细菌的生理生化实验

1 目的

1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理

1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法

2 原理

各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。

3 材料

3.1 菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌

（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种

3.2 培养基

葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）

3.3 试剂

40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。

3.4 器具

超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。

4 流程

糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验

5 步骤

(一) 糖类发酵试验

1 目的

了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法．

2 原理

可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌

种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。

3 材料

3.2菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌

（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种

3.３培养基

葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管

４流程

发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录

5 步骤

5.1 试管标记图9-1 糖发酵产气

取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气

4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。

5.2 接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图9-1），置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h

观察结果。

5.3 观察记录

与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。（二）乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)

1 目的

了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法．

2 原理

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

3 材料

3.1 菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌

（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种

3.2 培养基

葡萄糖蛋白胨培养液的试管

４流程

培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录

5 步骤

5.1 标记试管

取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。

5.2 接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。

5.3 观察记录

取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加

入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。

注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。

（三）甲基红试验（M.R.试验）

1 目的

了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法．2 原理

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

3 材料

3.1 菌种

同V．P试验

3.2 培养基

同V．P试验

4 流程

培养液→指示剂→观察→记录结果

5 步骤

于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。

（四）吲哚试验

1 目的

掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法

2 原理

有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。

3 材料

3.1菌种

测试菌株．

3.2培养基

蛋白胨水培养基

3.3试剂

二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。

4流程

标记试管→接种→培养→观察→记录

5步骤

5.1 试管标记

取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、

普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。

5.2 接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。

5.3 观察记录

在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。

6 结果

记录生理生化反应测定结果．

细菌的生理生化实验

实验目的

巩固微生物无菌接种技术;

了解细菌鉴定中常用的生理生化实验的原理和方法

微生物的生理生化反应

微生物细胞在酶的催化下进行各种各样的生理生化反应

把微生物细胞在一定的条件下培养,通过观察生理现象和检查代谢产物,可以了解微生物的代谢过程和代谢的特点

由于不同的微生物可能具有不同的酶,代谢途径和代谢产物可能也有不同,生理生化反应是微生物分类鉴定的重要指标之一.

淀粉水解实验

淀粉培养基

+

淀粉培养基

+

接种

+

变色圈,水解圈

培养24h

加卢哥氏碘液

I-KI

结果:

有水解圈—淀粉水解实验阳性,用+ 表示;

无水解圈—淀粉水解实验阴性,用- 表示;

糖发酵实验

原理:

丙酮酸裂解生成乙酰CoA与甲酸,甲酸在酸性条件下在甲酸氢解酶作用下可进一步裂解生成H2和CO2——产酸产气

缺少甲酸氢解酶——产酸不产气

步骤:配制糖发酵培养基——接种——培养(约24h)——观察结果

结果:

紫色无气泡,既不产酸也不产气用- 表示;

黄色无气泡,产酸不产气,用+ 表示;

黄色且有气泡,产酸产气,用0 表示.

甲基红实验(M.R实验)

原理

微生物进行混合酸发酵,产生各种有机酸——pH下降——加入指示剂甲基红——红色

步骤:配制蛋白胨水培养基——接种——培养(约24h) ——加入指示剂甲基红1~2滴——观察结果

结果:

红色——M.R实验阳性,用+ 表示;

不变色——M.R实验阴性,用- 表示;

V.P实验

V.P实验

步骤:配制蛋白胨水培养基——接种——培养(约24h) ——5~10d 40%KOH, 5~10d 5%a-奈酚和少量肌醇,取出塞子,用力震荡,保温(37度15~30min)——观察结果

结果:

红色——V.P实验阳性,用+ 表示;

不变色——V.P实验阴性,用- 表示.

实验内容

以组为单位进行淀粉水解实验,糖发酵实验, V.P实验和M.R实验.

实验菌种:

淀粉水解实验,糖发酵实验:大肠杆菌,苏云金芽孢杆菌

V.P实验和M.R实验:大肠杆菌,产气杆菌

注意事项:

实验报告:

1,列表记录实验结果

2,思考题:第4小题

四大类细胞型微生物菌落的鉴定

初步鉴定

确证:显微镜观察

微生物菌落特征的记录和描述

菌落形态:形状,边缘情况

大小:

表面状况:湿润,粘稠或干燥,隆起或扁平,厚或薄,是否粉末状

质地:致密或疏松

蔓延程度:

与培养基结合程度

颜色(正面,反面,边沿,中心)

气味

示例

将菌株在查氏琼脂平板上25 ℃培养7d 后菌落直径18~19mm , 圆形,边缘齐整不蔓延,表面丝绒状并具放射状沟纹,较厚,中央稍凸起,,菌丝

初为浅黄褐色近于淡粉红色,老后颜色变深,有黄色渗出液,背面呈黄褐色.