生物制品生产用动物细胞制备及检定规程

生物制品生产用动物细胞制备及检定规程Requirements for Preparation and Control of Animal Cell Substrates Used for Production of Biologics

本规程适用于生产和/或检定疫苗等生物制品的细胞培养，其中包括二倍体细胞、传代细胞和原始细胞培养。本规程对这些细胞的性质、质量及安全性检定提出了明确要求。

A 对各类细胞培养总的要求

1 细胞库的建立

来自人或动物的细胞，已经通过全面检定，并得到国家药品管理当局批准，方可用于生物制品生产及检定。

1.1原始细胞库

由一个原始细胞群体，发展成细胞系（株）或经过克隆培养而形成拘泥的细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产及检定。为了保证能持续使用而建立原始细胞库。目的是使得制品每一生产周期，都能提供一个已标定好的相同质量的细胞源。因此，在特定条件下由有一定数量、成分一致的细胞，按一定量均匀分装于安瓿，于液氮或-100℃以下冻存备用，即为原始细胞库。

1.2主细胞库（MCB）

取原始细胞种子，通过相应方式进行细胞传代，增殖一定数量细胞，将所有细胞均匀混合成一批，定量分装安瓿，保存于液氮或-100℃以下备用。这些细胞必须以其自身的特定质控要求进行全面检定，全部合格后即为主细胞库，为建立工作细胞库用。

1.3工作细胞库（WCB）

工作细胞库的细胞由主细胞库细胞传代扩增而来。主细胞库之细胞经传代增殖，达到一定代次水平的细胞，全部合并成一批均质细胞群体，再按要求的细胞数量分装安瓿，保存于液氮或-100℃以下备用。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批产品。此时传代的水平必须在该细胞用于生产限制最高代次之。工作细胞库细胞，必须按该细胞的检定要求，逐项进行全面检定，合格后方可用于生产。

1.4生产用细胞培养

取出冻存的工作细胞库中一个或多个安瓿，混合后培养，传递一定代次后供生产制品使用。

其代次不得超过对该细胞用于生产的最高限制代次。从工作细胞库取出的细胞种子增殖出来的细胞，不再回冻保存和再用于生产。

1.5体外培养细胞龄的计算

二倍体细胞龄以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即1瓶细胞传2瓶（1：2分种率）再长满瓶为一世代；1瓶传4瓶（1：4）为二

世代；1瓶传8瓶（1：8）则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3。

传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。依据每个细胞系的时间经验数据，确保细胞质量及安全，确定生产使用细胞最后限制代次。

有的原始细胞可以传少数几代（一般不应超过5代），尚可用于生产，但要以该细胞生长特性及对病毒繁殖敏感性不发生改变为基础。

2 生产管理

2.1 细胞生产质量管理

细胞培养操作必须按照GMP要求，防止污染。在生产区不能进行非生产用细胞微生物的操作，生产人员要定期检查身体。在同一工作日于操作细胞之前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。用于制品生产的培养物中不准加青霉素或β-酰胺（β-Lactam）抗生素。虽允许少量使用其他抗生素，但最好不使用任何抗生素。

2.2原材料的选择

各种类型细胞的供体材料均不应有任何外源因子污染。二倍体细胞的供体包括胎儿的父母应为无传染性疾病和严重的遗传病，也无不确定病因的疾病。

培养细胞用牛血清，来源地区应没有牛脑海绵体脑病的健康牛群，应检查无外源因子污染方可使用，应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中牛血清的有关规定。

消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明吴细菌、真菌、支原体和感染性病毒，特别是胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如牛、猪的细小病毒等。

3 细胞培养的检查

包括细胞种子、细胞库细胞的各项检查。

3.1 细胞培养用原材料检查

3.1.1 牛血清的检查

牛血清应从健康牛群中的小牛或胎牛中采集。生产单位对牛血清应进行细菌、真菌、支原体检查，按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》进行；病毒检查应特别重视牛腹泻病毒的检查；噬菌体检查应注意大肠杆菌噬菌体的检查。检查结束应能证明无任何外源或源因子污染。

3.1.2胰蛋白酶检查

消化分散细胞用胰蛋白酶应按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》检查细菌、真菌、支原体。生产厂家应对胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒（如牛和猪的细小病毒）进行检查。

3.2 细胞培养物的检查

3.2.1 细胞、真菌检查

细胞培养上清液样品，按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.2.2支原体检查

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》B项进行。

3.2.3病毒检查

应注意检查细胞株中有无细胞来源物种可能潜在感染的病毒，以及由于操作带来的外源性病毒。特别注意逆转录病毒的检查。

3.2.3.1细胞培养直接观察及红细胞吸附试验

去混合瓶细胞样品，接种小瓶，待细胞长成单层换维持液，观察两种，镜检细胞，应保持正常形态特征。培养至少14天，分别取1/3细胞培养瓶，用0.2%~0.5%豚鼠红细胞混合悬液做红细胞吸附试验，加入红细胞后先置于4~8℃，后置于20~25℃各30分钟，两次观察结果均应为阴性。新用红细胞在2~8℃保存不得超过7天，溶液中不应含有钙或镁离子。

3.2.3.2不同细胞传代培养检查

细胞培养上清液混合样品，至少接种3种细胞（猴源细胞、人源细胞和同种不同批细胞），接种样品量应占维持液的1/4以上，培养至少14天时，进行血吸试验（同A 3.2.3.1项）。培养7天的上清液接种于同种细胞培养，盲传一代，全部观察共14天，应物细胞病变，血吸试验应为阴性。

3.2.3.3动物和鸡胚检查

用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚（两组不同日龄）共计6组。每组动物或鸡胚接种待检细胞样品不应少于107细胞/ml。按表1所列方法进行试验和观察。如试验到期有80%以上动物或鸡胚健存，此试验成立，再经其他检测以确定结果。

①豚鼠注射前和观察4周做结核菌素试验应为阴性。

②每只家兔于皮注射10处，每处0.1ml。

③应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液做直接血凝检查。

3.2.3.4 逆转录病毒检查

（1）透射电镜检查。

（2）逆转录酶活性测定：采用敏感的方法（如PERT法）检测你转录酶活性。

3.3 致肿瘤性检查

某些传代细胞系已证明具有致肿瘤性者，可不必做致肿瘤性检查。而有的细胞系已证明在一定代次不具有致肿瘤性者，则需要进行致肿瘤性检查。对需要做致肿瘤性试验的细胞系，包括原始细胞库、主细胞库及工作细胞库细胞。被检查的细胞需要增殖达到或超过生产用体外细胞龄限制的传代水平。

可以采用体法检查，下述两法可任选其一。

3.3.1 无胸腺小鼠，至少10只，每只皮下或肌肉注射107细胞；设阳性对照细胞，用Hela 或Hep-2，注射106细胞；阴性对照细胞用二倍体细胞株。

3.3.2 乳鼠（3～5日龄）或8～10g小鼠6只，经过抗胸腺血清（ATS）处理，每只皮下接种107活细胞，设对照组如上。

3.3.3 结果观察：动物观察14天，检查有无结节或肿瘤形成。如有结节或可疑病灶，应观察至少1～2周，然后解剖做病理及组织学检查。未发生结节的动物半数观察21天，剖检；另外半数动物观察12周，进行病理检查，剖检接种部位。观察各淋巴结和各器官有无结节形成，如有怀疑，进行病理组织检查，不应有移植瘤形成。二倍体细胞观察21天，结果因为阴性。

3.4 细胞鉴别试验

新建细胞系或株、细胞库和生产结束时的细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞。可采用遗传特征、DNA指纹图谱、染色体标记、免疫学、HLA和生化法（如同功酶）测定，任选其中一种方法。有简便而能鉴别的方法亦可采用，但需经国家药品检定机构认可。

B 生物制品生产用人二倍体细胞株

人二倍体细胞株来源于正常人胎肺或其他组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。

1 细胞株的要求

用于疫苗生产的人二倍体细胞株须按下列要求进行全面检定。新建细胞株，应按《新生物制品审批办法》进行审批。

1.1 建立细胞株必须具备下列资料。

1.1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，终止妊娠原因。

1.1.2 建立细胞株所用的胎儿父母的年龄、职业及健康状况（经医生出具证明），胎儿父及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史。在取胎儿组织前，应作出详细调查，申报审批前，应对申诉背景资料进行一次重复调查。

1.1.3 原始组织种类，原始细胞培养的细胞数量与生长的状况。

1.1.4 细胞培养方法、历史、生长特征和寿命的世代数。

1.1.5 细胞生长液的成分。

1.2 细胞株的检定

1.2.1 染色体检查

1.2.1.1 新细胞株建株过程中，每8～12世代应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期连续培养过程中，至少有4次染色体检查结果。

每次染色体检查，应从同一世代不同培养瓶中取细胞混合再培养，自卑染色体标本片。染色体片应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。

每次染色体检查，至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并做出有助于复查的记录。其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析。并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。

可用G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。

1.2.1.2 控制标准

1000个和500个中期细胞标本中，检查异常率，合格的上限（可信限90%Poison法）如表2.

①亚二倍体如超过上限，可能因制片过程人为的丢失染色体，应选同批号标本重新计数。

②一个中期细胞超过53条染色体即为一个多倍体。

1.2.2 细菌、真菌、支原体及病毒检查

细胞株不应有细菌、真菌、支原体及病毒等污染。每8～12世代细胞培养物，应进行下列检查。

1.2.2.1 细菌、真菌检查

按本版规成通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

1.2.2.2 支原体检查

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》B项进行。

1.2.2.3 病毒检查

按A 3.2.3项进行。

二倍体细胞株传代过程中，至少对2个不同世代水平进行包涵体、乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒及艾滋病病毒进行检查和电镜检查等，结果均应为阴性。同时还要进行逆转录酶检查。

1.2.3 致肿瘤性检查

每8～12世代，做一次细胞株异种移植试验，观察细胞株有无致瘤性质，试验方法按A3.3项进行。结果应无致肿瘤性。

1.2.4 细胞株鉴别试验

按A3.4项进行。

2 生产用细胞的要求

2.1 细胞库的要求

用于生物制品生产的二倍体细胞株，不应有外源引资污染，细胞核学应属正常，对病毒敏感性好，有足够量的符合质量要求的细胞种子，并经国家药品管理当局批准。

2.1.1 原始细胞库

在细胞株传代过程的早期，应选适当世代水平（2～8世代）增殖出大量细胞，制成细胞悬液，分装安瓿置于液氮中或-100℃以下冻存，即为原始细胞库，供制备主细胞库用。

2.1.2 主细胞库

取原始细胞库之细胞，传代增殖到适当世代，有足够量细胞，按一定量分装安瓿，置于液氮中或-100℃以下冻存，供建工作细胞库用。

2.1.3 工作细胞库

取主细胞库之细胞，传代增殖到适当世代，累积足够量的细胞，均一混合，按一定量分装安瓿，置于液氮中或-100℃以下冻存，为生产备用。

2.2 细胞库的管理

2.2.1 每个细胞库的细胞安瓿应注明细胞株名、世代次、安瓿号、数量、冻存日期，并应记录放置位置、容器编号等。

2.2.2 冻存的种子细胞存活率应在90%以上。冻存后的细胞，至少作一次复培养并连续传代至衰老期，应在不同传代水平检查细胞生长情况。

2.2.3 对主细胞和工作细胞库的细胞，应进行全面检查。

2.3 细胞库细胞的检查

2.3.1 细菌、真菌、支原体和病毒检查

按A3.2项进行。

2.3.2 致肿瘤性检查

按A3.3项进行。

2.3.3 染色体检查

细胞库细胞复后，至少粗数500个分裂中期细胞染色体，计算多倍体，细数100个分裂中期细胞染色体，精确计算断裂率、结构异常发生率等，按B1.2.1.2项评价。染色体标本需永久保存。

2.3.4 细胞鉴别试验

按A3.4项进行。

2.4 生产过程细胞培养的检查

2.4.1 用于生产的细胞世代，应在细胞整个寿命的2/3世代以。

2.4.2 正常细胞外源因子检查

于接种病毒当天或在连续传代种毒的最后一次细胞接种病毒时，此批细胞留取2%～5%的细胞不接种病毒，换维持液作为正常细胞对照。与接种病毒细胞在相同条件下培养，观察2周。镜下观察应无异常改变，然后按A3.2.3.1项作血吸试验，结果应为阴性。

2.4.3 不同细胞传代培养检查

用作对照的细胞，在换维持液时，收取细胞培养上清液分别接种一株人源传代细胞、一株猴源传代细胞及另一株人二倍体细胞，接种样品量应占维持液量1/4以上，观察14天，按

A3.2.3.2项判定结果。

2.4.4 染色体检查

在生产用细胞世代水平或其后数代（至少10代以上），检查300个中期细胞，计数多倍体；作100个中期细胞染色体检查，核型应正常。

C 生物制品生产用传代细胞系

传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代转化而来，可悬浮培养或用载体培养，能大规模生产。这些细胞可无限传代，但到一定代次后，致瘤性会增强。所以对生产用传代细胞系应进行严格检查。

1 细胞系的历史及一般特征

1.1 历史

生物制品生产用任何一个细胞系均需得到国家药品管理当局的批准，并提供如下资料。

1.1.1 细胞系来源、供者的种属、年龄、性别和健康状况的描述。

1.1.2 细胞传代培养方法、生长特征、传代数，用于生产的最高限制代数，所用生长液以及传代史等描述。

1.1.3 初步确证实验以及可能存在的所有外源因子检查结果。

1.2 细胞的一般特性

1.2.1 细胞系的生长类型及形态学特征、细胞检定的特殊标志、遗传特征（如HLA、DNA 指纹图谱）。

1.2.2 提供细胞系用于预定目的的资料。

1.2.3 细胞系的生产用限制代次和超过该限制代次10代以上的生物学特征，要作出说明。

2 细胞库

2.1 细胞库的建立

一旦选定某一细胞系作为生物制品生产的细胞基质，即应建立细胞库为原始细胞库，以确

保在制品的持续生产期中，能充分供应质量均一的细胞。细胞需作进一步检定，以保证没有细胞的交叉污染及外源因子污染。该细胞库应得到国家药品管理当局批准，并按A1.2和A1.3要求建立主细胞库和工作细胞库。

2.2 细胞库的管理

主细胞库和工作细胞库都应详细记录细胞代次，安瓿的存放位置，识别标志，冻存日期及库存量；建立主细胞库和工作细胞库分别放置在生产区中相距教员的两处、多个容器存放，以防意外，避免细胞系丢失。非生产用细胞严格与生产用细胞分开存放。

2.3 细胞库细胞的检查

对主细胞库和工作细胞库细胞均应进行全面检查。

2.3.1 细胞库细胞的细菌、真菌和支原体检查

按A3.2.1和A3.2.2项进行。

2.3.2 特殊外源病毒检查

有些细胞系可根据其来源，检查可能造成污染的本种属动物携带的病毒。

2.3.2.1 小鼠、大鼠及地鼠抗体检测，检测啮齿类动物细胞系可能存在的特有病毒，可用杂交法、PCR法、单抗或电镜检测。

2.3.2.2 人源细胞系可用体外诊断试验检测病毒性抗原，如EB病毒、巨细胞病毒、乙型和丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等。常用方法有杂交法、PCR法、单抗检测和电镜检测。

2.3.3 逆转录病毒检查

按A3.2.3.4项进行。

2.3.4 致肿瘤性检查

按A3.3项进行。

2.3.5 细胞鉴别试验

按A3.4项进行。

2.4 生产中细胞培养的检查

2.4.1 用于生产的细胞代次

用于生产的传代细胞系，代次都有一定限制。用于生物制品生产的细胞最高限定代次，需经国家药品管理当局批准。细胞传代增殖到限定代次，停止细胞继续传代，用于接种病毒。

2.4.2 正常细胞对照的病毒检查

按A3.2.3.1项进行。

2.4.3 不同细胞传代培养检查

按A3.2.3.2进行。

2.4.4 细胞鉴别试验

按A3.4项进行。

D 生物制品生产用原代细胞

原代细胞来源，包括猴肾、鸡胚、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾和鹌鹑肾，以及其他组织等。原代细胞是用于正常组织，以适当的消化液分散细胞进行培养。原代细胞没有建立细胞库的可能，只能限于原始或少数几代使用，不能事先标定。由于这些与可传代细胞不同，应在管理和操作措施上规，以保证制品质量。

1 定义和术语

原代细胞培养是以适当的消化液消化正常动物组织以分散细胞，培养成单层细胞直接用于生产，只限于原始或少数几代（一般1～5代），用于生产的细胞以生物学性状不发生改变为原则。

细胞生长液：是供细胞生长繁殖的培养液，可含少量动物血清，多为小牛或胎牛血清。

细胞维持液：是供细胞维持正常新代的培养液，不含动物血清，只维持细胞正常生存，可满足病毒复制。

2 动物组织来源和其他材料

2.1 动物组织来源

动物必须健康。对各种动物都应有明确健康状况和洁净级别要求。严格控制种群饲养动物；应尽量使用无特定病原体动物；对拟用于生产的动物种群，应定期检查有无相关病毒抗体，应严格筛选。

2.2 猴群管理

多采用非洲绿猴、恒河猴等，我国以恒河猴为主。应为正常健康猴，以笼养或小群混养。动物用于制备细胞前，应有6周以上的检疫期，检疫期中出现病猴或混人新猴，应重新检疫。从外面新引入猴群应做结核菌素试验及猴疱疹Ⅰ型病毒（B病毒）的检查。

胎猴肾可用于生产，对其母猴应进行检疫。

2.3 地鼠等其他动物的管理

用于制备生产用细胞的动物均应在封闭式房舍饲养，应使用清洁级或SPF级动物，种鼠至少检疫三个月。种鼠和子代鼠都不应做过其他试验。

2.4 无特定病原体鸡群

用于制备鸡胚细胞的鸡蛋应来自无特定病原体（SPF）的鸡群。

3 原始细胞培养的检查

用于细胞制备的动物剖检应正常，取留的器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。

3.1 细胞培养原材料检查

细胞培养用牛血清、胰蛋白酶等原材料应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》要求。

3.2 细胞培养物的检查

3.2.1 细胞形态检查

细胞在接种病毒或用于生产前，培养无都应进行外观和镜下检查。应无任何可疑、异常和病变，否则不得用于生产。

3.2.2 细胞污染物检查

每批细胞培养留取5%～10%（至少留有500ml）悬液，不接种病毒，细胞浓度和处理均与生产制品过程相同，至少观察14天，并做下列各项检查，结果均应为阴性。

3.2.2.1 细菌、真菌检查

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。