蛋白质的实验

蛋白质的定量实验

一、凯氏定氮法

原理：样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

它适合于测定0.2-2.0mg的氮，具有测定准确度高、可测定各种不同形态样品的两大优点。

公式：蛋白质含量=蛋白氮X6.25（注:氮元素占蛋白质中组成百分比为16%,式子中的6.25是16%的倒数）

注意事项：

（1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各连接处，保证不漏气

（2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净

（3）小心加样，切勿使样品污染口部、颈部

（4）消化时，小心加入消化液，加样时最好将火力调小或者撤去。蒸馏时，切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。

（5）消化时，需斜放凯氏烧瓶（45℃左右）。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。

（6）蒸馏后应及时清洗定氮仪。

思考：

1.加入硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？

为了加速消化，加入硫酸铜做催化剂，硫酸钾或者硫酸钠可以提高溶液的沸点。此外，硒汞混合物或钼酸钠也可以作为催化剂，且可以缩短消化时间，双氧水也可加速反应。

2.凯氏定氮法的测定结果常常偏高，为什么？

凯氏定氮法测定的氮,包括蛋白质中的氮还有样品中其它的氮.所以测得结果高于样品蛋白质的实际含量

二、双缩脲法

（一）实验原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。由于氨基酸不出现此反应，故还可以用于检查蛋白质的水解程度。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

注意事项

（1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

思考题

（1）干扰因素？

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

（2）本法能否用于含不溶性蛋白质样品的测定？

三、考马斯亮蓝G-250法（Bradford）

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈棕红色，当它与蛋白质的疏水

区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0.01—1mg/ml），蛋白质－色

素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝G-250主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合物在2--5min内即呈最大光

吸收，颜色在1h内保持稳定。该反应具有简便快速、灵敏度高和干扰物质少等特点。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色

变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干

扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等.

注意事项

（1）在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

（2）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

四、Folin试剂法

原理

Folin试剂法又称为Lowry法，包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质-铜络合物；第二

步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝与磷钨蓝混合物），颜色深浅和蛋白质含量成正比。此法操作简单，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5—100ug蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和

半胱氨酸引起，因此样品中含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸等含量不同

使显色强度稍有不同。

[注意事项]

1.酚试剂在酸性条件下较稳定，而反应是在碱性条件下与蛋白质相互作用，所以当加入酚试剂后，应迅速摇匀（加一管

摇一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

2.本法也用于有力酪氨酸和色氨酸的测定。

五、BCA法

原理：BCA是由含二价铜离子的硫酸铜等与其他试剂组成的混合试剂，其工作液呈苹果绿色。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿变成紫色，最大光吸收强

度与蛋白质浓度成正比。

优点：

（1）操作简单，快速，45min内完成测定，比经典的Folin试剂法快4倍且更加方便。

（2）准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20—200ug/mL，微量BCA测定范围在0.5—10ug/ml。

（3）经济实用，除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量。

（4）抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂、尿素等均无影响。

缺点：反应时间长且蛋白质也会发生不可逆的变性。

六、紫外吸收法

原理:由于蛋白质分子中存在着共轭双键的酪氨酸和色氨酸残基，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，且吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度值与其浓度成正比关系，可做定量测定。

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。

缺点：

①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差；

②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。