免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述……………………………………………………

二、免疫荧光组织化学的原理…………………………………………………………………

（一）直接方法……………………………………………………………………………

1．检查抗原方法……………………………………………………………………

2．检查抗体方法……………………………………………………………………

（二）间接方法……………………………………………………………………………

1．检查抗体(夹心法)方法……………………………………………………………

2．检查抗体方法……………………………………………………………………

3．检查抗原法………………………………………………………………………

（三）补体法………………………………………………………………………………

1．直接检查组织内免疫复合物方法………………………………………………

2．间接检查组织内抗原方法………………………………………………………

（四）双重免疫荧光组织化学标记方法…………………………………………………

（五）对照试验……………………………………………………………………………

1．直接方法…………………………………………………………………………

2．间接方法…………………………………………………………………………

3．补体方法…………………………………………………………………………

三、荧光抗体的制备………………………………………………………………………………

（一）荧光素………………………………………………………………………………

1．异硫氰酸荧光素…………………………………………………………………

2．四甲基异硫氰酸罗达明…………………………………………………………

3．得克萨斯红(Texas red)……………………………………………………………

4．其它荧光素…………………………………………………………………………

（二）荧光素标记抗体的方法……………………………………………………………

1．FITC标记抗体的方法……………………………………………………………

2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法……………………………………………

3．藻红蛋白标记抗体方法……………………………………………………………

4．蓝色荧光素标记抗体方法…………………………………………………………

（三）荧光抗体的质量控制………………………………………………………………

1．染色特异性和敏感性的测定方法…………………………………………………

2．F/P比值的测定方法………………………………………………………………

3．荧光抗体的保存……………………………………………………………………

四、免疫荧光组织化学染色方法………………………………………………………………

（一）荧光抗体染色方法…………………………………………………………………

1．直接方法……………………………………………………………………………

2．间接方法(双层法) ………………………………………………………………

3．间接方法(夹心法) ………………………………………………………………

4．补体方法……………………………………………………………………………

5．膜抗原荧光抗体染色方法………………………………………………………

6．双重染色方法………………………………………………………………………

7．荧光抗体再染色方法………………………………………………………………

（二）荧光抗原染色方法…………………………………………………………………

五、荧光显微镜检查方法………………………………………………………………………

（一）荧光和荧光显微镜…………………………………………………………………

（二）荧光显微镜标本制作要求…………………………………………………………

1．载玻片……………………………………………………………………………

2．盖玻片……………………………………………………………………………

3．标本…………………………………………………………………………………

4．封裱剂………………………………………………………………………………

5．镜油…………………………………………………………………………………

（三）使用荧光显微镜注意事项…………………………………………………………

（四）荧光图像的记录方法………………………………………………………………

六、非特异性染色的消除方法…………………………………………………………………

（一）非特异性染色的主要因素…………………………………………………………

（二）消除非特异性染色的方法…………………………………………………………

1．葡聚糖凝胶G-50柱层析法………………………………………………………

2．DEAE纤维素柱层析法……………………………………………………………

3．荧光抗体稀释法…………………………………………………………………

4．纯化抗原方法………………………………………………………………………

5．纯化抗体方法——免疫吸收方法………………………………………………

6．伊文氏蓝(Evans blue)衬染色方法………………………………………………

七、现状与展望…………………………………………………………………………………

免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述

免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。它与葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素(ConA等)相结合拓宽了领域；与激光技术、

电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter (FACS)的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。80年代到90年代相继又有新的荧光素出现如R-藻红朊，B-藻红朊，C-藻青蛋白，cy2, cy3, cy5, cy7均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中广泛应用。

由于免疫荧光组织化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。

二、免疫荧光组织化学的原理

免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量（图3-2-1）。

图3-2-1紫外光激发荧光物质放射荧光示意图

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法。用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法。

（一）直接方法

1．检查抗原方法

这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。（图3-2-2）

图3-2-2 直接法

2．检查抗体方法

将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。

（二）间接方法

1．检查抗体(夹心法)方法

此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。

2．检查抗体方法

用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，如果血清含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反

免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学

免疫组织化学傅琦博引言酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。免疫组织化学技术的发展免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。基本实验步骤：

免疫组化技术全程原理

免疫组化技术全程原理一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法

免疫细胞化学常用试剂介绍.

免疫细胞化学常用试剂介绍一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m 配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好

免疫组织化学技术在病理诊断中的应用题库2-0-8

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列标记可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤的是（） A.CK B.calretinin C.LCA D.CgA E.CD68 CK为上皮性标志物；calretinin为间皮细胞肿瘤标志；CgA为神经内分泌标志物；CD68为组织细胞标志物。LCA为淋巴细胞标志物，因此可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]AFP为下列哪种肿瘤的标记物？（） A.宫内膜癌 B.黑色素细胞瘤 C.肝细胞癌 D.乳腺癌 E.鼻咽癌 AFP为肝细胞癌和内胚窦瘤的标志物；HMB45和S-100为黑色素细胞的标志物；ER和PR为乳腺癌和子宫内膜癌的分化标志物。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于小圆细胞肿瘤的描述，下列错误的是（） A.是一类细胞形态为小圆形的细胞 B.常规诊断基本可以明确诊断 C.免疫组化诊断胚胎性横纹肌肉瘤首选Desmin D.原始间叶性肿瘤诊断困难，可采取排除法 E.免疫组化诊断尤因肉瘤首选CD99 小圆细胞恶性肿瘤是病理学从镜下形态的分类，不能说明肿瘤的组织来源，需要免疫组化进一步诊断。 (吉林快3 https://www.360docs.net/doc/59475306.html,)

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列免疫组化结果有助于诊断皮肤Merkel瘤的是（）。 A.Vimentin（+），CK（+），NSE（-） B.Vimentin（-），CK（-），NSE（+） C.Vimentin（-），CK（+），NSE（-） D.Vimentin（-），CK（+），NSE（+） E.Vimentin（+），CK（-），NSE（+）皮肤Merkel瘤可同时表达CK、NSE，而Vimentin常呈阴性反应。

免疫组织化学及其应用

免疫组织化学及其应用浙江大学病理学与法医学研究所周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。病理诊断发展过程的主要事件年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。

●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。常规苏木素伊红（HE）染色几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生：抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。主要的发展过程年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免疫组化法

免疫细胞化学与图像分析

免疫细胞化学与图像分析在细胞生物学中，一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量测量信息。在免疫细胞化学中也存在同样的问题。制作免疫细胞化学标本环节较多，只要有一个环节失误就会影响实验结果，除了需要精制的药品外，还需要熟练的技术。那么，做成了理想的标本后，如何进行观察，才能获得尽量多的的各种定量信息，而且使这些信息能较客观的反映出来，这就是本章的编写目的。一、定量分析的重要性目前有许多研究免疫细胞化学的文章，是做定性和定位研究的。如有文献中提到，P物质在脑组织中存在于30处以上，这只是解决了定性定位问题，这些部位含P物质的量是否相同？可否用快速简便的方法对细胞内免疫反应产物的量进行分析？从而可进行比较。所谓反应产物的“量”包括颜色深浅，其所占的长度或面积等，就要借助于图像分析仪（image analyzer）了。以往我们对免疫细胞化学或一般组织化学光镜标本的观察，对反应产物的量常用“+”号表示，一般可分为0～+++，共五个等级，这种方法对差别较大的标本当然还是可以用的，但存在以下三方面的问题：①同一张标本，不同的观察者可以得到出不同的结论，因为这种分级没有明确的客观标准；②即使同一张标本同一个观察者，间隔若干天后进行再次观察时，可能结论也不一样的；③最后一点也是最重要的一点，人的视觉是有一定限制的，用一般观察法实际上已经丢失掉了许多可贵的信息，因为你察觉不到实际上存在的较小的差异。因此我们力求有一个客观的比较精密的标准。除了常用的仪器如显微分光光度计(microspe ctrophotometer)和显微密度计（microdensitometer）等以外，还可用图像分析仪进行测量。前二者已有许多有关著作中介绍过，就其精确与灵敏来说都是够的，但却不能同时测出标本中某些成分的面积、体积或长度等其他极有用的参数。图像分析仪的分析广度则要大得多，并能明显地提高工作效率，所得到的各种数据可通过分析仪上的计算机进行统计学处理，只要将各种统计学公式输入计算机，选择其中你所采用的公式，即可快速得出分析结果，告诉你有无显著性差异。二、图像分析仪简介图像分析仪又称图像分析系统（image analysis system），主要用来解决如何客观地较精确地用数字来表达存在于标本中的各种信息，可称为数学形态学。它已经成为一种公认的科学研究工具，并且逐渐展现出巨大的潜能。图像中包含着极其丰富的内容，是人们从客观世界中获得信息的重要手段，因此，正确地测量和处理图像已成为测量技术中的重要课题，并广泛应用于航空遥感测量、金属图像测量、微电子技术

免疫组化与免疫荧光的区别

免疫组化与免疫荧光一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。二、区别是： 1、概念和基本原理免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作：免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。

免疫组织化学(荧光)方法及问题详解

目录： 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1) 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2) 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价 (4) 5.免疫组织化学对照实验 (5) 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除 (9) 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11) 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12) 15.双重免疫荧光标记法 (13) 16.免疫荧光组织化学直接法 (13) 17.免疫荧光组织化学间接法 (14)

1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料，如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。 (2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。 (4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。 (6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。

免疫组织化学技术(ABC法)

免疫组织化学技术（ABCxx）大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和 0.03%H 2O 2的 0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含 0.03%DAB 和 0.006%H 2O 2 的Tris 盐酸缓冲液（pH 7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P< 0.01。比例尺为100 am。E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P< 0.01。免疫荧光双标技术

脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。 HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和 B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。比例尺为20 am。细胞进行处理后,弃培养基,用 0.01MPBS漂洗3遍。加入4%多聚甲醛固定30min。PBS漂洗3遍。加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体 (1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次 10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories，室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次，每次10 min;含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察，EGFP用 488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。

全自动免疫组织化学染色快速诊断【免疫组织化学的现状和应用】

全自动免疫组织化学染色快速诊断【免疫组织化学的现状和应用】【】R361 【】A 【】1672－3783(xx)08－0497－02 【摘要】：本文对免疫组化的优点作了简要介绍，同时介绍了其在病理诊断中的应用，有支持、鉴别诊断的作用，检测激素受体与生长因子，对预后及治疗产生重要意义。文中还叙说了免疫组化的结果对肿瘤细胞增生和分期具有评价作用，并对免疫组化应该注意的事项也逐一列举。当免疫学的理论和技术进一步成熟发展后，就产生了免疫组织化学技术，将这一方法应用在病理诊断上就称为诊断免疫组织化学。在现代医学基础和临床研究中免疫组织化学对疾病尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。（一）免疫组化的优点（1）特异性强免疫组化是利用抗原、抗体可以特异性结合，也就是“一对一”的结合的原理。（2）敏感性高

现在免疫组化的ABC法、SP法的问世，抗体可以稀释成千上万倍甚至上亿倍，仍可发生抗原抗体的结合。（3）定位精确免疫组化的反应可在组织和细胞中进行，抗原实现了准确的定位观察，对于病理学的诊断和研究具有非常重要的意义。（二）免疫组织化学的应用（1）免疫组化对病理诊断具有支持和鉴别诊断的作用。在病理诊断比较明确的情况下，应用组化标记可以起到支持诊断的作用。有时无法判断肿瘤时，组化的应用将起到极大的帮助，可以鉴别肿瘤的和性质。（2）激素受体与生长因子的检测对预后及治疗具有十分重要的意义激素受体的检测对于乳腺癌的研究已有了较明确的结论，雌激素受体阳性的乳腺癌患者预后优于阴性表达者，同时阳性表达者对内分泌治疗效果好，患者生存期延长。

免疫组织化学技术111

免疫组织化学技术随着现代科学技术的迅速发展，病理诊断技术也在不断进步,其中免疫组织化学以其特异性强、灵敏度高等显著特点，克服了传统诊断方法的局限性和主观性，能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，此方法经不断改进和发展也日趋成熟，应用范围逐渐扩大。目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。一．免疫组化技术的原理和优点（一）免疫组化技术的基本原理应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。（二）免疫组织化学染色方法按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（S P）法等，其中SP法是最常使用的方法。（三）几种常用免疫组织化学方法的原理 1 免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以

免疫组织化学技术题库1-2-10

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括（）. A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，必须保证组织材料（）. A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括（）. A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括免疫细胞组织化学技术包括以上所有。 (NBA总冠军 https://www.360docs.net/doc/59475306.html,/)

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫标记电镜技术获得成功的关键是（）. A.对细胞超微结构完好保存 B.保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原性不受损失 C.选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合 D.以上叙述都正确 E.以上均不正确上述均为免疫标记电镜的成功关键。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]胶体金是氯金酸在何者的作用下聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态（）. A.还原剂 B.氧化剂 C.变构剂 D.化学物质 E.以上都不对氯金酸在还原剂如白磷、维生素C等的作用下还原为金颗粒。

免疫组织化学

免疫组织化学得基本知识 1免疫组织化学得概念: 免疫组化就是利用抗原与抗体特异性结合得原理,通过化学反应使标记抗体得显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量得研究,称为免疫组织化学、 2免疫组化实验所用得抗体有哪些？?免疫组化实验中常用得抗体为单克隆抗体与多克隆抗体、单克隆抗体就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备、多克隆抗体就是将纯化后得抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得得免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物、?3免疫组化实验所用得组织与细胞标本有哪些? 实验所用主要为组织标本与细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理大片与组织芯片)与冰冻切片,细胞标本包括组织印片、细胞爬片与细胞涂片、其中石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本得方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定得影响,但可进行抗原修复,就是免疫组化中首选得组织标本制作方法。?4石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法? 石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成得交联破坏,而恢复抗原得原有空间形态。?常用得抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用得修复液就是ｐH6、０得0、01 mol/L得柠檬酸盐缓冲液、 5免疫组化常用得染色方法有哪些？?根据标记物得不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲与组织化学法,后者就是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础得检测方法。这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平得定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。 6抗体交叉反应得原因: 指抗体除与其相应得抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应、产生得原因有以下几个方面:

免疫细胞化学 (abcam新版指南)ICC-IMMUNOCYTOCHEMISTRY

IMMUNOCYTOCHEMISTRY (ICC) General Procedure: i Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 hr at room temperature. ii Rinse coverslips well with sterile H2O (3 times 5 min each). iii Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 hrs. iv Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation. v Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS). Fixation: 1. Fix the samples either in ice-cold methanol, acetone (1-10 min) or in 3-4% paraformaldehyde in PBS pH 7.4 for 15 min at room temperature. 2. Wash the samples twice with ice cold PBS. Permeabilization: If the target protein is expressed intracellularly, it is very important to permeabilize the cells. Note: acetone fixed samples do not require permeabilization. 3. Incubate the samples for 10 min with PBS containing 0.25% Triton X-100 (or 100 μM digitonin or 0.5% saponin). Triton X-100 is the most popular detergent for improving the penetration of the antibody. However, it is not appropriate for the use of membrane-associated antigens since it destroys membranes. 4. Wash cells in PBS three times for 5 min. Blocking and Incubation: 5. Incubate cells with 1% BSA in PBST for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species that the secondary antibody was raised in). 6. Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C. 7. Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash. 8. Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 hr at room temperature in dark. 9. Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in dark. Counter staining: 10. Incubate cells on 0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA stain) for 1 min. 11. Rinse with PBS. Mounting: 12. Mount coverslip with a drop of mounting medium.