鸡肠道菌群总DNA三种提取方法的比较
【收稿日期】2009204221
【基金项目】福建省科技厅资助项目(2008F50205)
【作者简介】卢龙娣(19832),女,在读硕士研究生,从事肠道微生物学
研究,Email:linl ongdi @https://www.360docs.net/doc/5a1350757.html,;江胜滔,通讯作者,
Email:windt om 2jiang@https://www.360docs.net/doc/5a1350757.html,
文章编号:10052376X (2009)0720588203
【论 著】
鸡肠道菌群总DNA 三种提取方法的比较
卢龙娣1
,江胜滔2
,林跃鑫
2
(1.福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108;2.龙岩学院生命科学学院,福建龙岩 364000)
【摘要】 目的 比较不同方法提取鸡肠道菌群总DNA 的差异,为分子方法分析肠道菌群组成提供质量较高的DNA 模板。方法 采用反复冻融法、酶裂解法和试剂盒法(E .N.Z .A St ool DNA Kit )来提取鸡肠道菌群的总DNA,并根据DNA 浓度及纯度、16S DNA 扩增产物和ER I C 2PCR 产物所反映的片段多态性4个指标,对这3种方法提取的DNA 质量进行比较。结果 3种方法均能提取DNA,所得DNA 都可以用于16S DNA 的扩增,但后2种方法所得DNA 的ER I C 2PCR 结果能反映出更高的菌群多样性。结论 试剂盒法和酶裂解法所提取的DNA 质量好,适合用于肠道菌群的分子生态研究。
【关键词】 肠道菌群;总DNA 提取;16S DNA;ER I C 2PCR
【中图分类号】R446.4 【文献标识码】A
Com par ison of three m ethods for tot a l D NA extracti on from i n testi n a l m i croflora of the fowl
LU Long 2di 1
,J I A NG Sheng 2tao 2
,L I N Yue 2xin
2
(1.The College of L ife Sciences,Fujian N or m al U niversity,Fuzhou 350108,China;2.The College of L ife Sciences,L ongyan
U niversity,L ongyan 364000,China )
【Abstract 】 O bjecti ve To screen a method that could p r ovide a higher quality DNA te mp late for molecular analysis of compositi on of intestinal m icr ofl ora .M ethod Repeated freeze 2tha w method,lys ozy me method and E .N.Z .A St ool DNA Kit method were used t o extract t otal DNA fr om intestinal m icr ofl ora of the f owl .The quality of DNA extracted by the three methods was compared based on the concentrati on,purity,16S DNA PCR p r oducts and length poly mor phis m of ER I C 2PCR p r oducts .Result Total DNA extracted by any of the three methods could be used t o 16S DNA a mp lificati on .But the result of ER I C 2PCR of DNA extracted by the last t w o methods showed more m icr ofl ora diversities .Conclusi on The quality of t otal DNA extracted by E .N.Z .A St ool DNA Kit method and lys ozy me method were better than that of repeated freeze 2tha w method,s o can both be used t o study molecular ecol ogy of intestinal m icr ofl ora .
【Key words 】 I ntestinal m icr ofl ora;Total DNA extracti on;16S DNA;ER I C 2PCR
动物肠道内的微生物种类繁多,数量巨大,它们与动物的健康紧密相连,所以有必要分析动物肠道菌
群的组成。传统微生物培养研究的方法不仅费时、费力,更为重要的是肠道中绝大多数微生物是严格厌氧或兼性厌氧,体外培养困难,再加上大量不可培养微生物的存在,采用传统培养技术事实上已经很难对肠道微生物进行更加全面而深入的研究。近年来,随着分子生物学的发展,总DNA 提取的分子生态学方法已被广泛应用于肠道菌群的研究中,其中细菌16S DNA 的分子鉴定为检测肠道不可培养微生物开辟了新的道路,而基于肠杆菌基因间重复共有序列(ER I C )2PCR 技术构建的DNA 指纹图谱则为研究肠道菌群的多样性提供了新的方法。通过分子学方法来研究动物肠道菌群的关键是样品总DNA 的提取,目前用于肠道菌群基因组总DNA 提取的方法较多,提取的效率也各不相同。本文比较了常用的3种总
DNA 提取方法:反复冻融法、酶裂解法及试剂盒法,
试图筛选一个适合提取鸡肠道菌群总DNA 的方法,为后续分子方法分析动物肠道菌群组成提供质量较高的DNA 模板。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 鸡盲肠 选取市场上健康的成年河田鸡,颈静脉放血处死,打开腹腔取出盲肠,-20℃保存备用。1.1.2 主要试剂与仪器 溶菌酶、蛋白酶K (Sig ma 公司);Tap 酶(Tiangen 公司);dNTP 、DNA Mark (TaKaRa 公司);引物(上海生工生物工程有限公司);E .Z .N.A St ool DNA Kit (Omega 公司);PCR 仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机(B i o 2Rad 公司);UV 23200扫描型紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。1.2 实验方法1.2.1 样品预处理 取盲肠内容物2.0g,置于50m l 无菌离心管中,加入10m l 无菌P BS (pH 7.4)振荡使其悬浮混匀,600r/m in 离心6m in,取上清液于另一无菌50m l 离心管中,10000r/m in 离心10m in 收集菌体,用P BS 离心洗涤菌体直至上清液清澈为止。
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将最后所得的菌体悬浮于10m l P BS中,分别取1m l 装到10个1.5m l的无菌离心管中,10000r/m in离心收集菌体,用于后续总DNA的提取。
1.2.2 酶裂解法[1] 在预处理好的样品中加入200μl裂解液Ⅰ(50mmol/L Tris2base,50mmol/L
Na2EDT A,pH7.8)和50μl的溶菌酶(50mg/m l), 37℃温浴1h,每隔20m in轻轻倒置混匀。然后加入500μl的裂解液Ⅱ(200mmol/L NaCl,100mmol/L Tris2base,50mmol/L Na2E DT A,2.0%S DS,1.0% Trit on X2100)和12.5μl的蛋白酶K(20mg/m l), 37℃温浴12h,最后进行酚/氯仿抽提[2]。做3个平行实验,编号分别为1、2、3。
1.2.3 反复冻融法 在预处理好的样品中加入660μl TE缓冲液(pH7.2),充分振荡混匀,-20℃冰冻
1h,取出迅速于65℃温浴30m in,反复3次。然后加入75μl的S DS(10%)和12.5μl的蛋白酶K(20 mg/m l),37℃温浴2h,最后进行酚/氯仿抽提[2]。做3个平行实验,编号分别为4、5、6。
1.2.4 试剂盒法 将预处理好的样品悬浮于200μl 无菌重蒸水中,然后按E.Z.N.A St ool DNA Kit中病原菌诊断的方案提取DNA。做3个平行实验,编号分别为7、8、9。
1.2.5 肠道菌群总DNA质量检测 取30μl DNA 样品稀释100倍,用分光光度计检测总DNA的A
260
、
A280和A260/A280值;同时各取7μl3种方法抽提获得的总DNA,用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳,EB染色,凝胶成像仪观察分析。
1.2.6 16S DNA全长PCR扩增 采用细菌16S DNA 的通用引物16S21(5′2AG AGTTTG AT C ATGG CT CAG2 3′)、16S22(5′2GGTT ACCTTGTT ACG ACTT23′)[3]对3种方法提取的DNA进行16S DNA全长扩增。PCR反应
体系(50μl):10×PCR Buffer(含Mg2+)5μl,MgCl
2 (25mmol/L)5μl,d NTPs(2.5mmol/L)1μl,上下游引物(10μmol/μl)各1μl,模板DNA2.5ng/μl,Taq (2.5U/μl)0.5μl,无菌重蒸水补至50μl。PCR扩增程序:94℃预变性5m in;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1m in,30个循环;72℃延伸10m in, 4℃结束反应。
1.2.7 ER I C2PCR扩增 扩增引物[4]:ER I C1(5′2 ATGT AAGCTCCTGGGG ATTCAC23′),ER I C2(5′2 AAGT AAGTG ACTGGGGTG AGC23′),PCR反应体系同1.2.6。PCR扩增程序:94℃预变性5m in;94℃变性40s,57℃退火40s,72℃延伸2m in,30个循环; 72℃延伸10m in,4℃结束反应。
1.2.8 PCR反应产物检测 取6μl PCR产物与上样缓冲液混匀,用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,EB染色,凝胶成像仪观察分析。2 结果
2.1 总DNA的纯度和浓度检测 3种方法得到的9份样品DNA提取物经琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1。由图1可知3种方法均能提出DNA,各方法得到的DNA片段都完整,不存在降解现象,且无蛋白质污染,但1、2、3号即反复冻融法所提DNA的条带亮度都比较低,清晰度差;而4、5、6及7、8、9号即酶法和试剂盒法提取样品总DNA的条带都很清晰,亮度高,表明这2种方法提取的DNA效果较反复冻融法好
。
M为DNA分子标记DL2000;1～3为反复冻融法;
4～6为酶法;7～9为试剂盒法
图1 肠道菌群总DNA电泳图
用分光光度计检测,结果见表1。由表1的结果可以看出,3种方法所提取的鸡肠道菌群总DNA中反复冻融法的浓度最低,而酶裂解法和试剂盒法的浓度较高,但3种方法提取的总DNA的A
260
/A280的值均介于1.6～1.9,且同组的实验结果差异不大,说明这3种方法提取DNA的污染小,重复性较好,这与电泳结果一致。
表1 不同方法提取的DNA浓度和纯度的比较
比较项目
提取方法
反复冻融法酶法试剂盒法
A260 0.474±0.0380.822±0.0330.818±0.023
A280 0.259±0.0240.489±0.0270.476±0.018
A260/A2801.839±0.0691.680±0.0441.720±0.026 2.2 16S DNA全长扩增 选取1、4、7号获得的肠道菌群总DNA进行16S DNA全长PCR扩增,其扩增结果见图2所示。结果显示,3种方法提取的总DNA 均获得了1500bp左右的PCR产物,扩增结果与预期长度相符,说明3种方法提取的总DNA均能用于细菌的16S DNA扩增。
2.3 ER I C2PCR分析 ER I C序列(enter obacterial re2 petitive intergenic consensus sequences)即肠杆菌基因间重复共有序列,长约126bp,其在基因组间的位置和拷贝数具有种属特异性[5]。在ER I C序列的中心有一段高度保守的反向重复序列,该序列长约44bp。ER I C2PCR就是以这一核心序列为基础来设计引物,
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中国微生态学杂志 2009年7月第21卷第7期
M 为DNA 分子标记DL2000;1为反复冻融法;4为酶法;7为试剂盒法
图2 肠道菌群总DNA 的16S DNA 扩增电泳图谱
用于扩增两段ER I C 之间的片段。由于ER I C 序列在不同菌属基因组上的重复数和分布不同,因而可以得到一个由不同大小的DNA 片段组成的DNA 指纹图谱,该图谱反应了菌群的组成,可以用于混合菌群的
多样性分析[4]
。因此本实验以此为指标对所得的DNA 样品质量进行评判。
将3种方法得到的鸡肠道菌群总DNA 进行ER I C 2PCR 分析,其扩增产物的电泳图见图3所示。由图3可以看出3种方法获得的总DNA 均被成功的扩增,每种方法均能够获得复杂而又清晰的条带,体现了鸡肠道菌群的多样性。对于同种方法提取的3个重复实验里,样品的条带数和亮度大体一致,反
应了这3种方法提取的DNA 的稳定性和重现性都较好。对于不同方法的DNA 指纹图谱则有较大的差异,其中反复冻融法检测出的条带最少,酶裂解法和试剂盒法所获得的条带数比较类似,但是试剂盒法里出现了A 、B 2条亮度较高的条带,而酶裂解法里出现了2条750bp 左右的特有条带,这2条带在试剂盒法和反复冻融法中都没有检测到
。
M 为DNA 分子标记DL2000;1～3为反复冻融法;4～6为酶法;7～9为试剂盒法
图3 不同方法提取的肠道菌群ER I C 2PCR 电泳图
3 讨论
综上,本文研究的3种方法均能够得到质量较高
的总DNA ,但是反复冻融法所提得的DNA 浓度明显的低于其他2种方法。在对总DNA 进行16S DNA 全长PCR 扩增分析时,3种方法提取的总DNA 均能够成功扩增出特异的目标产物,但是在进一步的ER I C 2PCR 分析中发现反复冻融法所提取的总DNA 指纹图谱的多样性明显少于其他2种方法,这说明在肠道中存在一些菌群的DNA 无法用反复冻融法来提
取,同时也表明能够扩增出16S DNA 全长序列的样品总DNA 不一定能够反应样品菌群的多样性,不能仅仅以此作为评判肠道菌群总DNA 质量的唯一指标。ER I C 2PCR 分析显示由反复冻融法提取的DNA 指纹图谱与其他2种方法相比条带数较少,而酶裂解法和试剂盒法的DNA 指纹图谱差异也较大,试剂盒法中出现了A 、B 2条亮度较高的条带,它们可能代表了肠道菌群里的优势菌种;而酶裂解法中在750bp 附近出现了2条特有条带,这2条带在试剂盒法和反复冻融法中都没有检测到,它们可能代表了2种较难破壁的细菌。
Z OETE NDAL 等
[6]
在提取粪便总DNA 时,发现
对于同一样品用不同的DNA 提取方法,得到的菌群
DGGE 遗传图谱有较大的差异;蓝希钳等[7]
在用2种方法提取家蚕肠道微生物总DNA 中也发现,不同方法提取的总DNA 反应出的盲肠菌群的组成不一样。
本实验的结果与之类似,这可能是因为动物肠道菌群的组成非常复杂,不同的细菌细胞壁的组成成分和结构不一样,对不同提取方法的敏感度也不一样,所以
不同的提取方法所获得的总DNA 也有差异[6]
。因此,在对鸡肠道菌群的分子生态学的研究中,不同的DNA 提取方法会影响肠道菌群多样性的分子分析,
甚至会造成偏差。在本文研究的3种方法中,试剂盒法和酶裂解法比反复冻融法所提取的DNA 质量更高,且能够观察到更高的多样性,所以更适合肠道菌群的多样性研究。
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肠道菌群研究的主要方法
肠道菌群研究的主要方法 长期以来，为了研究肠道菌群的成员及其功能，科学家们建立和发展了众多技术 手段。经典的微生物学研究方法主要通过对细菌进行纯培养，然后在不同的培养条件下对细菌的生理活性进行研究。而随着分子生物学技术的飞速发展，在对环境中的复 杂微生物群落进行研究时，科学家们越来越多地运用不依赖于培养的方法，全面分析 各种微生物在环境中的活动和对环境的影响。 基于分离培养的方法 在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择性液体或固体培养基，对 粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析。根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的条件下进行，严格 的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离和生长非常重要。但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先，体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件，因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研究中，研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法，对感兴趣的细菌种类进行研究。 二．分子生态学研究方法 分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或RNA）为研究 对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究者们最常使用核糖体小亚基 RNA 基因（细菌中的16S r RNA 基因）的全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基 因序列的多样性代表物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌16S r RNA 基因具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点，同时序列还具有信息 量巨大且更新迅速的公开数据库，如Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方便地将自己研究中的16S r RNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌的分类地位。类似的，为了对肠道菌群中具有特定功能的类群进行检测，研究者们也建立了以功能基因片段为分子标签的分析方法。 常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于DNA 指纹图谱的分析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量的荧光定量PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的结构差异。最常用的DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和末端片段长度多态性（Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）等。 不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法， 对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的16S r RNA 基因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法，已被多次应用于人体肠道菌群的多样性分析，并获得了在物种检测深度和物种鉴定水平上均远远优于DNA 指纹图谱技术的结果 肠道菌群与健康相关研究中的应用
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
大肠菌群测定方法
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。证
大肠菌群检测方法
大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。 2．关灯后0?5小时后放可进入。 3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液 7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中） 11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样 12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面） 13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。 14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
食品中大肠菌群的测定附mpn检索表)
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
FDA大肠菌群和大肠杆菌检测方法
大肠菌群的定义 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠杆菌的定义 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。 卫生学意义 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。 大肠杆菌的生物学特性 基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。 大肠菌群及大肠杆菌测定 ——MPN法检验流程（FDA BAM） 1、检样50g+450ml稀释液 2、适当十倍稀释样品 3、选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL。在35℃下，培养24 ± 2h ~48 ± 2h。 4、（1）没有产气管→报告阴性 （2）有产气管：①接种BGLB肉汤管→查MPN表报告结果（大肠菌群） ②接种EC肉汤→在44.5±0.5 ℃ （水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h。 →产气管接种EMB平板（35℃、18~24h），从EMB平板上挑取5个可疑菌 转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气 →查MPN表报告结果（大肠菌群）。 大肠菌群测定——MPN法检验几点说明 MPN检索表： MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
肠道菌群和免疫的关系
肠道菌群对动物免疫的影响及机理 在动物体内环境中通常有一层微生物或微生物层，在正常情况下即动物处于健康状态时，并未表现异常或致病现象，称这一层微生物为正常菌群或固有菌群和原籍菌群。这些菌群是动物机体内环境中不可缺少的组成部分，对动物宿主是有益无害的。肠道菌群形成一个庞大而复杂的微生态系统，有重要的生理意义。包括抵御病原体侵袭、刺激机体免疫器官的成熟、激活免疫系统及参与合 成多种维生素、调节物质代谢等作用。 1、菌群屏障作用 动物的先天性或非特异性免疫应答，亦即机体免疫系统识别和排除各种异物，主要依靠机体的屏障作用，包括正常菌群、机体的皮肤黏膜、补体等体液因子抑菌、杀菌、溶菌等作用、吞噬细胞的吞噬作用等。从现代的研究不难看出，正常菌群在机体的屏障作用中是极为重要的一个方面。 2、影响黏膜免疫 研究发现双歧杆菌抑制其他肠道菌的效果与诱生一种抗菌物质——分泌型球蛋白（SIgA）有关。有人研究证明乳酸杆菌粘附形成的空间占位，是防止其他菌对组织附着的一个重要的保护性机制。嗜酸性乳杆菌可以在肠黏膜免疫中发挥重要的免疫监视功能。口服干酪乳杆菌能增强宿主的黏膜的免疫反应，促进肠道分泌免疫球蛋白(SIgA)，即使饲喂低剂量的干酪乳杆菌也能引起SIgA的分泌。 3、促进免疫器官的生长发育 益生菌能促进机体的免疫器官的生长发育、成熟，增加T、B淋巴细胞的数量，胸腺淋巴细胞免疫球蛋白含量增多，启动免疫应答。有关研究表明，实验组免疫器官内的淋巴密度密集，数量增多以及浆细胞的数量增多，中枢免疫器官的
淋巴细胞和上皮网状细胞数量增多，这标志免疫器官内部淋巴细胞的发育情况和免疫功能的成熟程度，从而向外周免疫器官脾脏、盲肠扁桃体以及全身各处免疫组织源源不断的输送T、B淋巴细胞。 4、激活免疫因子 益生菌能明显的激活巨噬细胞活性及细胞因子介导素的分泌，增强免疫功能，提高宿主的抗病能力。这些因子在某些情况下，可以代替免疫调节剂，因为它们不仅能刺激造血活性，而且也能增强成熟细胞的功能，细菌细胞表面结合的细胞因子对细菌调节机体一系列免疫反应是非常重要的。 5、干预细胞免疫 干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌可激活巨噬细胞功能，刺激产生免疫应答。还通过巨噬细胞和T细胞、NK细胞活性的增强来增强人体的免疫；巨噬细胞、NK细胞、T细胞的活化，有益于增强周围血管和局部淋巴结中淋巴细胞的免疫，T辅助细胞、NK细胞的增加，可使抑制性T细胞减少。乳酸菌能干预细胞免疫。乳酸菌、双歧杆菌能阻断许多微生物的入侵和粘附（位组抑制）。 6、和疫苗混合使用提高抗体水平 有研究表明，在ND疫苗接种前后饲用益生素，可提高鸡血清中抗NDV血凝抑制抗菌体，延长抗体的高峰期。 7、具有免疫佐剂活性 Himanen等（1993）研究枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸（LTA）和肽聚糖磷壁酸复合物的生物活性时，发现两者均具有很强的免疫佐剂活性作用。地衣芽孢杆菌的免疫促进作用是机体经口服芽孢杆菌后，在肠道淋巴组织集合的抗原结合位点上直接作为免疫佐剂，或者通过调整宿主体内的微生物群，尤其是双歧杆菌菌群起主导作用，间接的发挥免疫佐剂的作用，提高机体的局部或全身防御功能。
大肠菌群检测方法(中文翻译)
大肠菌群检测方法(中文翻译)
3 定义和简介 3.1 定义 所有的大肠菌群均是发酵乳糖，革兰氏阴性，无牙孢的杆菌。官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度（30、32、35、37）不同作评价；或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其他官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。 鉴于这些定义的不同，建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。 ●国际标准：样品分析是否符合国际交易规范 ●官方主市场调整定义：样品分析是否符合地方标准 ●一般定义：样品分析是否符合一般规范。 任何必要方法的调改必须通过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。 以下为一些官方定义例子： *ISO 4831大肠菌群是通过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义*AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气（T=32或35度）革兰氏阴性杆菌 *ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃) 3．1．1 液体培养基中 ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。（T=32或35℃） 由LI第一章概述，大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。 3．1．2 固体培养基中 IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气 由LI第二章概述，大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。 3．2 简注 BGLB：亮绿乳糖胆盐培养基肉汤 LST：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 MPN：最可能数 VRBL：紫红胆汁琼脂 4 安全防范 大肠菌群不表现为无害，注意实验室的良好操作。 5 参考资料 5．1 LIs中提到的及其它心要文件 LI-00．700 LI-00．702
大肠杆菌和大肠菌群计数方法
大肠杆菌和大肠菌群计数方法 Enumeration of Escherichia coli and the coliform 章节内容： ?传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法 ?LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌 （除双壳类软体动物制品外） ?瓶装水检测方法 ?贝类和贝类肉制品检测方法 ?柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法 ?大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法 ?参考文件 大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。 大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。 1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。与已知的非产气致病菌容易区别开来。 因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。 虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5℃进行，其他所有食品都在45.5℃进行。粪大肠菌群包含绝大部执蟪Ω司? 克雷伯氏菌也作为粪大肠菌群,但克雷伯氏菌的检出被认为与粪便污染并无关系。因此,大肠杆菌又被作为一个重要指标。快速鉴定大肠杆菌的新方法采用，使检测大肠杆菌相对容易了。
大肠菌群测定方法
大肠菌群测定方法 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工 作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MP N表，报告每100ml（g）大肠菌群的M PN值。 具体操作参见《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48± 2h，观察是否产气。证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》三、说明：
游泳池水中大肠菌群检验方法
游泳池水中大肠菌群检验方法 一、大肠菌群多管发酵法测定 1定义 大肠菌群（coliform bacteria）系指一群在36±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2 仪器 见《公共场茶具的大肠菌群测定方法》。 3培养基和试剂 3.1乳糖蛋白胨培养液 3.1.1成分：蛋白胨 10g 牛肉膏 2g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液 1mL 蒸馏水 1000mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。 3.1.2配法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH到]7.2～7.4。再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有倒管的试管中，115℃高压灭菌15min。 3.2伊红美兰琼脂 见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。 3.3革兰氏染色液 风《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。 3.4染色法 见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。 4推测性试验 4.1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。 4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10ml。 4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。 4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。 5证实试验 5.1平板分离 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置 36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5.2复发酵试验 挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于 36±1℃培养箱中，培养24h。 5.3凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的最大可能数（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。
大肠菌群和大肠杆菌检测方法
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 Method for examination of coliform，fecal coliform and escherichia coli in food for export SN 0169—92 代替ZB X09 002—86 1 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2 设备和材料 2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。 2 2 水浴箱：44.5±0.5℃。 2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。 2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。 2.5 均质器。 2.6乳钵和研棒。 2.7 平皿：直径90mm。 2.8天平：感量0.1g。 2.9 显微镜。 2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11 玻璃珠：直径约5mm。 2.12菌落计数器。 3 培养基及试剂 3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(LST)肉汤。 3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3 EC肉汤。 3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5营养琼脂斜面。 3.6 色氨酸肉汤。 3.7 MR-VP培养基。 3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11 生理盐水。 3.12 革兰氏染色液。 3.13 Kovacs氏靛基质试剂。 3.14 甲基红指示剂。 3.15 V oges—pros kauer(V—P)试剂。 4 样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2—5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。 4.2 不同食品样品匀液的制备 4.2.1 液体食品 以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s 内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
肠道菌群小知识
1代谢作用 ? 提供热量 ? 生产短链脂肪酸 ? 合成维生素K 和叶酸 ? 胆汁酸的分泌 ? 参与药物代谢 2. 免疫效果：正常菌群能刺激宿主产生免疫及清除功能 ? 刺激免疫球蛋白A （IgA ）的生产 ? 促进抗炎细胞因子的分泌和下调促炎细胞 因子 ? 诱导调节性T 细胞 3. 预防病原体入侵：正常菌群在人体某一特定位粘附，定植和繁殖，形成一层菌膜屏障。通过菌群间存在的生物拮抗作用，抑制并排斥病原体的入侵和群集，调整人体与微生物之间的平衡状态 人类肠道菌群 什么是肠道菌群？ 人的肠道内寄居着种类繁多的微生物，这些微生物称为肠道菌群。肠道菌群按一定的比例组合，各种菌间互相制约，互相依存，它们与宿主存在着共生关系，共同维护着宿主的生理平衡。 肠道菌群并非是生来就有的，当胎儿还在母体子宫内时，胎儿所处的环境几乎是无菌的，因此胎儿肠道内是无菌的，婴儿出生时迅速暴露在母体阴道或皮肤的微生物下，随着从婴儿到老年的发展变化，我们的肠道菌群在出生后几个月迅速增多，多样性增加，到成年后达到稳定状态，之后老年时期多样性渐渐减少[1]。这些微 小的生物群体就这样不知不觉伴随着我们的一生。 肠道菌群的数量和分类 据推测，正常健康成人肠道菌群总数高达1×1014，种类超过1000种，而一个成年人自身的细胞数量约为 1×1013个，也就是说居住在我们肠道内的菌群数量是人体细胞总和的10倍。在胃和小肠中，细菌的种类相对较少。结肠中，每克肠道内容物存在1012个细菌细胞，细菌种类达300-1000种，而其中99%的细菌来自于其中30-40种[2]。 正常人肠道中包括四种主要的细菌门类：厚壁菌门Firmicutes （约50-75%，包括梭菌属），拟杆菌门Bacteroidetes （约10-50%，包括拟杆菌属、普氏菌属和卟啉单胞菌属），放线菌门Fusobacteria （约1-10%，包括双歧杆菌），变形菌门Proteobacteria （常常约少于1%，包括大肠杆菌），其中厚壁菌门和拟杆菌门是人类肠道菌群的主要组成部分。大多数细菌属于拟杆菌属、梭菌属、真杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、双歧杆菌属。其他属，如埃希氏菌属和乳杆菌属较少。拟杆菌属约占肠道中所有细菌的30%[2][3]。 我国科学家在健康年轻人体内观察到的9个属的细菌广泛存在，分别为厚壁菌门的考拉杆菌属、罗氏菌属、Blautia 、Faecalibacterium 、梭菌属、Subdoligranulum 、瘤胃球菌属和粪球菌属以及来自拟杆菌门的拟杆菌属。这9个属的细菌均具有在人体肠道内发酵产生短链脂肪酸的能力，而短链脂肪酸具有维持人体健康的多重作用，例如充当肠道上皮特殊营养和能量组分，保护肠道黏膜屏障，降低人体炎症水平和增强胃肠道运动机能等[4]。 Phylum Proportion （%） [3] 厚壁菌门Firmicutes 50-75% 拟杆菌门Bacteroidetes 10-50% 放线菌门Fusobacteria 1-10% 变形菌门Proteobacteria 少于1% 肠道菌群的作用 正常肠道菌群具有重要的自我平衡功能[5]。 肠型 未来某一天，当你走进医院的时候，医生可能不仅会询问你的过敏史、血型，还会问到你的肠型。 来自德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL ）的科学家们提出了这个概念——肠型，他们通过全球性实验国际人体肠道元基因组研究计划，发现以肠道内的细菌种类和数量划分，人类拥有三种肠型，研究人员把这3种肠型命名为拟杆菌型（Bacteroides ）（肠型Ⅰ）、普雷沃氏菌型（Prevotella ）（肠型Ⅱ）和瘤胃球菌型（Ruminococcus ）（肠型Ⅲ），以反映各生态系统中的优势菌。拟杆菌型系统中的细菌，主要从碳水化合物和蛋
大肠菌群检测方法中文翻译
大肠菌群检测方法 中文翻译
3 定义和简介 3.1 定义 所有的大肠菌群均是发酵乳糖，革兰氏阴性，无牙孢的杆菌。官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度（30、32、35、37）不同作评价；或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其它官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。 鉴于这些定义的不同，建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。 ●国际标准：样品分析是否符合国际交易规范 ●官方主市场调整定义：样品分析是否符合地方标准 ●一般定义：样品分析是否符合一般规范。 任何必要方法的调改必须经过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。 以下为一些官方定义例子： *ISO 4831大肠菌群是经过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义 *AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气（T=32或35度）革兰氏阴性杆菌 *ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃)
3．1．1 液体培养基中 ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。（T=32或35℃） 由LI第一章概述，大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。 3．1．2 固体培养基中 IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气 由LI第二章概述，大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。 3．2 简注 BGLB：亮绿乳糖胆盐培养基肉汤 LST：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 MPN：最可能数 VRBL：紫红胆汁琼脂 4 安全防范 大肠菌群不表现为无害，注意实验室的良好操作。 5 参考资料
大肠菌群的检测方法
1.原理 一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人、畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价产品的卫生质量，推断产品中有否有污染肠道致病菌的可能。 2.仪器及设备 2.1 恒温培养箱 2.2 玻璃平板或一次性无菌平板 2.3 多头滤器及配套设施 2.4 滤膜（0.45 um） 2.5 镊子 2.6 高压灭菌锅 2.7 牛皮纸, 棉绳，橡皮筋 2.8 冰箱 (2~8°C) 2.9 塑料瓶 2.10 酒精灯 2.11 三角瓶,橡皮塞 2.12 超净工作台 2.13 取样袋 2.14 75%酒精 2.15 无菌蒸馏水 3.培养基和试剂 3.1 培养基：大肠菌群显色培养基Chromogenic Coliform Agar medium( CCA medium) 制备：根据供应商提供的说明书，搅拌加热煮沸至完全溶解，不要高压蒸汽灭菌，不要过度加热。待培养基冷却至47±2℃，分装至平板，厚度为4mm。倒置冰箱保存。 3.2 氧化酶试纸 3.3 酵母浸膏培养基（无葡萄糖PCA）或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） 4.操作步骤: 4.1 过滤及培养 4.1.1灼烧过滤头除菌，使用无菌镊子将滤膜贴放于已冷却的过滤头上，安装滤杯。在CCA平板上 记录相关信息。
4.1.2 过滤前充分摇晃，混匀待测样品，将待测样品倒入滤杯中。 4.1.3 使用无菌镊子小心转移滤膜至CCA培养基，无菌操作。 4.1.4 将平板倒置于36±2℃培养21-24小时 4.2 结果判读 4.2.1分别计数不同类型的菌落，根据下表对菌落进行验证： （1）所有的紫罗兰色菌落均确认为大肠埃希氏菌，不需要进行氧化酶试验 （2）部分CCA平板上可能出现蓝绿色菌落，这部分菌落不应该记录为大肠菌群或大肠杆菌。 （3）对粉红色的菌落，证实试验是必须的。 4.3 验证试验 4.3.1 氧化酶试验 挑取至少10个菌落进行该试验( 如果总的粉红色菌落少于10个,则应挑取全部菌落进行试 验 ),可直接挑取CCA平板上的菌落进行氧化酶测试 ,但务必注意 ,粉红色菌落本身带有颜 色 ,浅红色或无色均被认为是阴性结果。紫红色才被认为是阳性结果。禁止使用铁质或镍铬 丝接种环。 4.4 分离纯化试验 4.4.1 TSA划线 如果由于菌落太小，或者菌落之间太近存在融合，则使用接种环小心挑取部分菌落，划线 接种在TSA培养基上。倒置于36±2℃培养22±2H，然后再挑取单菌落进行氧化酶试验。 5.结果报告 大肠菌群的结果=（紫罗兰色的菌落数+确认为大肠菌群的粉色菌落数）/ 过滤体积 单位报告为CFU/V mL 6.试验要求 参见《达能脉动盖检测计划表》BK-QFHSE-QI-QA-CL001 附件17
大肠菌群检测方法
一.检验范围 本标准适用于出口食品及其原料。 二.设备和材料 1.超净工作台：琼脂平板在工作台上暴露15min,每平板不得超过15个菌落。 2.恒温培养箱：36±1℃。 3.恒温水浴箱：45±1℃。 4.吸管：1mL、10mL，具0.1mL刻度。 5.稀释瓶：300 mL三角锥形瓶。 6.显微镜。 7.试管：150x150，18 x 180mm 三.培养基和试剂 1.月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 2.煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 3.8.5‰生理盐水 四.样品制备（以上述平板菌落制备的样品为测定大肠菌群的样品匀液） 五.大肠菌群的测定 1.大肠菌群MPN值的测定 （1）对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。1：10稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管10ml；1：100和1：1000稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管1ml。 （2）将接种管置于36±1℃培养48±2h。 （3）观察试管的产气情况：检查导管内是否有气泡产生，如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。 2. 大肠菌群的证实试验 （1）将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。 （2）置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。 （3）记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 （4）结果报告：按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品大肠菌群的MPN值。
注：1.本表采用3个稀释度1ml（g），0.1ml（g），0.01ml（g），每稀释度3管。 2.表内所列检样量如改用10 ml（g），1ml（g），0.1ml（g）时，表内数字应 相应降低10倍；如改用0.1ml（g），0.01ml（g），0.001ml（g）时，表内数字应相应增加10倍；其余可类推。
大肠菌群介绍与检测方法
大肠菌群介绍与检测方法 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法： 推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN