病原物地分离与培养

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:

1.有关器皿的灭菌和消毒；

2.制作培养基；

3.病原菌的分离

4.病原菌的培养。

－、灭菌与消毒

灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一) 热力灭菌

热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在

升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱停止加温；电烘箱温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

2 湿热灭菌

(1) 高压蒸汽灭菌此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅，0.1MPa，121℃保持15～30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。

(2) 常压蒸汽灭菌在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。

常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器，每天加热100℃，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。

(二) 过滤除菌

许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：

(1) 蔡氏过滤器该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特

制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。

(2) 微孔滤膜过滤器这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将

病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：

①组装、灭菌将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。

②压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。

提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。

(三) 辐射灭菌紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的

交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。

注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。

此外，采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。

(四) 化学药品灭菌

化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进

行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。

植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液(来尔)、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可

少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物

制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。

附: 高压灭菌

1、目的要求

学习灭菌与消毒的基本原理及应用围，学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

2、基本原理

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅的冷空气从排气阀中排尽后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，锅冷空气的排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况

而有所改变。例如含糖培养基用0.06 MPa、112℃灭菌15 min，但为了保证效果，可将其他成分先行121℃灭菌20 min，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管的培养基以0.1MPa，121℃灭菌20 min；即可，而盛于大瓶的培养基最好以0.1MPa、122℃灭菌30 min。

实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提式两种。其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例，介绍其使用方法。全自动高压蒸汽灭菌锅在设定好有关的参数后，加温、放气、灭菌、干燥可一次完成，使用方法可参照厂家说明书。

3、材料、试剂与仪器

材料马铃薯葡萄糖培养基 (PDA)。

仪器与用具培养皿、手提式高压蒸汽灭菌锅、可调式电炉等。

4、操作步骤

(1) 首先将层锅取出，向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

提示：切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

(2) 放回层锅，并装入待灭菌物品。

提示：注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

(3) 加盖并将盖上的排气软管插入层锅的排气槽。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

(4) 用电炉加热并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅压力升到所需压力时，调节电炉控温旋钮，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa l21.5℃，20 min灭菌。

提示：灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此，锅冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。

(5) 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

提示:压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀开盖取物。否则会因锅压力突然下降，使容器的培养基由于外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

(6) 将取出的灭菌培养基放入25℃温箱培养48 h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

二、培养基的制作

1、目的要求

了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。

2、基本原理

在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH围才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。

培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂。琼脂(agar) 起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。

根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。

在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。

3、材料、试剂与仪器

材料马铃薯。

试剂葡萄糖、琼脂等。

仪器与用品高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。

4、操作步骤

PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基) 马铃薯（去皮）200 g 、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml ，自然pH。

在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。

(1) 称量称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g。

提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。

(2) 将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。

(3) 将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。

提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

(4) 加入葡萄糖葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培养基的锅用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。

(5) 分装根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管或三角瓶。分装试管，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。