且吸光度值升高 4．双波长分光光度计与单波长分光光度计的主要区别在于（） A. 光源的种类及个数 B. 单色器的个数 C. 吸收池的个数 D. 检测器的个数 5．在符合朗伯特-比尔定律的范围内，溶液的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系是（） A. 增加、增加、增加 B. 减小、不变、减小 C. 减小、增加、减小 D. 增加、不变、减小 6．双波长分光光度计的输出信号是（） A. 样品吸收与参比吸收之差 B. 样品吸收与参比吸收之比 C. 样品在测定波长的吸收与参比波长的吸收之差 D. 样品在测定波长的吸收与参比波长的吸收之比 7．在紫外可见分光光度法测定中，使用参比溶液的作用是（） A. 调节仪器透光率的零点 B. 吸收入射光中测定所需要的光波 C. 调节入射光的光强度 D. 消除试剂等非测定物质对入射光吸收的影响 8．扫描K2Cr2O7硫酸溶液的紫外-可见吸收光谱时，一般选作参比溶液的是（） A. 蒸馏水 B. H2SO4溶液 C. K2Cr2O7的水溶液 D. K2Cr2O7的硫酸溶液 9．在比色法中，显色反应的显色剂选择原则错误的是（） A. 显色反应产物的ε值愈大愈好 B.显色剂的ε值愈大愈好 C. 显色剂的ε值愈小愈好 D. 显色反应产物和显色剂，在同一光波下的ε值相差愈大愈好 10．某分析工作者，在光度法测定前用参比溶液调节仪器时，只调至透光率为95.0%，测得某有色溶液的透光率为35.2%，此时溶液的真正透光率为（） A. 40.2% B. 37.1% C. 35.1% D. 30.2% 11．用分光光度法测定KCl中的微量I—时，可在酸性条件下，加入过量的KMnO4将I—氧化为I2，然后加入淀粉，生成I2-淀粉蓝色物质。测定时参比溶液应选择（） A. 蒸馏水 B. 试剂空白 C. 含KMnO4的试样溶液 D. 不含KMnO4的试样溶液 12．常用作光度计中获得单色光的组件是（） A. 光栅(或棱镜)+反射镜 B. 光栅(或棱镜)+狭缝 C. 光栅(或棱镜)+稳压器 D. 光栅(或棱镜)+准直镜 13．某物质的吸光系数与下列哪个因素有关（） A. 溶液浓度 B. 测定波长 C. 仪器型号 D. 吸收池厚度 14．假定ΔT=±0.50％A=0.699 则测定结果的相对误差为（） A. ±1.55％ B. ±1.36％ C. ±1.44％ D. ±1.63％ 15．今有A和B两种药物的复方制剂溶液，其吸收曲线相互不重叠，下列有关叙述正确的是（） A. 可不经分离，在A吸收最大的波长和B吸收最大的波长处分别测定A和B B. 可用同一波长的光分别测定A和B 紫外可见吸光分光光度法在环境分析中的应用领域 摘要：紫外可见分光光度法是一种应用很广的方法。在学习其基本原理和仪器结构后，得到该分析方法是一种具有广谱适用性的分析方法。本文综述了紫外可见分光光度法的原理特点以及在环境监测中的应用，并且具体举例说明，概述了紫外可见分光光度法的应用方法以及注意事项。 关键词：紫外可见分光光度法，朗伯比尔定律，特点，水与废水，大气 1.引言 随着社会环保意识的增强，人们对环保工作越来越重视。企业废水的分析与处理已经极大地影响着企业的发展和效益。更深刻影响着人们的日常生活。现在测试水和废水的仪器有紫外可见分光光度计。它已在各个科学研究领域和现代生产与管理部门广泛应用。 2.紫外可见分光光度计基本原理 紫外可见吸光光度法是根据物质对紫外光和可见光选择性吸收而进行分析的方法。吸光光度法的理论基础是光的吸收定律———朗伯—比尔定律，其数学表达式为 A=Kdc 朗伯—比尔定律的物理意义是，当一束平行单色光垂直通过某溶液时，溶液的吸光度A与吸光物质的浓度c及液层厚度d成正比。当液层厚度d以cm、吸光物质浓度c以“mol·L-1”为单位时，系数K就以ε表示，称为摩尔吸收系数。此时朗伯—比尔定律表示为 A=εdc 式中摩尔吸收系数单位为L·mol-1·cm-1。 吸光光度法具有较高的灵敏度和一定的准确度，特别适宜于微量组分的测量。 3.特点 （1）应用广泛 由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素（除少数放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。 Kr Rb Sr Y Zr Nb Mo Tc Ru Rh Pd Ag Cd In Sn Sb Te I Xe Cs Ba La Hf Ta W Re Os Ir Pt Au Hg Tl Pb Bi Po At Rn Fr 注： 图内实线圈内的元素可用直接法测定，虚线圈内的元素可用间接法测定。 带A 的表示与环境污染有关的元素。其中放射性元素只有铀和钍常用光度法测定，其它元素都采用放射性分析测量。 （2）灵敏度高 由于相应学科的发展，使新的有机显色剂的合成和研究取得可喜的进展，从而对元素测定的灵敏度大大提高了一步。特别是由于多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到几十万。相对于其它痕量分析方法而言，光度法的精密度和准确度一致公认是比较高的。 （3）选择性好 目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法了。 （4）准确度高 对于一般的分光光度法来说，其浓度测量的相对误差在1-3%范围内，如采用示差分光度法测量，则误差往往可减少到千分之几。 （5）适用浓度范围广 可从常量（1-50%）（尤其是使用示差法）到痕量（10-8-10-6%）（经预富集后）。（6）分析成本低、操作简便、快速 由于分光光度法具有以上优点，因此目前仍广泛地应用于化工、冶金、地质、 第六章 吸光光度法 一、问答题 1. 摩尔吸收系数的物理意义是什么？其大小和哪些因素有关？在分析化学中κ有何意义？ 2. 朗伯－比尔定律的物理意义是什么？什么是透光度？什么是吸光度？二者之间的关系是什么？ 3. 为社么物质对光发生选择性吸收？ 4. 分光光度计有哪些主要部件？它们各起什么作用？ 5 当研究一种新的显色剂时，必须做哪些实验条件的研究？为什么？ 6 什么是吸收光谱曲线？什么是标准曲线？它们有何实际意义？利用标准曲线进行定量分析时可否使用透光度T 和浓度c 为坐标？ 7 测定金属钴中微量锰时在酸性液中用KIO 3将锰氧化为高锰酸根离子后进行吸光度的测定。若用高锰酸钾配制标准系列，在测定标准系列及试液的吸光度时应选什么作参比溶液？ 8 吸光度的测量条件如何选择？为什么？普通光度法与示差法有何异同？ 9 光度分析法误差的主要来源有哪些？如何减免这些误差？试根据误差分类分别加以讨论。 10 常见的电子跃迁有哪几种类型？ 11 在有机化合物的鉴定和结构判断上，紫外－可见吸收光谱提供信息具有什么特点？ 二、计算题 1．以邻二氮菲光度法测定Fe (Ⅱ)，称取试样0.500g ，经处理后，加入显色剂，最后定容为50.0mL ，用1.0 cm 吸收池在510 nm 波长下测得吸光度A =0.430，计算试样中的w (Fe)(以 百分数表示)；当溶液稀释一倍后透射比是多少？（ε510=1.1×104 ） 2．%0.61%10010 =?=-A T 已知KMnO 4的ε 545 =2.2×103 ，计算此波长下浓度为0.002% （m/v ）KMnO 4溶液在3.0cm 吸收池中的透射比。若溶液稀释一倍后透射比是多少？ 3. 以丁二酮肟光度法测定镍，若络合物NiDx 2的浓度为1.7×10-5mol ·L -1 ，用2.0cm 吸收 池在470nm 波长下测得的透射比为30.0%。计算络合物在该波长的摩尔吸光系数。 4. 根据下列数据绘制磺基水杨酸光度法测定Fe （Ⅲ）的工作曲线。标准溶液是由0.432g 铁铵矾[NH 4Fe(SO 4)2·12H 2O]溶于水定容到500.0mL 配制成的。取下列不同量标准溶液于50.0mL 容量瓶中，加显色剂后定容，测量其吸光度。 V (Fe(Ⅲ))（mL ） 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 A 0.097 0.200 0.304 0.408 0.510 0.618 测定某试液含铁量时，吸取试液5.00mL ，稀释至250.0mL ，再取此稀释溶液2.00mL 置于50.0mL 容量瓶中，与上述工作曲线相同条件下显色后定容，测得的吸光度为0.450，计算试液中Fe(Ⅲ)含量（以g/L 表示）。 5. 以PAR 光度法测定Nb ，络合物最大吸收波长为550nm ，ε=3.6×104 ；以PAR 光度法测定 Pb ，络合物最大吸收波长为520nm ，ε=4.0×104 。计算并比较两者的桑德尔灵敏度。 6. 有两份不同浓度的某一有色络合物溶液，当液层厚度均为1.0cm 时，对某一波长的透射 水质铵的测定纳氏试剂比色法 1适用范围 1.1本标准适用于生活饮用水、地面水和废水。 1.2样品中含有悬浮物、含氯、钙镁等金属离子、硫化物和有机物时，会产生干扰，含有此类物质时，要作适当的预处理，以消除对测定的影响。 1.3范围 最大试份体积为50m l时，铵氮浓度C N可达2m g /L。 1.4最低检出浓度 1.4.1目视法 试份体积为50m l时，最低检出浓度为0.02m g /L。 1.4.2分光光度法 试份体积为50m l，使用光程长为10m m比色皿时，最低检出浓度为0.05m g / L。 1.5灵敏度 使用50m l试份，光程长为10m m比色皿,C N =1.0m g / L，给出的吸光度约为0.2个单位。 2原理 游离态的氨或铵离子等形式存在的铵氮与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物，该络合物的色度与铵氮的含量成正比，可用目视比色或者用分光光度法测定。 3试剂 分析中只使用公认的分析纯试剂和按3.1制备的水。 3.1水：无氨，按下述方法之一制备。 3.1.1离子交换法 将蒸馏水通过一个强酸性阳离子交换树脂（氢型）柱，流出液收集在带有磨口玻璃塞的玻璃瓶中。每升流出液中加人10g 同类树脂，以利保存。 3.1.2蒸馏法 在1000m l蒸馏水中，加人0.1m l硫酸（p=1.84g/m l)，并在全玻璃蒸馏器中重蒸馏。弃去前50m l馏出液，然后将约800m l馏出液收集在带有磨口玻璃塞的玻璃瓶中。每升收集的馏出液中加人10g 强酸性阳离子交换树脂（氢型），以利保存。 3.2纳氏试剂。 3.2.1二氯化汞一碘化钾一氢氧化钾（H gC l2一K I一K O H) 称取15g 氢氧化钾（K O H)，溶于50m l水中，冷至室温。 称取5g 碘化钾〔K I )，溶于10m l水中，在搅拌下，将2.5g 二氯化汞（H gC l2）粉末分次少量加人于碘化钾溶液中，直到溶液呈深黄色或出现微米红色沉淀溶解缓慢时，充分搅拌混和，并改为滴加二氯化汞饱和溶液，当出现少量朱红色沉淀不再溶解时，停止滴加。 在搅拌下，将冷的氢氧化钾溶液缓慢地加人到上述二氯化汞和碘化钾的混合液中，并稀释至100m l于暗处静置24h，倾出上清液，贮于棕色瓶中，用橡皮塞 第一章荧光分光光度分析法 1.1概述 1.1.1 基本原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态,这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。 不同物质由于分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 1.1.2 基本结构 图1 荧光分光光度计工作原理示意图 （1）光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 （2）激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。 （3）发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。 （4）样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。（5）检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。 1.1.3 仪器操作规程 1.1.3.1 开机 a. 确认所测试样液体或固体，选择相应的附件。 b. 先开启仪器主机电源，预热半小时后启动电脑程序RF-5301PC，仪器自检通过后，即可正常使用。 1.1.3.2 测样 （1）spectrum模式 a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。 ?对于做荧光光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Emission；给定EX波长；给定EM的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”完成参数的设定。 ?对于做激发光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Excitation；给定EM波长；给定EX的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。 b. 在样品池中放入待测的溶液，点击“Start”，即可开始扫描。 c. 扫描结束后，系统提示保存文件。可在“Presentation”中选择“Graf” “Radar” “Both Axes Ctrl+R”来调整显示结果范围；在“Manipulate” 中选择“Peak Pick”来标出峰位，最后在“Channel”中进行通道设定。 d. 述操作步骤对固体样品同样适用。 （2）Quantitative模式 a. 在“Acquire Mode”中选择“Quantitative”模式。 b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下： Method 选择“Multi Point Working Curve” ；“Order of Curve” 中选择“1st和 双波长分光光度法的基本原理及应用 应用分光光度法对共存组分进行不分离定量测定时，通常采用的方法有双波长法，三波长法，导数光谱法、差谱分析法及多组分分析法等方法，其快速，简便的优点使这些方法在实用分析中得到越来越广泛的应用。其中以双波长法的应用为最多，该法的准确度和精密度要高于其它方法，是对共存组分不分离定量测定的有效方法之一。 实用中的双波长法主要采用等吸收波长法和系数倍增法两种分析方法，下面就其基本原理和应用作以介绍： 一、等吸收波长法 1、基本原理 图1是同一组分三个不同浓度供试液的吸收光谱图，经典分光光度法的定量测定通常是在被测组分的最大吸收波长处进行测定，根据兰伯一比耳定律，其吸光度值与被测组分的浓度C成正比，即： 依（3）式测定被测组分a，则可完全消除b组分的干扰，达到共存组分不分离进行定量测定的目的。 2、影响因素 （1）测定波长和组合波长的选择应使被测组分的△A值尽可能大，以增加测定的灵敏度和精确度。 （2）测定波长和组合波长应尽可能选择在光谱曲线斜率变化较小的波长处，以减小波长变化对测定结果的影响。 （3）干扰组分等吸收波长（组合波长）的选择必须精确，只有其△A值等于零时才能完全消除干扰，否则会引入测定误差。为此，在实用分析中，都是先配制一个干扰组分b的供试液，在仪器上准确找出等吸收波长，然后再对样品进行测定。 3 应用实例 等吸收波长法的一个典型应用实例为收载于《中华人民共和国药典》中的抗菌消炎药复方磺胺甲噁唑片的含量测定。复方磺胺甲噁唑片中含有磺胺甲噁唑（SMZ）和甲氧苄（TMP）两个成分，其吸收光谱见图3。 当测定SMZ时，选择其最大吸收波长257nm为测定波长，可以在干扰组分TMP的光谱曲线上304nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰；当测定TMP时，选择239nm为测定波长，可以在干扰组分SMZ的光谱曲线上295nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰，分别对SMZ和TMP进行含量测定。 二、系数倍增法 1 基本原理 比色法及分光光度法 第一节 一、填空题。 1.比色法及分光光度法同化学分析法比较具有___________、_____________、_____________、_______________等四个特点。 2.光的波长范围在___________称为可见光，波长小于__________称为紫外光，波长大于___________称为红外光。 3.____________通过三棱镜就可分解为____________________，这种现象称为光的色散。 4.光吸收程度最大外的波长叫做_____________，用_________表示。 5.同物质不同浓度的溶液λmax不变，具有____________的吸收曲线，不同物质具有__________的吸收曲线，可以此进行物质的___________。 6.物质呈现一定的颜色是由于___________。 7.同一物质不同浓度在一定波长处吸光度随浓度增加而________,这个特性可作为_________的依据。 二、选择题。 1.已知光的波长λ=800nm，则它应属于（） A、红光 B、紫光 C、红外光 D、紫外光 2.Fe（SCN）3溶液（红色）的吸收光颜色为（） A、红色 B、黄色 C、蓝色 D、蓝绿色 3.绿光的互补色为（） A、紫红色 B、橙色 C、绿蓝 D、蓝绿色 4.二苯硫腙的CCl4溶液吸收580~600nm范围的光，它显（）色。 A、绿色 B、蓝色 C、紫色 D、黄色 三、判断题。 1.白光是一种可见光。（） 2.同一物质不同浓度的有色溶液λmax不变。（） 3.在λmax处测定吸光度则灵敏度最高。（） 4.比色法及分光光度法同化学分析比较，准确度高，灵敏度低。（） 5.硫酸铜溶液因吸收了白光中的红色而呈现蓝色。（） 第二节光吸收定律 一、填空题。 1.光吸收定律又称_______，它表明当_______________垂直通过______________，溶液的吸光度A与______________及____________成______。其数学表达式为_______________。 2.偏离朗伯—比耳定律的因素有________、_________、_________、_______等四方面。 二、选择题。 1.某有色溶液，其他测定条件相同，若增加液层厚度，则其吸光度A( ) A、增加 B、不变 C、减小 D、不确定 2.某有色溶液，其他测定条件相同，若增加液层厚度，则其透射比T（） A、增加 B、不变 C、减小 D、不确定 3.若某有色溶液透射比为0.333，则其吸光度为（） A、0.333 B、0.500 C、0.666 D、0.478 4.若某溶液ε=1.1×104L\（mol·cm），с=3.00×10－5mol/L,b=2.0cm，则A为（） A、0.10 B、0.32 C、1.30 D、0.66 三、判断题。 第十二章分光光度分析法 （一）判断题 1. 可见光的波长范围在400-760nm之间。（） 2. 吸光度A与透光度T成反比。（） 3. 朗伯-比尔定律只适用于单色光。（） 4. 同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有相同的ε值。（） 5. 可见光源用钨丝白炽灯，紫外光源用氘灯。（） 6. 若显色剂用量多，则显色反应完成程度高，故显色剂用量越多越好。（） 7. 一般来说，加入有机溶剂，可以提高显色反应的灵敏度。（） 8. 浓度相对误差仅与仪器读数误差相关。（） 9. 浓度较高时测量相对误差大，浓度较低时，测量相对误差小。（） 10. 符合朗伯-比尔定律的某有色溶液稀释时，其最大吸收波长λmax向长波方向移动。（） 11. 有色溶液的吸光度随溶液浓度增大而增大，所以吸光度与浓度成正比。（） 12. 在光度分析中，溶液浓度越大，吸光度越大，测量结果越准确。（）（二）填空题 1. 朗伯-比尔定律数学表达式：A=kbc，式中A代表，b代表，c代表，k代表。当c的单位用mol·L-1表示时，k以符号表示，称为。 2. 下列物质水溶液选择吸收光的颜色为：CuSO4；K2Cr2O7； KMnO4。 3. 光度计的种类和型号繁多，但都主要由、、、、五大部件组成。 4. 分光光度计的表头上，均匀的标尺是，不均匀的标尺是。 5. 为了降低测量误差，吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是，吸光度为时，测量误差最小。 6. 在以参比溶液调节仪器的零点时，因无法调至透光度为100%，而只好调节至95%处，此处测得一有色溶液的透光度读数为35.2%，该有色溶液的真正透光度为。 7. 二苯硫腙的CCl4溶液吸收580 ~ 620nm范围内的光，它显色。 8. 测量某有色配合物在一定波长下用2cm比色皿测定时其T =0.60，若在相同条件下改用1.0cm比色皿测定，吸光度A为，用3.0cm比色皿测定，T为。 9. 苯酚在水溶液中摩尔吸光系数为6.17?103 L·cm—1·mol—1，若要求使用1.0cm比色皿，透光度在0.15 ~ 0.65之间，则苯酚的浓度应控制在。 10. 吸光光度分析的方法有、、等。 （三）选择题 1. 在吸光光度法中，透射光强度与入射光强度之比称为（） A．吸光度 B. 透光度 C. 消光度 D. 光密度 2. 有色溶液的摩尔吸光系数ε与下列哪种因素有关（） A．入射光波长 B.液层厚度 C.有色物质浓度 D.有色物质稳定性 3. 透光度与吸光度的关系是（） A. 1/T = A B. lg1/T = A C. lg T = A D. T = lg1/A 4. 若测得某溶液在λmax时A>0.8，可以采取下列哪些措施？（） A.增大光源亮度 B.改变入射光波长 C.稀释溶液 D.换用小的比色皿。 5. 邻菲罗林测Fe，合适的参比溶液（） A．样品空白 B.试剂空白 C.蒸馏水空白 6. 分光光度法测定钴盐中微量Mn，加入无色氧化剂将Mn2+氧化为MnO4-，测定中应选（） 第八章检测练习 一、填空题（每题1分，共32分） 1、单色光是的光。 复合光是的光， 2、与组成白光，故称为互补色光 3、物质的颜色：是由于物质而产生的。 4、若溶液对白光中的各种颜色的光都不吸收呈。 5、吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以为横坐标， 为纵坐标作图。 6、同一种物质对不同波长光的吸光度。吸光度最大处对应的波长称为。 7、吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质的依据之一。 8、光吸收定律又称，它表明当垂直通过，溶液的吸光度A与及成。其数学表达式为。 9、吸光系数K与、及有关，与无关。 10、显色反应主要有和，其中绝大多数是。 11、显色剂分为和两大类 12、目视比色法的优点是、、、、及。 二、选择题（每题2分，共18分） 1、已知光的波长为350nm，则它属于（）。 A、紫外光 B、红外光 C、蓝光 D、红光 2、硫酸铜溶液（蓝色）的吸收光颜色为（）。 A、黄色 B、红色 C、紫色 D、黄绿色 3、某有色溶液透射比为0.1，则其吸光度为（）。 A、0.01 B、1 C、0.1 D、10 4、721型分光光度计是在（）区域内使用的仪器。 A、紫外光 B、红外光 C、可见光 D、近红外光 5、721型分光光度计的比色皿的材料是（）。 A、石英 B、光学玻璃 C、彩色玻璃 D、硬质塑料 6、目视比色法的缺点（）。 A、灵敏度低 B、仪器简单 C、操作复杂 D、准确度不高 7、关于溶液的吸收曲线，下列说法正确的是（）。 A、吸收曲线与物质的性质无关 B、浓度越大，吸光系数越大 C、吸收曲线是一条通过原点的直线 D、吸收曲线的基本形状与溶液性质有关 8、摩尔吸光系数ε与质量吸光系数a的换算关系（）。 A、εa=1 B、ε=aA C、ε=aM D、ε=a/M 9、某吸光物质的吸光系数很大，则表明（）。 A、该物质分子量很大 B、测定该物质灵敏度高 C、该物质浓度大 D、入射光的波长很大 三、简答题（共30分） 1、什么是目视比色法？ 2、比色法及分光光度法同化学分析法比较具有哪些特点？ 第十二章 吸光光度分析法 一、本章要点 1．掌握吸收曲线的绘制方法、吸收光谱、最大吸收波长的概念。 2. 掌握朗伯-比尔定律、吸光度、摩尔吸光系数、透光率的基本概念及相互之间的关系。 3.熟悉偏离朗伯-比尔定律的原因。 4. 掌握显色反应及其条件的选择、吸光光度分析方法及熟悉常用仪器的基本原理、主要部件 及具体操作。 二、示例解析 1. 已知含Cd 2+浓度为140μg ·L -1 的溶液，用双硫腙显色后，用厚度为2cm 的比色皿测得 A =0.22，计算此溶液的摩尔吸光系数。 解： 查表知Cd 的摩尔质量为112.41g ·mol —1 c (C d 2+)=140×10-6/112.41=1.25×10—6（mol ·L —1） 46108810 2512220?=??==ε-...bc A （L ·mol -1·cm —1） 需要指出的是，上例中的ε 值是把被测组分看成是完全转变成有色化合物的。但在实际测 定中，因有色物质组成不确定或有副反应存在，实际计算出的是表观摩尔吸光系数。 2. 已知吸光度A = 0.474，计算T 及T % 解： A = -lg T = 2 - lg T % lg T = -A = -0.474 ， T = 0.336； lg T % = 2-A = 2-0.474 =1.53， T % = 33.6 3. 准确移取含磷30μg 的标准溶液于25mL 容量瓶中，加入5%钼酸铵及其它相关试剂， 稀释至刻度。在690nm 处测定吸光度为0.410。称10.0g 含磷试样，在与标准溶液相同的条件 下测得吸光度为0.320。计算试样中磷的质量分数。 解： ω（P ）=100?m A V c A S X S X =3100.1025410.02530320.0????? =0.23 4. 某一分光光度计的透光率读数误差为0.005，当测量的百分透光率为9.5%时，测得的 浓度相对误差为多少？ 解：?T = 0.005，T = 0.095，代入式（8-6）： 095 .0lg 095.0005.0434.0??=?c c = -0.022 = -2.2% 5. 测定某样品中Fe 的含量，称样0.2g 测得T =1.0%，若仪器透光率读数误差为0.50% 试计算： ⑴ 测量结果的相对误差为多少？ ⑵ 欲使测得的A 值为0.434，以提高测量的准确度，则应减少称样量或稀释样品多少倍？ ⑶ 若不进行上面的操作，为提高测量准确度应选用几厘米的比色皿？ 解： ⑴ ?T =0.50%，T = 1.0%，代入（8-6）式 01 .0lg 01.0005.0434.0??=?C C = 0.1085 = 10.85% ⑵ 原试液T =1.0%，A = 2.00，要使A = 0.434，降低相对误差，则需稀释样品。因为 减少称样量会增大称量误差。所以稀释倍数=C 原/C =2.00/0.434 =4.6，即稀释4.6倍。 ⑶若不稀释样品，为了提高准确度，则要降低吸光度，因为C 较大，所以应选择厚度小 的比色皿，即选用0.5cm 比色皿。 6. 如何选择适宜的参比溶液？ 第八章比色法及分光光度法 第一节 一、填空题。 1.比色法及分光光度法同化学分析法比较具有___________、_____________、_____________、_______________等四个特点。 2.光的波长范围在___________称为可见光，波长小于__________称为紫外光，波长大于___________称为红外光。 3.____________通过三棱镜就可分解为____________________，这种现象称为光的色散。 4.光吸收程度最大外的波长叫做_____________，用_________表示。 5.同物质不同浓度的溶液λmax不变，具有____________的吸收曲线，不同物质具有__________的吸收曲线，可以此进行物质的___________。 6.物质呈现一定的颜色是由于___________。 7.同一物质不同浓度在一定波长处吸光度随浓度增加而________,这个特性可作为_________的依据。 二、选择题。 1.已知光的波长λ=800nm，则它应属于（） A、红光 B、紫光 C、红外光 D、紫外光 2.Fe（SCN）3溶液（红色）的吸收光颜色为（） A、红色 B、黄色 C、蓝色 D、蓝绿色 3.绿光的互补色为（） A、紫红色 B、橙色 C、绿蓝 D、蓝绿色 4.二苯硫腙的CCl4溶液吸收580~600nm范围的光，它显（）色。 A、绿色 B、蓝色 C、紫色 D、黄色 三、判断题。 1.白光是一种可见光。（） 2.同一物质不同浓度的有色溶液λmax不变。（） 3.在λmax处测定吸光度则灵敏度最高。（） 4.比色法及分光光度法同化学分析比较，准确度高，灵敏度低。（） 5.硫酸铜溶液因吸收了白光中的红色而呈现蓝色。（） 第二节光吸收定律 一、填空题。 1.光吸收定律又称_______，它表明当_______________垂直通过______________，溶液的吸光度A与______________及____________成______。其数学表达式为_______________。 2.偏离朗伯—比耳定律的因素有________、_________、_________、_______等四方面。 二、选择题。 1.某有色溶液，其他测定条件相同，若增加液层厚度，则其吸光度A( ) A、增加 B、不变 C、减小 D、不确定 2.某有色溶液，其他测定条件相同，若增加液层厚度，则其透射比T（） A、增加 B、不变 C、减小 D、不确定 3.若某有色溶液透射比为0.333，则其吸光度为（） A、0.333 B、0.500 C、0.666 D、0.478 4.若某溶液ε=1.1×104L\（mol·cm），с=3.00×10－5mol/L,b=2.0cm，则A为（） A、0.10 B、0.32 C、1.30 D、0.66 三、判断题。 实验教学典型案例 实验名称：邻二氮菲分光光度法测铁 主讲教师：王芬 一、实验目的 1、掌握用邻二氮菲分光光度法测铁的原理和方法。 2、掌握分光光度计的使用方法。 二、实验原理 在 pH=3～9 的溶液中， Fe 2+ 与邻二氮菲反应生成一种稳定的橙红色络合物。 显色前需要用盐酸羟胺将Fe 3+ 全部还原为 Fe 2+ ，然后加入邻二氮菲，并调节溶液 酸度至适宜的显色酸度范围。有关反应如下： Fe N N 3 2+ N N 3 Fe 2+ + 该络合物的最大吸收波长为 508 nm ，可在此波长下测量吸光度,由朗伯-比 耳定律计算铁含量。用分光光度法测定物质的含量，一般采用标准曲线法，即配 制一系列浓度的标准溶液，测定相应吸光度，绘制 A-C 标准曲线。然后测定待 测溶液的吸光度，根据测得吸光度值从标准曲线上查出相应的浓度，即可计算试 样中被测物质的质量浓度。 三、试剂和仪器 1、仪器 V-1100型分光光度计、容量瓶、吸量管 2、试剂 （1）0.1mgl -1 铁标准储备液 准确称取0.7020g NH 4Fe(SO 4)26H 2O 置于烧杯 中，加少量水和20mL 1:1 H 2SO 4 溶液，溶解后，定量转移到1L 容量瓶中，用水 稀释至刻度，摇匀。 （2）10 -3 molL -1 铁标准溶液。 （3）100 mgL -1 盐酸羟胺水溶液 。 2Fe 3+ +2NH 2 OH HCl=2Fe 2+ +N 2 +2H 2 O +2H + +2Cl - （4）15 mgL -1 邻二氮菲水溶液。 （5）10 mgL -1 乙酸钠溶液。 （6）铁未知液。 四、实验步骤 1、显色标准溶液的配制 在序号为1——6的 6只50mL 容量瓶中，用吸量管分 别人加入 0，0.20，0.40，0.60，0.80 铁准准溶液，分别加入 1mL100gL -1 盐酸羟 胺溶液， 摇匀后放置2min ， 再各加入2mL 1.5g?L -1 邻二氮菲溶液、 5 mL1.0 mol?L -1 乙酸钠溶液，以水稀释至刻度，摇匀。 2、标准曲线的测绘 以步骤1中试剂空白溶液（1号）为参比，用1cm 吸收池， 在选定波长下测定 2—6 号各显色标准溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁的浓度 为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 3、铁含量的测定 试样溶液按步骤 1 显色后，在相同条件下测量吸光度，由标 准曲线计算试样中微量铁的质量浓度。 五、数据处理 以吸光度为纵坐标, 铁含量为横坐标, 绘制工作曲线。 由工作曲线确定待测溶 液的含量。 六、思考题 1、 根据实验数据，计算在最大吸收波长下，邻二氮菲-Fe（Ⅱ）的摩尔吸收系 数ε。 2、 本次实验中用V-1100型分光光度计基本部件有哪些基本部件。 C x A C A A x x 荧光分光光度法在药物分析中的应用 【摘要】荧光分光光度法属于药物分析法中光化学分析法其中的可见分光光度法，它是利用物质所产生的荧光特性来定性或者定量分析物质样品的分析方法，其具有选择高、灵敏度高、检测限低以及信息量丰富等优点。由于许多有机药物（如芳香化合物等）都具有特征性的荧光吸收光谱，因此荧光分光光度法在药物分析中得到了极广泛的应用。 【关键词】荧光分光光度法荧光分光光度计药物分析定量分析 一、荧光分光光度法的原理及荧光分光光度计简介 荧光是指物质分子接受紫外-可见光光子的能量被激发之后，从激发态返回基态时所发 射出来的光，任何荧光物质分子均具有两个特征光谱，分别是激发光谱和发射光谱，根据斯托克斯位移可知，荧光发射波长永远大于激发光波长。荧光强弱用荧光效率来表示，即发射荧光的光子数与基态吸收激发光的光子数之比。 由上述可知，物质能发射荧光所必须具备的条件是：1、有较强的紫外-可见吸收；2、 有一定的荧光效率。所以，物质能否发射荧光以及荧光强度与以下几个方面有关：1、有π-π跃迁的长共轭结构（较强的紫外-可见吸收）；2、具有刚性平面结构（具有较高的荧光效率）；3、具有给电子取代基（助色团，增加紫外吸收，提高荧光效率）。而大多数的化学合成药物均具有以上结构，因此具有发射荧光特性，所以可以利用荧光分析法进行药物分析。 目前广泛使用的荧光分光光度计是由激发光源（常采用氙灯，发射谱线强度较大且连续），激发单色器（置于样品池前，与光源成90°），发射单色器（置于样品池后），样品池和检 测系统组成，使用前需进行包括灵敏度、波长、激发光谱和发射光谱的校正。 二、利用荧光分光光度法进行药物分析实例 1.应用定量分析法测定样品含量 1.1工作曲线法 以系列中某一对照品溶液为基准以荧光强度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，将空白溶液荧光强度读数调为0，将对照品溶液荧 光强度读数调至100%或50%，之后测定待测样品的荧光强度。在测定中药巴戟 天中蒽醌含量时，以，1, 8-二羟基蒽醌为对照品（丙酮做溶剂，在最大激发波 长425nm，最大发射波长513nm处测定）[1]。 1.2比例法 当标准工作曲线通过原点时，可以任选两个浓度用比例法测定，例如《中国药典》中对利血平含量的测定就采用了比例法进行荧光定量分析 1.3联立方程式 用于分析多组分的混合物。 2.应用其他荧光分析技术提高灵敏度和选择性 2.1激光诱导荧光分析 采用单色性极好、强度更大的激光作为光源，灵敏度提高，可进行单分子检测。 2.2同步荧光分析 同步荧光光谱法中恒定波长法使用较为广泛，指的是在扫描过程中保持发射波长和激发波长固定间距的分析方法，具有灵敏度高、干扰少等优点，用来 测定多环芳烃[2]并可以同时对氨基酸以及蛋白质等进行测定。 目视比色法和分光光度法的分析和比较 2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳 临床医学院 指导教师：徐尧 一、摘要 本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优 缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有 不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。由此针对不同情况给出了不同的选择方案。这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。 二、前言 在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定 量分析的方法被应用到研究和生产中。常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。 三、内容 （一）两种比色方法优缺点比较 1.目视比色法 1）优点 （1）比色时操作简便，成本较低 相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。 在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。 （2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况 目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在 2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍 过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。 本实验中，目视比色法实际上测量的是通过Fe(SCN)3溶液的光的强度，而 在分光光度法中实际测定的是某一单色光（如蓝色）被吸收的情况。 1）缺点 （1）精确度较差 目视比色法主要依靠人的眼睛来观察颜色深度，不可避免地会受到观测者主观因素的影响，因此其准确性自然会受到显著影响。一般来说，目视比色法的相对误差为5%-10%。 紫外可见分光光度计参数解读——————————————光学系统———————————————— 一)检测器部分光学系统: 通常就是指光学系统的结构形式,目前,国际国内光度计行业常采用的机构为自准式与CT式两种结构,通常有单光束与双光束两种; 二)光源系统: 1、仪器波长范围指光度计所能进行测试的波长最大值与最小值之差; 2、仪器波长准确度仪器显示波长与真实波长的接近程度,即仪器设定波长与实际波长的差值。每台光度计都要在很多个波长点检查波长准确度; 3、仪器波长重复性波长重复性就是仪器返回原波长的能力。它体现了波长驱动机械与整个仪器的稳定性; 4、仪器光谱带宽(灵敏度,分辨力)指一个尖峰光谱带通过单色器出狭缝时,在检测器上所检测到的能量半宽度,用波长单位nm表示,从另一个角度理解这一概念会更通俗易懂:首先,单色器出狭缝不仅仅代表着狭缝的物理尺寸或几何尺寸,她还代表着光学意义,这就就是光谱带宽,我们知道,来自单色器的光线不全就是单一波长的光,而就是一个狭窄的按波长大小顺序排列的光谱带,这一光谱带包含波长的多少,用光谱带宽来表示。光谱带宽直接反应的就是从单色器出来的光的单色性的好坏程度。该指标与仪器的分辨力与灵敏度很相似,但又有所不同,她们从不同的侧面反应光度计性能的好坏。分辨力就是指仪器分辨两相邻波长大小的能力,假如,在相邻两波长处给仪器的输入端两个脉冲输入,在仪器的检测器上检测到的模拟信号,若信号的最小值低于最大值的80%,根据罗雷(Rayleigh)判据,就认为这两个波长就是可分辨的。实际测量时通常就是用苯蒸气来测量(258、9nm与259、3nm间峰谷)。 灵敏度就是指在做低浓度测量时,当浓度改变一个单位时在检测器上所引起信号的变化量,它受校正曲线(标准曲线浓度为横轴,吸光度为纵轴)与仪器本身精密度的限制。两种测量方法精密度相同时,校正曲线斜率越大越灵敏,而斜率相等时,精密度越高灵敏度越好。需要指出的就是,为了得到准确的测试结果,仪器的光谱带宽(Spectral Bandwith简称SBW)与分析样品的自然带宽(Natural Bandwidth 简称NBW)之比应小于0、1 , 这样可以得到99、5% 以上的测量准确度。 5、仪器杂散光杂散光就是非选择波长的光照射到检测器上产生的信号。它就是光度计分析误差的一个重要来源,杂散光大会限制高浓度溶液分析的准确性。杂散光用T%表示; 6、仪器光度范围指光度计在满足各项技术指标下的测试范围,用A或T表示; 仪器光学系统相关参数: 1光学系统: 双光束测量 2、波长范围: 150～1800nm 3、波长准确度:±0、5nm 4、波长重复性:≤0、1nm 5、光谱带宽:1nm 6、杂散光: ≤0、05%T 7、仪器光度准确度:±0、002A 8、仪器光度重复性:≤0、001A) 9、光度噪声: ±0、0005Abs/h(500nm,P-P) 问题: 1) 紫外的光学系统有哪些？各自的特点就是什么？各自的优势？ 2) 紫外最大波长与最小波长分别就是多少？波长范围越大越好还就是越小越好？第20章 比色法和分光光度法
紫外-可见分光光度法习题(答案与解析)
紫外可见分光光度法
第八章 分光光度法
纳氏试剂比色法
荧光分光光度分析法
双波长分光光度法的基本原理及应用
比色法及分光光度法
第十二章 分光光度分析法
第八章比色法及分光光度法测试
第十二章 吸光光度分析法
第八章 比色法及分光光度法
实验教学典型案例 实验名称：邻二氮菲分光光度法测铁 主讲教师：王
荧光分光光度法在药物分析中的应用
目视比色法和分光光度法的分析和比较
紫外可见分光光度计参数分析方法