免疫组化操作步骤(自编)

免疫组化操作步骤

一免疫组化（ LP 法）操作步骤：

1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2. 缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）

6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）

8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。

10 ．缓冲液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。

（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）

12 ．缓冲液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）

14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。

二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：

（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液， 37 ℃孵育 1-2 小时或 4 ℃过夜。

（ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

（ 6 ）、滴加适量生物素标记二抗工作液， 37 ℃孵育 10-30 分钟。

（ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

（ 8 ）、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液， 37 ℃孵育10-30 分钟。

（ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

（ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）

（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：

冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫组化三、免疫组化方法中关键环节及其原理解述

（一）酶免疫组化的环

1、本固定：固定的目的是①防止本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗结合的类脂，使抗原抗结合物易获得良好的染色结果；③固定的本易保存。

2、脱水、石蜡包埋和片：脱水用梯度乙醇（由低到）充分脱水、对组织完全浸蜡、切片时刀片干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。

3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由到低）。若脱蜡和水化不全易出局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4、抗原修复：由组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具的可以查阅相资料，大量的：中性的、pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只你觉得修复液的温度达室温即可）。

5、细胞通透：目的是使抗能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；用配，配好后4度避光保存。不过，在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。

7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10-30min。

8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重，包括孵育时间和抗浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗浓度有，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具条件还摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具时间需摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

9、抗稀释液：其实许多实验室抗稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗稀释液中除PBS份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗的多次回收利用较好。正为这种原，我一直用国产的专用抗稀释液，一段时间在更换新抗稀释液时实验结果出了阴性结果（提可能一抗没有结合），最后从抗浓度和孵育时间、封闭时间等原排除后，发是新抗稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗反应不佳，终而出假阴性结果。

10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH 和离子强度的使用和求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗稀释液偏酸，结果背景

（中性及弱硷性条件（PH7-8）一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。

有利免疫复合物的形，而酸性条件则有利分解；低离子强度有利免疫复合物的形，而离子强度则有利分解）

11、DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，由显微镜下控显色时间，到出特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出很深的棕褐色，这很可能说明你的抗浓度过或抗孵育时间过长，需下调抗浓度或缩短你的抗孵育时间；此外，若很短时间就出背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出阳性染色，一方面可能说明你的抗浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

12、复染：目的是形细胞轮廓，从而更好地对目蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间看当时的室温、溶液的新旧、目抗原的定位等情，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置苏木素中染色即可。

盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置盐酸酒精中数秒（一定动作快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，

接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液时为止；当发液接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

（二）免疫荧光方法中的重环

1、冰冻切片备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其较长时间保存的白片，一定及时固定和适当保存。

3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。

4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重，包括孵育时间和抗浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗浓度有，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具条件还摸索。

5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具时间需摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还摸索浓度，切记避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需注意配时小包装和并进行适当的离心。

6、复染：目的是形细胞轮廓，从而更好地对目蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。

7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液时为止；当发液接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗

孵育后的清洗均为5次*5min。注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利免疫复合物的形，而酸性条件则有利分解；低离子强度有利免疫复合物的形，而离子强度则有利分解

9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书求进行操作，不

随意改变序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，本应集中检查，以省时间，保光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。闭汞灯至少在开启15-30分钟后；本染色后立即观察，时间久了荧光会逐渐减弱。若将本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

四.免疫组化常见问题的处理

当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色

①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

弱阳性

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：

①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。

非特异性染色

①是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：

灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于

25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。

②是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。

③所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

④一抗的使用浓度是否过高。

⑤清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。

⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。

⑦标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。

⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

免疫组化和western blot验证蛋白质上有什么区别？

要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

单克隆与多克隆抗体的区别：

这首先要从抗体的产生来探讨。把某一抗原免疫某种动物而得到单抗或多抗。如果用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细胞，则得到单克隆抗体，如果用动物的血清，则得到多克隆抗体。但从理论上说，这些抗体都应针对抗原来自的动物，例如如果用人蛋白抗原免疫小鼠，则这些抗体为鼠抗人。由于一个大蛋白分子表面具有多种抗原决定簇，因此，免疫动物后，这些不同的决定簇分别诱导动物产生不同的抗体，每种抗体的特异性不同。单抗是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的，所以只针对蛋白抗原的单一抗原决定簇，而多抗是有多个不同克隆的B细胞产生的，是多种细胞的混合物，但其中的每一种抗体也只是针对一种决定簇。多抗混合物中的每一抗体与蛋白抗原结合的能力是不同的，因此用多抗做实验与用单抗可有其优势，那就是能确保抗体与抗原结合从而显示抗原信息。但也有其缺点，那就是交叉反应，往往造成假阳性。从理论上说，用人抗原诱导产生的抗体应只能用于人类，但由于动物种属之间，特别是相近的动物之间，如人与猩猩，大鼠与小鼠存在着同源性，导致抗体的交叉反应，即用一种动物抗原诱导产生的抗体也可与其它一些动物的抗原反应。一般在商品化的产品说明书上都有说明。由于单抗只针对单一抗原决定簇，因此，其能导致的交叉反应很少，而多抗是混合物，导致的交叉反应就多一些。但并不是向你所认为的那样，多抗可与所有种属动物反应。在选择抗体时，如果你标本来源于人，当然应选用如鼠抗人或兔抗人等。如果抗体来源确实不清，那应该先预实验。选择已知阳性标本，在充分设置阴性对照的前提下，用此抗体染色，看能否显示阳性结果。