荧光定量PCR的原理、方法及结果分析

而实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，最后通过对未知模板进行定量分析的方法。

目前，实时荧光定量PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去十几年中，该方法迅速流行，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究。

实时荧光定量PCR的应用

目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括：

● 基因扩增

● 扩增特异性分析

● 基因定量分析

● 基因检测

● 基因分型

● SNP分析

● RFLP多态性分析

● 单/多基因表达研究

● 高通量基因表达谱研究

……

实时荧光定量PCR的常用方法

染料法

荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA 中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。

常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。

Promega采用新型荧光染料BRYT Green? Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强.

探针法

在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的

5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

荧光定量PCR结果分析

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化;在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加，PCR终产物量与起始模板量之间没有线性关系，无法计算起始模板拷贝数。因此只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，故选择在这个阶段进行定量分析。为了定量方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了几个重要的概念：扩增曲线、荧光阈值、CT值。

(1)扩增曲线

注：

横坐标：代表扩增循环数;

纵坐标：代表荧光强度，每个循环进行一次荧光信号收集。

(2)荧光阈值(Threshold)

在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光阈值的设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。(如下图)

(3)CT值

每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。同时，对于荧光PCR实验来说，CT值也是判读样品阴阳性的重要指标。(如下图)

实验室应用

PCR检测方法在临床医学及实验室检验中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR方法就可以检测到。该方法对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，常用于疾病的早期诊断，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

大量的荧光定量PCR研究资料表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。因此，通过荧光定量PCR方法得到的检测结果，一定程度上可以准确反映疾病感染的情况。

除此之外，也可以见于肿瘤分子机制、遗传病筛查、样本成分鉴定等多方面的实际应用中。

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA内插染料某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验陈云地作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更

为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，

q-pcr结果分析报告

摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Appl ied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。 1. 2－△△CT方法

实时荧光定量PCR全方位解析

实时荧光定量PCR全方位解析实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：

（3）Ct值： CT值的重现性：

5、定量原理：理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同（二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析而实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，最后通过对未知模板进行定量分析的方法。目前，实时荧光定量PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去十几年中，该方法迅速流行，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究。实时荧光定量PCR的应用目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括： ● 基因扩增 ● 扩增特异性分析 ● 基因定量分析 ● 基因检测 ● 基因分型 ● SNP分析

● RFLP多态性分析 ● 单/多基因表达研究 ● 高通量基因表达谱研究 …… 实时荧光定量PCR的常用方法染料法荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA 中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。 Promega采用新型荧光染料BRYT Green? Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强. 探针法在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的

荧光定量PCR数据分析

利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量 METHODS 25, 402–408 (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT Method Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1 *Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534 摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 P CR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT 公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulleti n No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有

荧光定量PCR_完整版

08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
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荧光定量PCR详细流程和问题解析

荧光定量PCR详细流程和问题解析普通PCR与荧光定量PCR技术区别？简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR 技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，

荧光定量PCR流程和操作原理(收集整理)

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1为什么终点定量不准确？我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。